采用微量熱法快速檢測食品中的細菌總數*

農衛良，管驍，徐斐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海，200093)

采用微量熱法快速檢測食品中的細菌總數*

農衛良，管驍，徐斐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海，200093)

以醬牛肉中的污染菌為測試菌，利用微量熱儀測定了細菌的生長熱譜曲線。結果表明，選擇24 h的菌體活化時間，并在優化培養基中培養4 h后計算菌體生長熱效應值，在103～106CFU/mL范圍內菌體放熱量能較好地反映細菌總數值，且微量熱法測得結果與常規平板計數法無顯著差異。

微量熱法，細菌總數，快速檢測

對食品中的細菌總數進行快速測定是現代食品衛生控制工作中的一項重要任務［1］。近年來，隨著諸如酶聯免疫吸附分析、聚合酶鏈反應技術、微量熱法等新技術的開發成功［2－3］，為細菌總數的快速定量提供了多種可能。這些快檢技術原理各不相同，適用范圍也存在差異。其中微量熱法具有通用性強，適用于所有微生物檢測等特點，備受食品工作者的關注［4］。微量熱法快速檢測微生物是利用微生物生長時產生熱效應的原理設計而成的，微生物在生長和代謝的過程中，能產生一定的代謝熱，且熱效應與微生物的數量呈比例關系。然而目前此法的發展也受到一些因素的限制，如微生物生長熱效應過程周期長、熱信號小等，因而對熱量值進行定量往往誤差較大。若能有效放大微生物的熱信號值，將對采用微量熱法對微生物進行快速定量具有重要意義。前期試驗已對量熱用細菌培養基進行了優化研究，本試驗通過測定微生物生長熱來表征初始細菌總數，并將微量熱法測定結果與常規平板計數法進行比較，以期驗證微量熱法在細菌快速定量中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

菌種:來自于醬牛肉中的優勢菌株，本實驗室自行分離純化;細菌混懸液是按照醬牛肉樣品中各種細菌的平均比例進行混懸。

NaCl、葡萄糖、MaSO4均為分析純試劑，胰蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。

1.1.2 儀器與設備

Micro DSCⅢ型微量熱儀，法國SETARAM公司，蠕動泵BT00－300M:常州市城合衛生設備廠。

1.1.3 培養基的制備

普通培養基:胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉浸膏3 g溶于1 000mL蒸餾水中，調pH值至6.8～7.2，121℃高壓滅菌20 min備用。

優化培養基:胰蛋白胨8.45 g、NaCl 5 g、MgSO40.2 g、酵母浸膏4.5 g、葡萄糖1.42 g溶于1 000mL蒸餾水，調pH值至7.2，121℃高壓滅菌20 min備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 量熱測定［5－6］

量熱實驗在微量熱儀Micro DSC III上進行，采用停流法。首先對循環池及管路進行清洗消毒，清洗過程為:先以30mL/h流速的無菌蒸餾水清洗30 min，再用75%乙醇以相同流速清洗30 min，最后用無菌蒸餾水再沖洗30 min。待基線平穩后，以30mL/h的流速泵入接過菌種的細菌培養液，確認培養液已充滿流動池后停泵，儀器即開始測量記錄循環池內細菌生長代謝的熱功率－時間曲線。測量過程完成后，對該生長熱曲線進行積分計算出細菌生長代謝過程的累積放熱量 Q［4，7］。

1.2.2 細菌活化時間對放熱的影響

冷藏菌種的活化在普通培養基倒成的平板上進行。在其他培養條件相同的條件下，改變量熱實驗前細菌的活化時間(分別為12、24、36和48 h)，然后在接種相等菌量的條件下進行量熱實驗，比較細菌前期活化時間對其生長放熱量的影響。

1.2.3 初始細菌總數和放熱量Q的關系

其他條件相同情況下，考察不同初始細菌接種量分別在優化培養基中培養不同時間(4、5、6、7 h)(即對應熱譜曲線中不同的積分時間)和累積放熱量之間的對應關系。

1.2.4 標準曲線的建立

利用上述優化實驗得到的最佳測熱條件，對不同細菌總數的菌懸液(1 000～100 0000 CFU/mL)進行熱量值測定，建立“熱量值－細菌總數”的標準曲線。

1.2.5 確證實驗

制取未知菌液濃度的菌懸液，分成2份，1份利用量熱法檢測未知濃度菌懸液4 h的放熱量，并通過細菌放熱標準曲線計算得到細菌總數。另1份用平板計數法檢測細菌總數。對2種方法的結果進行比對，驗證標準曲線的準確性。

