小鼠嚴重顱腦撞擊傷早期咪唑安定－氯胺酮對肝臟GR與海馬NR1變化的影響＊

屈 強，史 忠，粟永萍△

（1.瀘州醫學院附屬醫院麻醉科，四川646000；2.第三軍醫大學全軍復合傷研究所，重慶400038）

近年來文獻報道嚴重創傷后機體糖皮質激素受體（glucocorticoid receptors，GR）與創傷后應激反應紊亂的發生、繼發性全身損害密切相關，而N－甲基－D－天門冬氨酸受體（N－Methyl－D－Asparate receptor，NR）在糖皮質激素抵抗（glucocorticoid resistant，GCR）的發生、發展中可能具有重要作用。有研究觀察到使用NR拮抗劑氯胺酮等可明顯抑制小鼠嚴重燒傷模型中GR的下調［1］，其機制不清。而NR拮抗劑和咪唑安定等苯二氮卓受體（GABA）激動劑已被大量研究證實具有腦保護作用。NR功能亞單位1（NR1）具有NR的電生理和藥理學特性。因此如果能夠從NR1入手，進一步研究GCR在應激中變化的中樞機制，并設法進行調控，將有可能為揭示嚴重創傷后應激反應紊亂以及防治嚴重繼發性全身損害的發生提供重要的理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1創傷模型制作及分組 取雄性KM小鼠150只（第三軍醫大學實驗動物中心提供），體質量為22～26g，用BIM－Ⅲ型小型多功能動物撞擊機制作清醒小鼠閉合性嚴重顱腦損傷（TBI）模型［2］。將其隨機分為5組，每組30只。假致傷組（J組）不作撞擊，僅固定與其他組相似時間；致傷對照組（N組）于致傷后10～15min腹腔注射0.9%生理鹽水0.01mL/g；致傷后氯胺酮治療組（K組）于致傷后10～15min腹腔注射氯胺酮（上海市第一制藥廠生產）10mg/kg，即注射0.01%氯胺酮藥液0.01mL/g；致傷后咪唑安定治療組（M組）于致傷后10～15min腹腔注射咪唑安定（徐州恩華藥業生產）0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定藥液0.01mL/g；致傷后復合用藥治療組（F組）于致傷后10～15min腹腔注射氯胺酮10mg/kg和咪唑安定0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定及0.01%氯胺酮復合藥液0.01mL/g。

1.2標本采集 各組均于致傷后30min及2、8、24、48、72h各斷頭處死5只小鼠，經頸動脈收集血液分離血清，用孔徑0.22μm微孔濾器除菌后放置于－70℃冰箱保存。收集血液后，迅速取小鼠肝臟組織，冰上分離海馬，均置于液氮保存。小鼠肝臟、海馬組織各100mg分別加入1mL RIPA組織細胞裂解液（上海申能博彩生物有限公司生產），按說明書操作，提取肝臟總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度，置于－70℃冰箱備用。

1.3血清 TNF－α、IL－1β的測定 TNF－α、IL－1β均采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（晶美生物工程有限公司生產），操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4GR/NR1Western blot分析 每個樣本取40μg蛋白，加入等體積2×SDS－PAGE上樣緩沖液，混合，99℃變性5min后冰浴，微量加樣器上樣。經6%聚丙烯酰胺100v恒壓電泳后，80mA電轉印至PVDF膜（過夜），5%牛奶蛋白37℃封閉3h，加入1∶400稀釋GR/NR1一抗（兔抗小鼠GR/NR1，Santa cruz美國）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入單過氧化酶標記二抗（山羊抗兔IgG，博士德）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入DAB顯色，采用Geldoc2000凝膠成像系統（Bio－Rad公司 美國）成像和分析處理，蛋白含量以ODu×面積表示。

1.5統計學方法 所有數據均以s表示，用SPSS10.0統計軟件處理，組間比較采用配對樣本t檢驗，組內采用單因素方差分析，以P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組血清中TNF－α含量測定結果 各組TNF－α含量于致傷后30min均明顯增高（P＜0.01），8h達高峰（P＜0.01）；J組明顯低于其他各組（P＜0.01）；N組明顯高于其他各組（P＜0.01），但24h后各組間差異逐漸縮??；F組在傷后8h明顯低于其他各組（P＜0.01），48h明顯低于 K組（P＜0.01），見表1。

2.2各組血清中IL－1β含量測定結果 各組IL－1β含量于致傷后30min均明顯增高（P＜0.01），24h達高峰（P＜0.01）；J組明顯低于其他各組（P＜0.01）；2h后N組明顯高于其他組（P＜0.01）；F組在傷后8h明顯低于其他各組（P＜0.01）；但24h后各組間差異逐漸縮小，見表2。

