尤克強,張小寶,傅誠章
(1.江蘇省連云港市第一人民醫院麻醉科 222000;2.江蘇省人民醫院麻醉科,南京210029)
氯胺酮是常用靜脈麻醉藥,離體實驗結果顯示,氯胺酮能夠抑制巨噬細胞(AM)釋放炎性因子[1],從而發揮抗炎效應。而脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜組成成分,侵入機體后在LPS結合蛋白介導下,與AM膜上CD14結合,通過核因子-κB(NF-κB)信號等途徑調節細胞因子釋放和一氧化氮(NO)產生而參與炎癥反應[2]。AM是炎癥反應的主要效應細胞,AM通過分泌各種細胞因子、自由基、蛋白酶及各種補體參與局部炎癥反應[3]。本研究以肺泡AM系NR8383為研究對象,觀察氯胺酮對LPS刺激的總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的干預作用,初步探討氯胺酮對LPS誘發的氧化應激作用及可能機制。
1.1材料大鼠AM系NR8383(ATCC)、LPS (Sigma,美國)、鹽酸氯胺酮結晶粉末(KET,含量99.8%,批號05051112,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產)、Ham′s F-12培養液(hyclone,美國)、T-AOC和 GSH-Px測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、胎牛血清(杭州四季青)、全自動酶標儀(sunrise,澳大利亞)等。
1.2實驗方法
1.2.1細胞培養 將NR8383細胞株置于含15%胎牛血清、青霉素(100u/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)、L-谷胺酰胺(2mmol/L)、NaHCO3(1.5g/L)Ham′s F-12培養基中,在37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。
1.2.2培養上清液中 T-AOC和 GSH-Px的檢測 將大鼠AM按5×105個/mL接種于24孔板,每孔1mL。分為5組,對照組(C組)于培養基中加入與LPS等量的磷酸鹽緩沖液(PBS);LPS組(L組)于培養基中加入 LPS(1mg/L);氯胺酮組(K1~3組)于培養基中加入氯胺酮 (終濃度分別為10、100、1 000μmol/L),孵育0.5h后,再加入LPS。培養24h后收集各組培養液,離心后取上清液,立即凍存于-20℃冰箱待測。上清液稀釋后按試劑盒說明書進行檢測。
1.3統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件進行統計分析,計量資料以s表示。組間差異采用One-way ANOVA,以P<0.05為差異有統計學意義。
LPS刺激24h后NR8383細胞T-AOC和GSH-Px水平明顯降低(P<0.01)。氯胺酮低濃度組(10μmol/L)與LPS組比較,差異無統計學意義,而中、高濃度組(100、1 000μmol/L)能夠使LPS誘導的T-AOC和GSH-Px水平升高,差異有統計學意義(P<0.01),見表1。
表1 各組T-AOC和GSH-Px水平檢測結果(u/mL,s)
表1 各組T-AOC和GSH-Px水平檢測結果(u/mL,s)
Δ:與對照組比較,P<0.01;*:與LPS組比較,P<0.01。
T-AOC GSH-Px C組組別15.2±0.2 46.2±4.6 L組 7.3±0.5Δ 21.7±3.6△K1組 8.9±0.4 27.5±2.8 K2組 11.4±0.3* 34.1±6.1*K3組 12.2±0.6* 38.7±3.5*
AM是生物體抵御外來微生物入侵的天然屏障,是固有性免疫細胞中重要的效應細胞。AM位于肺泡腔及小氣道內,是肺內重要的常駐細胞和防御細胞。除發揮吞噬防御功能外,也可通過分泌大量的細胞因子始動和調節局部的炎癥反應。在慢性阻塞性肺病、免疫復合物誘導的肺損傷、哮喘等肺疾病中AM起著重要作用。AM還能被很多物質激活,如LPS、H2O2、IFN-γ等,產生氧化應激損傷。在哮喘研究模型中,目前多采用大鼠作實驗模型,故本研究采用大鼠肺泡AM,選用具有正常肺泡AM特點的大鼠AM系NR8383作為研究對象,可連續傳代,不僅省時省力,而且還可以克服動物個體差異導致的結果不穩定性。NR8383細胞能提供研究肺泡AM適合的試驗系統,能夠對刺激產生相應的反應,產生細胞因子等。
在激活狀態下,AM產生大量氧自由基,這些分子具有很高的反應性,可以與細菌細胞膜、核酸分子及蛋白質發生氧化還原反應,導致抗氧化能力下降。此外活性氧(ROS)還可上調一些細胞因子及黏附分子,如TNF、IL-1、ICAM-1表達水平,放大炎癥反應。