2 結果與分析

2.1 培養基成分對細菌放熱的影響

量熱過程中所使用培養基的不同會直接影響到細菌的生長狀況，進而對細菌的生長熱效應產生影響。通過量熱實驗分別得到細菌在優化培養基和普通培養基中的生長熱譜圖，如圖1所示。

圖1 細菌在不同培養基中的生長放熱圖譜

從圖1可以看出，細菌在普通培養基中生長，雖有熱效應峰出現，但峰形不夠明顯且不規則，而細菌在優化培養基中生長出現了典型的特征性放熱峰，且比較好地反映出了細菌生長的4個時期，這可能是由于菌體在不同培養基中生長狀況不同而造成生長熱效應有差異引起的［4，8－9］。通過對熱譜曲線不同時間段的積分，可以求得細菌生長不同時期所產生的累積熱效應，結果如圖2所示。從圖2可以看出，在普通培養基中生長的細菌生長熱效應不如在優化培養基中的顯著，且累積熱效應與放熱時間的關系呈先增加(5 h之前)后減小的變化趨勢，這可能是由于細菌在生長初期正常生長放熱，到后期出現菌體自溶吸熱所造成的［10］。相比之下，菌體在優化培養基中的生長熱效應較大，且在7 h的測熱過程中持續放熱，熱效應與放熱時間呈現出較好的線性關系，由此說明優化培養基更有利于在微量熱法測定過程中的應用。

圖2 細菌在不同培養基中生長熱效應的比較

2.2 細菌前期活化時間對其生長放熱的影響

細菌活化過程即細菌恢復性培養，該過程可使細菌恢復至良好的生長狀態，這對后面的量熱實驗成敗至關重要。低溫長時間保藏的菌種生理上處于休眠期，因此在量熱實驗前需對其進行活化，從而將細菌開始放熱時間提前，并增大累積熱信號值?；罨瘯r間的長短與活化效果緊密相關。不同活化時間對量熱實驗的影響如圖3所示。從圖3可見，細菌活化24 h后放熱狀態達到最佳，出現特征性雙峰，重現性高。而活化12 h細菌在平板中的生長情況不佳，活性不足，未能出現預計的放熱峰，但在4～5 h波動較大，說明在此區間已處于對數生長期，但放熱不均勻，波動大;活化時間為36、48 h的細菌在制成的菌懸液中出現抱團現象，不易溶解。雖活化時間為36 h的細菌出現放熱峰，但已處于生長末期，放熱量少?；罨?6 h和48 h的細菌放熱曲線無明顯規律，未出現特征性雙峰，且重現性低，可能是活化時間過長，導致大部分細菌衰退死亡和分解代謝出一些不利于細菌生長的物質，影響細菌生長放熱［11－13］。

2.3 初始細菌總數與放熱量的關系

要將微量熱法成功應用于食品中細菌的快速定量檢測，應能保證使菌體在較短的時間內產生較大的熱響應值。實驗中比較了不同數量的細菌生長不同時間后所產生的熱效應，結果如圖4、圖5所示。從圖4中可看出，隨著測熱時間的延長，菌體累積熱效應越大，生長5 h的放熱量明顯高于4 h，這可能是由于5 h前菌體處于對數生長期，生長活動旺盛;5 h后放熱量增幅越來越小，說明菌體可能處于穩定期和衰亡期，這一點從熱譜圖(圖3.b)中也可以看出來。由圖5可知，對不同初始菌量的菌體而言，測定其4 h或5 h的累積熱效應值與細菌總數間呈現了較好的線性關系，特別是4 h的放熱量與細菌總數之間的線性關系R2值可達0.966 1。這間接印證了該時期菌體生長穩定，熱效應持續;而測量6 h或7 h的熱量值，發現細菌總數和熱效應間已無明顯的變化規律，這可能是由于此時的熱效應不僅包括菌體的生長熱，還包括菌體自溶、菌體代謝產物對自身的抑制作用等其他影響因素。在每次試驗結束后，取出菌液進行平板計數，得到細菌在循環池內4～7 h的生長情況，結果也證明細菌在4～7 h內菌數增長緩慢，甚至減少。其原因可能是循環池內培養基中氧氣耗盡與菌體生長競爭抑制作用導致的。因此，選擇測熱時間為4 h能較好體現細菌總數與放熱量的對應關系。