表1 各組血清中TNF－α含量測定結果（ng/mL，s，n＝5）

表1 各組血清中TNF－α含量測定結果（ng/mL，s，n＝5）

＊：與J組比較，P＜0.01；＃：與N組比較，P＜0.05；＆：與F組比較，P＜0.01。－：表示無數據。

30min 2h 8h 24h 48h J組組別0.14±0.058 0.01±0.008 － － －N 組 17.14±2.329＊ 13.48±1.177＊ 32.98±3.155 23.03±1.254 14.14±4.460 F組 15.06±0.470＊＃ 10.55±0.890＊＃ 25.24±1.632＃ 21.87±1.717 12.6±1.036＃K 組 16.86±1.952＊ 11.65±0.986＊＃ 28.09±2.662＃＆ 22.82±1.359 14.78±4.600 ＆M 組 17.26±1.743＊ 11.99±1.291＊＃ 30.57±2.725＃＆22.49±1.490 13.92±2.498

表2 各組血清中IL－1β含量測定結果（ng/mL，s，n＝5）

表2 各組血清中IL－1β含量測定結果（ng/mL，s，n＝5）

＊：與J組比較，P＜0.01；＃：與N組比較，P＜0.05；＆：與F組比較，P＜0.01。－：表示無數據。

30min 2h 8h 24h 48h J組組別0.012±0.0019 0.007±0.0026 0.003±0.0014 － －N 組 0.131±0.0063＊ 0.111±0.0064＊ 0.085±0.0151＊ 0.204±0.0177 0.138±0.0201 F組 0.130±0.0058＊ 0.081±0.0054＊＃ 0.070±0.0091＊＃ 0.176±0.0151＃ 0.120±0.0070＃K組 0.132±0.0057＊ 0.093±0.0063＊＃ 0.082±0.0120＊＆ 0.180±0.0109＃ 0.128±0.0161 M 組 0.130±0.0058＊ 0.099±0.0123＊＃ 0.077±0.0060＊＆ 0.201±0.0138 ＆0.130±0.048

表3 致傷后各組肝臟GR蛋白表達結果（s，n＝5）

表3 致傷后各組肝臟GR蛋白表達結果（s，n＝5）

＊：與N組比較，P＜0.01；＃：與F組比較，P＜0.01；＆：與 M組比較，P＜0.01。

致傷后IOD與J組IOD的比值組別30min 2h 8h 24h 48h 72h N 組 0.737±0.098 0.414±0.217 0.452±0.214 0.468±0.263 0.566±0.046 0.509±0.103＆F組 0.842±0.096＊ 0.545±0.143＊ 0.681±0.118＊ 0.657±0.198＊ 0.673±0.242＊ 0.581±0.188＊＆K組 0.782±0.153＊ 0.503±0.158＊ 0.564±0.140＊＃ 0.594±0.243＊ 0.554±0.166 0.579±0.183＊＆M 組 0.764±0.164＃ 0.515±0.221＊ 0.583±0.207＊＃ 0.479±0.125＃ 0.512±0.212＃ 0.425±0.222＊

表4 N組和F組海馬NR1蛋白表達結果（s，n＝5）

表4 N組和F組海馬NR1蛋白表達結果（s，n＝5）

＊：與N組比較，P＜0.01。

致傷后IOD與J組IOD的比值組別0.135 1.055±0.204 1.137±0.154 F組 0.975±0.032 0.886±0.231＊ 0.882±0.129 1.015±0.141＊ 1.047±0.100 0.990±0.189 30min 2h 8h 24h 48h 72h N 組 0.964±0.104 0.807±0.127 0.858±0.171 0.922±＊

2.3致傷后各組肝臟GR蛋白表達 致傷后各組肝臟GR蛋白表達在致傷后30min開始均明顯降低（P＜0.01），2h達到最低（P＜0.01）；N組明顯低于其他各組（P＜0.01）；8h后F組明顯高于其他各組（P＜0.01）；M組在傷后72h明顯低于其他各組（P＜0.01）；但24h后各組間差異逐漸縮小。蛋白含量均以致傷后IOD與J組IOD的比值表示，見表3、圖1。

2.4N組和F組海馬NR1蛋白表達 海馬NR1蛋白表達在致傷后2h開始均明顯降低（P＜0.01），至24h基本恢復，72h明顯增加（P＜0.01）；2、24hF組明顯高于N組（P＜0.01）；但傷后72hF組明顯低于N組（P＜0.01）。蛋白含量均以IOD與J組IOD的比值表示，見表4、圖2。

圖1 致傷后各組肝臟GR蛋白在不同時間點變化的Western blot檢測結果

圖2 N組和F組NR1蛋白在不同時間點變化的Western blot檢測結果

3 討 論

應激產生的一系列非特異性神經內分泌反應目的是使機體抵抗力增強，保持和恢復內穩態。病理應激危害的主要原因之一是由高濃度糖皮質激素（GC）造成的。應激反應程度一般與應激原刺激強度呈正相關，刺激越強，反應越強。當刺激原過度強烈，如嚴重創傷時，由于生物機體的高度復雜性，機體往往不能做出適度反應，而出現應激紊亂，甚至危及生命。GC效應是機體最為重要的應激反應之一，其中GR是GC效應發揮的關鍵環節［3］。本研究結果表明，嚴重TBI引起機體中樞和外周GR蛋白表達下調，從而有可能促進過度炎癥反應形成和引發全身炎癥反應綜合征（SIRS）、多器官功能障礙綜合征（MODS）等全身繼發性損害，甚至死亡。因此通過采取適當措施，調控創傷后GR的反應具有重要意義。