LPS是實驗中常用的細胞激活藥物,其能夠激活細胞產生多種物質。周媛等[3]發現LPS能夠使星形膠質細胞內鈣離子升高及ROS釋放增加?,F已證實,LPS處理AM后可引起NF-кB途徑和 MAPK 途徑激活[4]。Zhou等[5]研究發現,在AM,LPS除了激活這兩種途徑外,還可引起胞內游離鈣離子濃度升高,進而激活 Protein kinase C (PKC),釋放 NO、TNF-α、ROS等。有研究顯示,用1mg/L LPS刺激肺泡AM,能夠引起NF-κB、cAMP、OH 和O2-明顯升高,使細胞處于激活狀態[6]。
T-AOC是體內抗氧化物質對抗過氧化損傷能力的總和,GSH-Px主要存在于胞漿和線粒體內,能清除過氧化氫以及脂質過氧化物。本研究結果表明,當用LPS刺激AM后培養上清液中T-AOC和GSH-Px水平明顯降低,說明LPS可以導致AM的抗氧化能力下降。
氯胺酮是目前常用麻醉藥物,近年來研究發現,氯胺酮除傳統的麻醉與鎮痛作用外,還具有明顯抗炎作用。譚志鑫和李玉山[7]通過失血性休克兔模型發現氯胺酮具有很好的抗氧化作用。有研究顯示,氯胺酮能明顯抑制嚴重創傷早期小鼠腹腔AM糖皮質激素受體水平的下調,部分改善小鼠嚴重創傷誘發的應激狀態[8-9]。本實驗結果顯示,L組 T-AOC和 GSH-Px水平明顯低于C組,10μmol/L氯胺酮對此無改善作用,而當用較高劑量范圍氯胺酮(100、1 000μmol/L)預處理時,對 LPS所致的NR8383細胞T-AOC和GSH-Px水平降低具有明顯改善作用。Domino等[10]研究表明,氯胺酮100μmol/L為臨床用藥劑量,因此本實驗結果提示,臨床劑量氯胺酮即可抑制LPS引起的氧化應激損傷,增加氯胺酮劑量不能達到增加抑制效應的目的。
綜上所述,臨床劑量氯胺酮即可抑制LPS引起的肺泡AM T-AOC和GSH-Px水平下降,而增加劑量不能增加抑制效果。
[1]李海霞,朱敏敏,周欽海,等.氯胺酮霧化吸入對于哮喘大鼠肺泡灌洗液及血清白細胞介素-13濃度的影響[J].南京醫科大學學報:自然科學版,2006,26(4):265.
[2]Watters JJ,Sommer JA,Pfeiffier ZA,et al.A differential role for the mitogen-activated protein kinases in lipopolysaccharide signaling:the MEK/ERK pathway is not essential for nitric oxidce and interleukin 1beta production[J].J Biol Chem,2002,277:9077.
[3]周媛,李潔,劉春風.脂多糖對星形膠質細胞增殖和細胞內鈣離子水平及活性氧與一氧化氮釋放的影響[J].中國臨床康復,2006,10(33):171.
[4]Osawa Y,Lee HT,Hirshman CA,et al.Lipopolysaccharide induced sensitization of adenylyl cyclase activity in murine macrophages[J].Am J Physiol Cell Physiol,2006,290(1):C143.
[5]Zhou X,Yang W,Li J.Ca2+and protein kinase C-dependent signaling pathway for nuclear factor-kappaB activation,inducible nitric-oxide synthase expression,and tumor necrosis factor-alpha production in lipopolysaccharidestimulated rat peritoneal macrophages[J].J Biol Chem,2006,281(42):31337.
[6]Moon EY,Pyo S.Lipopolysaccharide stimulates Epac1-mediated Rap1/NF-kappaB pathway in Raw 264.7murine macrophages[J].Immunol Lett,2007,110(2):121.
[7]譚志鑫,李玉山.魔芋葡甘聚糖與氯胺酮對低氧/復氧小鼠的保護作用研究[J].中國病理生理雜志,2006,22(5):892.
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[10]Domino EF,Zsigmond EK,Domino LE,et al.Plasma levels of ketamine and two of its metabolites in surgical patients using agas chromatographic mass fragmentographic assay[J].Anesth Analg,1982,61:87.