轉基因草菇高產多功能纖維素酶的培養條件*

鄭蘭娟，林俊揚，林俊芳，郭麗瓊

1(華南農業大學食品學院生物工程系廣東 廣州，510640) 2(華南農業大學生物質能研究所，廣東廣州，510640)3(福建省莆田市農科所，福建莆田，351144)

轉基因草菇高產多功能纖維素酶的培養條件*

鄭蘭娟1，2，林俊揚3，林俊芳1，2，郭麗瓊1，2

1(華南農業大學食品學院生物工程系廣東 廣州，510640) 2(華南農業大學生物質能研究所，廣東廣州，510640)3(福建省莆田市農科所，福建莆田，351144)

以轉多功能纖維素酶基因(mfc)草菇子代中單孢分離獲得的高產多功能纖維素酶菌株TVM186為研究對象，分析固態發酵對該工程菌株產多功能纖維素酶(MFC)的影響。通過單因素試驗分析麩皮粉、大豆粉、香蕉皮粉等對MFC活性的影響，確定發酵主要影響因子為麩皮粉和大豆粉，適宜配比為質量比1∶1;利用均勻設計分析發酵條件對該菌株產MFC的影響，結果表明:草菇工程菌株TVM186固態發酵的適宜培養條件為:培養基起始pH值7.4，接種量6%，溫度34℃，時間10 d，含水量64%，裝料量18.5 g，其酶活力可達到木聚糖酶(Xylanase)1 427.38 U/g、內切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)597.59 U/g。

草菇，固態發酵，木聚糖酶，內切-β-1，4-葡聚糖酶，多功能纖維素酶

纖維素酶是能把纖維素分解成葡萄糖和其他化學物質的酶的總稱［1－2］，現已廣泛應用于食品、飼料、能源、造紙、紡織等行業［3－8］。目前纖維素酶的生產存在著產酶量低，酶成分單一，培養濾液分解天然纖維素能力差等問題;而且纖維素酶是誘導酶，在其生產中要求培養基含有各種原料來為產酶提供必需的C、N源或誘導物，但成分過多，不僅會增加原料成本，還會降解單位酶活，使得纖維素酶在纖維素資源的轉化及食品工業、畜牧業上的應用受到限制［9－12］。固態發酵生產纖維素酶可以選用任何的天然纖維素廢棄物，而且產量一般比液態發酵高出2～3倍，因此可以大幅度降低成本［13－14］，并且通過優化培養，可以降低纖維素酶生產成本［15］。

多功能纖維素酶(MFC)是從草食性軟體動物福壽螺的胃液中分離純化得到的一種纖維素酶，該酶同時具有外切β-1，4-葡聚糖酶，內切β-1，4-葡聚糖酶和內切β-1，4-木聚糖酶等3種活性，能同時降解纖維素和半纖維素［16］。本課題組從福壽螺的組織細胞中克隆多功能纖維素酶基因(mfc)［17］，采用多種啟動子在灰蓋鬼傘、銀耳芽孢、草菇中進行了表達研究［18］。本研究是在以草菇gpd啟動子連接mfc轉化草菇經過篩選獲得轉基因草菇工程菌株(另文報道)，通過轉基因草菇的培養種植，在轉mfc草菇子代中單孢分離并篩選得到的高產多功能纖維素菌株TVM186的基礎上，以廉價的農產品及其副產物作為發酵培養基，通過篩選最佳的固體發酵培養基及室內發酵條件，以期獲得草菇mfc工程菌株高產MFC的發酵培養條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

草菇工程菌株TVM186，從轉多功能纖維素酶基因(mfc)草菇的子代中分離并篩選獲得，為高產菌株。

1.1.2 培養基

斜面培養基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂 20 g、水 1 000mL。

固體發酵培養基:稻草粉、麩皮粉、玉米粉、黃豆粉、香蕉皮粉、甘蔗渣粉或菠蘿皮粉10 g，分別加20mL自來水混勻，pH自然。

1.1.3 主要試劑

燕麥木聚糖(X0627)為Sigma公司產品，羧甲基纖維素鈉，3，5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，NaOH，無水Na2SO3、水飽和酚及原料均為國產。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶活測定方法

參照文獻［19］測定。

1.2.2 培養方法

將活化好的菌種以4%～6%的接種量接種于已滅菌的固體發酵培養基中，32℃培養數天后，自來水浸提，5 000 r/min離心20 min，取上清液作為供試樣品，測定酶活。