目前關于麻醉藥物、麻醉方法對細胞因子的影響尚有爭議。以往認為，在單核細胞培養系統中靜脈麻醉劑（相當于臨床劑量）誘導細胞因子產生，氯胺酮以劑量依賴性方式抑制內毒素刺激TNF－α的分泌，而在沒有內毒素的情況下，氯胺酮并無作用。但近年研究揭示，氯胺酮具有直接抑制內毒素誘導的IL－6、8分泌的作用［4－5］。本實驗結果顯示，各致傷組 TNF－α和IL－1β含量傷后30min均明顯增高，24h后各組間差異逐漸縮小。F組明顯低于N組，而復合應用兩種藥物比單獨應用時降低更為明顯。這也證實了相關研究結果，氯胺酮等可以明顯抑制炎性因子的釋放。而IL－1β、TNF－α與腦創傷密切相關，因此氯胺酮－咪唑安定在TBI模型中能明顯降低這兩種細胞因子對腦保護和應激調控就具有了更為重要的意義。并且復合應用氯胺酮－咪唑安定后在傷后48h仍然與N組有明顯差異，這已經超過了藥物的代謝周期，說明其機制可能存在中樞和外周等多種途徑，尚需進一步的研究說明。

本實驗結果顯示，小鼠嚴重TBI后存在GCR，肝臟GR蛋白表達明顯降低［6］，氯胺酮－咪唑安定雖然沒有改變肝臟GR蛋白表達變化趨勢，但明顯改善了GR蛋白表達的降低。各致傷組肝臟GR蛋白表達均明顯降低，N組明顯低于其他各組，F組明顯高于K、M組，各組間差異隨時間逐漸縮小。咪唑安定和氯胺酮復合應用抑制TBI后GR蛋白表達下調的機制尚不清楚，可能是抑制了傷后下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸過度興奮或（和）通過NR、GABA等抑制海馬GR蛋白表達下調，還可能與神經中樞有效的鎮靜、鎮痛，作用于交感－腎上腺髓質和HPA軸，減輕創傷后組織損傷、疼痛、失血、缺氧、恐懼等引起的過度應激反應，從而抑制炎性細胞因子的生成和釋放等有重要關系。有文獻報道，GC在海馬介導應激性刺激的適應性反應，在應激后1h海馬GR mRNA明顯下降，這可能被NR、GABA等介導［7］。氯胺酮和咪唑安定作為通過NR和GABA作用藥物，在亞麻醉劑量出現明顯應激調控作用，其作用機制之一是否是通過NR和GABA影響HPA軸興奮性，還有許多問題尚待闡明。而作者的前期研究也觀察到腹腔注射咪唑安定－氯胺酮后可明顯降低小鼠死亡率［2］，因此對嚴重創傷（如TBI、燒傷、戰傷等）后應激反應早期合理地使用咪唑安定－氯胺酮可能有助于減輕機體應激反應，利于創傷后恢復，提高生存率。

海馬結構廣泛參與了學習、記憶等許多重要的生理過程，具有全腦缺血變化的全部特點。因此海馬是研究TBI等腦損傷與NR亞單位及其mRNA關系的理想對象。激活NR將導致HAP軸興奮性增加［7－8］；NR激動劑可以升高血皮質醇水平，而NR拮抗劑AP－5可抑制谷氨酸引起的促腎上腺皮質激素釋放因子釋放，其原因可能是通過NR介導影響促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、腎上腺皮質激素釋放激素（ACTH）釋放，最終影響GC水平。此外NR還可能通過某種途徑影響海馬GR蛋白表達量，而影響HPA軸負反饋［7］；MR對于皮質激素的親和力比GR高得多，靜息時其結合已基本飽和，參與基礎水平HPA軸的負反饋調節；應激時高水平皮質激素不僅與MR結合，也與GR結合通過一定途徑抑制HPA軸過度反應。本實驗發現，小鼠海馬NR1蛋白表達于致傷后2h開始明顯降低，至24h基本恢復，72h明顯增加。而F組2、24h明顯高于N組，但傷后72hF組明顯低于N組。這是一個有趣的現象，當NR1蛋白表達降低時，應用咪唑安定－氯胺酮可以減輕這種變化；當NR1蛋白表達增高時，卻又可以抑制這種增高，即趨向于維持一種穩態。而單獨應用咪唑安定－氯胺酮卻無此現象，這似乎提示咪唑安定－氯胺酮在小鼠嚴重TBI中調控應激、影響GR表達，其作用機制除了通過NR、GABA等環路作用影響HPA軸興奮性、通過外周直接作用影響細胞因子釋放外，是否還具有其他機制直接影響或維持海馬NR穩態，從而控制HPA軸狀態，尚有待進一步探討。

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