2 結果與分析

2.1 不同培養料對產酶的影響

采用麩皮粉、玉米粉、甘蔗渣粉、稻草粉、菠蘿皮粉、黃豆粉和棉籽殼粉等作為單一培養料進行固態發酵產酶試驗，以木聚糖酶(Xylanase)和內切-β-1，4-葡聚糖酶(CMCase)酶活力作為評價MFC酶活力的指標。結果表明(圖1)，麩皮粉作為單一培養料時菌株的產酶量顯著高于其他培養料，其Xylanase、CMCase分別達到1 008.72 U/g，362.14 U/g。其次是黃豆粉，Xylanase、CMCase 分別達到 586.41 U/g，277.79 U/g，而其他幾種培養料其酶活力水平與麩皮相比都較低，菠蘿皮粉及甘蔗渣粉為培養料時沒有檢測到酶活，可能是菠蘿皮屬于酸性物質，而草菇適合在偏堿性的環境中生長;甘蔗渣中殘留的蔗糖等物質，可能對草菇的生長和產酶具有抑制作用，故草菇在以菠蘿皮粉及甘蔗渣粉為培養料時產MFC酶活很低，很難檢測到酶活。

圖1 不同培養料對產酶的影響

2.2 復合培養料對產酶的影響

為了進一步提高酶活，對單一的麩皮培養料中添加其他成分，進行復合培養料的固體發酵。圖2是麩皮添加等量的其他培養料進行復合培養的試驗結果，由圖2可知黃豆粉和麩皮粉復合培養產酶最顯著，其Xylanase、CMCase 分別達到 1 299.58 U/g，421.85 U/g，比單一麩皮成分Xylanase提高了22.89%，CMCase提高了14.17%。

圖2 復合培養料對菌株產酶的影響

為了優化復合培養基中黃豆粉和麩皮粉的比例，圖3顯示了添加不同比例的黃豆粉和麩皮粉的復合培養試驗的結果。以適當比例添加黃豆粉有利于菌株的產酶:當黃豆粉:麩皮粉組分比(質量比)為2∶8時，其產酶量與單一的麩皮培養料相當，當組分比調整至5∶5時，酶活力產生較大增幅，增幅為菌株以麩皮作為單一培養料時產酶量的12%～30%;繼續增加黃豆粉的量不能使產酶量增加。原因可能是:在麩皮培養基中適量添加黃豆粉，改善了固體培養基質的通氣及散熱條件，較利于菌株的生長和MFC的合成，但當黃豆粉的量增加而麩皮的量減少時，麩皮中所含有的宜于菌株利用的生長因子的量隨之減少，從而導致菌株產酶量大幅降低。故選擇m(麩皮粉):m(黃豆粉)=1∶1做為最適復合培養料配比。

圖3 復合培養料配比對菌株產酶的影響

2.3 固態發酵條件對產酶的影響

以復合培養料［m(麩皮粉)∶m(黃豆粉)=1∶1］作為固體發酵培養基，采用均勻設計表U10×(108)安排試驗，考察不同的培養溫度(℃)、pH值、含水量(%)、裝料量(g)、接種量(%)及培養時間(d)對菌株產酶(Xylanase，CMCase)的影響，每個處理重復2次，試驗結果如表1所示。

利用SAS8.1軟件進行數據處理。通過逐步回歸考察對Y起顯著影響的因子，剔除對Y的影響不顯著的因子，得到 Y1與因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之間的回歸方程為Y1=906.2× X1+570.9×X2－95.5×X3－51.4×X4－171.3×X5－32.8×X1X1+153.6×X1X2－390.7×X2X2+2.8×X1X3－11094。Y2與因子 X1、X2、X3、X4、X5、X6之間的回歸方程為Y2=444.2×X1+256.0×X2－39.95×X3－22.7×X4－73.2×X5－15.3×X1X1+70.8×X1X2－180.1× X2X2+1.2× X1X3－5 726.4。

表1 均勻實驗設計及實驗結果

從表1可以看出第5次試驗的發酵條件是10次試驗中最好的，即34℃、pH值9.5、含水量67%、裝料量11 g、接種量4%、培養10 d。這個最佳發酵條件和最優發酵條件常常是很接近的。上面得到的回歸方程一般僅在試驗范圍內成立，通過回歸旋轉分析得出xylanase理論最優發酵條件為:34℃、pH值7.4、含水量62%、裝料量18.5 g、接種量6%、培養9.5 d，Y1值為1 453.68 U/g。CMCase理論最優發酵條件為34℃、pH7.4、含水量 64%、裝料量 18.5 g、接種量6%、培養9.5 d，Y2值為672.26 U/g。因為Xylanase、CMCase是多功能纖維素酶表現出來的不同酶活性，其發酵條件應是相同的，故確定多功能纖維素酶固體發酵條件為:34℃、pH值7.4、含水量為64%、裝料量18.5 g、接種量6%、培養10 d。

2.4 驗證結果分析

經SAS軟件逐步回歸，得出最高指標時各個因素組合為 X1=34℃、X2=7.4、X3=64%、X4=18.5 g、X5=6%、X6=10 d，此時 Xylanase、CMCase 最高酶活應為1 453.68 U/g、672.26 U/g。經驗證，在如上條件下3次實驗的平均結果為:xylanase、CMCase酶活分別為1 427.38 U/g、597.59 U/g，與回歸的理論值基本偏差不大。說明該方法對草菇工程菌株TVM186發酵培養基優化是可行的。

3 討論與結論

纖維素酶是誘導酶，培養基中纖維素的含量直接影響纖維素酶的產生。課題組對其培養基進行大量的摸索，結果發現麩皮作為單一培養料時菌株產酶量顯著高于其他單一培養料，原因是麩皮中含淀粉、纖維素、半纖維素、有機氮及生長因子等豐富營養物質［20］可促進菌絲的生長，所含的纖維素和半纖維素可能對酶的合成具有誘導作用，故其在麩皮培養基上生長情況較好，很多研究者的研究結果也表明了這一點［21－22］。黃豆粉不適合菌絲生長，但與麩皮粉的混合有利于產酶。因此，麩皮粉和黃豆粉的混合物是草菇TVM186菌株發酵的理想培養基。

纖維素酶的生產有固體發酵和液體深層發酵兩種方法，前者無論是產量上還是質量上均優于后者，固體發酵比液體發酵具有更高的產率，D.S.Chahal通過對文獻已報道的2種發酵工藝產率的分析比較，發現固態發酵酶產率(250～430 IU/g纖維素)比液態發酵酶產率(160～250 IU/g纖維素)增加約72%［23］。在我們的研究過程中，也同時對 TVM186菌株的液體發酵條件進行了研究，結果表明:固態發酵培養，TVM186菌株的 Xylanase酶產率提高了75%，CMCase酶產率提高了86%。由于目前國內外應用的產纖維素酶的菌種大多系真菌，真菌習性在靜止條件下生產，并要求菌絲體緊密接觸纖維素類物質，故而在液體攪拌中生長不良。纖維素基質是不溶性的，亦不利于液態發酵。在液態攪拌發酵中，真菌在發酵罐內只長菌絲體，真菌不同部位分泌的酶的酶組分存在差異，故而液體發酵酶組分沒有生長完全的固體發酵酶組分豐富和比例適當。故本試驗最終確定采用固體發酵作為MFC的發酵途徑。

通過均勻設計分析，草菇TVM186菌株在34℃，pH值7.4，含水量64%，裝料量18.5 g，接種量6%，培養10 d的條件下，Xylanase和 CMCase的酶活分別可達到1 427.38 U/g、597.59 U/g，比優化前分別提高了9%和29%。

［1］Hong J，Tamaki H，Akiba S，et al.，Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1，4-glucanase from aspergillus niger and its expression in yeast［J］.Journal of Biosci-ence and Bioengineering，2001，92:434－441.

［2］Li Y H，Ding M，Wang J，et al，A novel thermoacidophilic endoglucanase，Ba-EGA，from a new cellulose-degrading bacterium，Bacillus sp.AC-1［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，70:430-436.

［3］張明霞，段長青，張文娜.纖維素酶在食品工業中的應用與展望［J］.釀酒科技，2005(4):99－100.

［4］趙玉林，陳中豪，王福君.纖維素酶在造紙工業中的應用研究進展［J］.紙和造紙，2002(2):64－66.

［5］李輝，李友明.纖維素酶在廢紙脫墨技術中的應用［J］.西南造紙，2003，32(1):36－38.

［6］曾傲，葉君.纖維素酶水解及其在能源與環境保護中的應用［J］.廣東化工，2006，33(10):25－28.

［7］呂東海，周巖民，李如治.飼用纖維素酶應用研究［J］.中國飼料，2004(10):25－27.

［8］徐曉飛，林煒鐵，楊繼國，等.纖維素酶在紡織工業中應用研究的進展［J］.上海紡織科技，2003，31(5):34－36.

［9］Ei Hawary F I，Mostafa Y S，Laszlo E.Cellulase production and conversion of rice straw to lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation［J］.Acta Alimentaria，2001，30(3):281－295.

［10］Szengyel Z，Zacchi G，Reczey K.Cellulase production based on hemicellulose hydrolysate from steam-pertreated willow［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1997，63(5):351－362.

［11］Selinger L B，Forsberg C W，Cheng K J.The rumen——a unique source of enzymes for enhancing livestock production［J］.Anaerobe，1996，2(5):263－284.

［12］Ingram L O，Aldrich H C，Borges A C C，et al.Enteric bacterial catalysts for fuel ethanol production［J］.Biotechnology Progress，1999，15(5):855－866.

［13］Lonsane B K，Saucedo Castaneda G，Raimbault M，et al.，Scale-up strategies for solid state fermentation systems［J］.Process Biochem，1992，27:259－273.

［14］Byoo D，Murphy V G，Karim M N.Evaporative temperatures and moisture control in a rocking reactor for solidstate fermentation［J］.Biotechnol Techniques，1999，5:19－24.

［15］王曉芳，徐旭士，吳敏，等.不同碳源對兩株真菌纖維素酶合成的誘導和調控［J］.應用與環境生物學報2002，8(6):653－657.

［16］王驥，丁明，李燕紅，等.福壽螺內源性多功能纖維素酶基因的克?。跩］.生物化學與生物物理學報，2003，35(10):941－946.

［17］楊培周，郭麗瓊，王藝紅，等.福壽螺(Ampullaria crossean)mfc基因的分子克隆和序列分析［J］.中國食品學報，2008，8(4):21－27.

［18］Shujie Cheng，Peizhou Yang，Liqiong Guo，et al.，Expression of multi-function cellulose gene mfc in Coprinus cinereus under control of different basidiomycete promoters［J］.Bioresource Technology，2009，100:4475－4480.

［19］Ghose T K.Measurement of cellulose activities［J］.Pure Appl Chem，1987，59(2):257－268.

［20］高培基.酸水解麩皮對斜臥青霉產纖維素酶的影響［J］.食品與發酵工業，1997，22(1):15－17.

［21］高潔.飼用木聚糖酶固體發酵技術研究與應用［D］.泰安:山東農業大學碩士學位論文，2007.

［22］李秀婷，楊紹青，江正強，等.利用農業廢棄物生產嗜熱真菌(T.lanuginosus)耐熱木聚糖酶固體發酵研究［J］.工業微生物，2004，34(4):1－6.

［23］Chahal D S.Growth characteristics of microorganisms in solid state fermentation for upgrading protein values of lignocelluloses and cellulose production［M］.Washington D C:American Chemical Society，1982:421－442.

Culture Conditions of Transgenic Volvariella volvacea for High Production of Muli-Functional Cellulase

Zheng Lan-juan1，2，Lin Jun-yang3，Lin Jun-fang1，2，Guo Li-qiong1，2
1(Doparenent of Bioengineering College of Food Science，South China Agricultanol Vuiversity，Guangzhou 510640，China)2(Lnstitute of Bionass Research，South China Agricultural Vniversity，Guangzhou 510640，China)3(The lnstitute of Agriculture Science，Putian 351144，China)

TVM186 with high MFC activity was separated by monospore isolation from the transformants of Volvariella volvacea.Solid substrate fermentation was performed to investigate the optimum fermentation conditions for enzyme production of the transgenic V.volvacea.Several single factors on fermentation of strain TVM186 were studied in this research.The result showed that the optimum culture conditions of solid state fermentation were wheat bran power and soybean power with allocated proportion is 1∶1.The optimum solid state fermentation conditions of TVM186 were initial pH 7.4，inoculation 6%，temperature 34℃，fermentation time 10 d，water ratio 64%，substrate 18.5 g using uniform design experiment.The highest Xylanase and CMCase activity were 1 427.38 U/g and 97.59 U/g respectively.

Volvariella volvacea，solid substrate fermentation，Xylanase，CMCase，Muli-Functional Cellulase

碩士研究生(郭麗瓊教授為通訊作者)。

*國家863項目(2006AA10Z301);“十一五”國家科技支撐計劃重點項目子課題(2008ADA1B02);國家自然科學基金項目(30871768)資助

2010－04－14，改回日期:2010－07－27