圖3 不同活化時間的細菌生長熱譜圖

圖4 測熱時間與放熱量的關系

圖5 不同細菌總數與放熱量的關系

2.4 放熱標準曲線的建立

通過以上對測熱條件的優化實驗，選擇細菌活化時間24小時，然后將菌體接種于優化培養基中導入微量熱儀循環池，測定菌體4 h內的生長熱效應，并將熱量值與初始細菌總數一一對應，即得到細菌總數的計數標準曲線，如圖6所示。處理結果表明:若對該曲線進行二次回歸擬合，得到的二次回歸曲線y=－7.8×10－7x2+0.001 3x+0.100 8(r2=0.942 4)的擬合關系并不好;若作一段式線性擬合y=0.000 9x+0.114 1(r2=0.936 1)，擬合關系也不佳;但對該曲線進行分段線性擬合，如圖6所示，AB段的擬合曲線為y=0.003 6x+0.043 6(r2=0.969 6)，BC段的為y=0.000 8x+0.180 8(r2=0.986 6)，由此可見分段線性擬合后各段之間的線性關系良好，因此可根據其放熱量并采用分段標準曲線處理方式來計算對應的細菌總數。

圖6 初始菌數與放熱量之間的標準曲線

2.5 確認實驗

利用微量熱法對2份未知濃度的菌懸液進行細菌總數檢測，并與傳統的平板計數法結果比對，結果如表1所示。由表1可知，2種測定方法所得結果之間的誤差小于10%(分別為7.76%和9.78%)，F檢驗結果表明該差異不顯著，由此說明該標準曲線具有實際應用價值。特別值得指出的是，該標準曲線提供了103～106CFU/mL范圍內的初始菌量的熱量值，可以滿足大多數實際食品樣品中細菌總數的檢測要求。但若細菌總數更小，由于能檢測到的熱信號較小，并易受到周圍環境和儀器精度等因素的影響，應該考慮通過其他方式將其熱信號進一步放大才能滿足檢測的要求，這有待于進一步的研究。

表1 標準曲線驗證結果

3 結論

本試驗在已篩選得到醬牛肉優勢菌的基礎上，對牛肉中的細菌總數微量熱法快速測定實驗條件進行了優化，優化后的實驗條件可用于細菌總數的實測，并與傳統的平板計數法結果進行比較。結果表明，細菌活化時間、測熱培養基的選擇及測熱時間長短均對量熱法測定結果影響顯著，選擇24 h的菌體活化時間，并在優化培養基中培養4h后計算菌體生長熱效應值，在103～106CFU/mL范圍內能較好地反映細菌總數值;且微量熱法所得結果與常規平板計數法基本相符;重要的是，微量熱法能大大減少檢測時間，由常規的48 h減少為4 h。

［1］曾慶梅，張冬冬，楊毅.食品微生物安全檢測技術［J］.食品科學，2007，28(10):632－637.

［2］王莎莎，食品微生物快速檢測技術的研究進展［J］.生命科學儀器，2009(8):60－63.

［3］宋宏新，馬娜.食品中病原微生物快速檢測方法研究進展［J］.食品研究與開發，2005，26(2):127－129.

［4］Higuera-Guisset J，Rodríguez-Viejo J，Chacón M，et al.Calorimetry of microbial growth using a thermopile based microreactor［J］.Thermochimica Acta，2005，427:187－191.

［5］Mohammad Russel，Jun Yao.Different Technique of Microcalorimetry and Their Applications to Environmental Sciences:A Review［J］.Journal of American Science，2009，5(4):194－208.

［6］張有民，王保懷，楊森森.生命科學、醫學食品專用高靈敏度微量儀Micro DSC III介紹及應用Ⅱ［J］.現代科學儀器，2001(2):39－43.

［7］Wang F.Microcalorimetric measurements of the microbial activities of single-and mixed-species with trivalent iron in soil［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2009，72:128－135.

［8］劉蓮，林貴梅，邵偉.微量熱技術在微生物和細胞研究方面的應用［J］.藥物生物技術，2010(1):79－82.

［9］Marison I，Liu J S，Ampuero S，et al.Biological reaction calorimetry:development of high sensitivity bio-calorimeters［J］.Thermochimica Acta，1998，309:157－173.

［10］Johannessen E A，Weaver J M R，Cobbold P H，et al.Heat conduction nanocalorimeter for Pi-scale single cell measurements［J］.Applied Physics Letters，2002，80(11):2 029－2 031.

［11］Maskow T，Babel W.A calorimetrically based method to convert toxic compounds into poly-3-hydroxybutyrate and to determine the efficiency and velocity of conversion［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55:234－238.

［12］Kabanova N，Kazarjan A，Stulova I，et al.Microcalorimetric study of growth of Lactococcus lactis IL1403 at different glucose concentrations in broth［J］.Thermochimica Acta，2009，496:87－92.

［13］Guan Y，Evans P M，Kemp R B.Specific heat flow rate:an on-line and potential control variable of specific metabolic rate in animal cell culture that combines microcalorimetry with dielectric spectroscopy［J］.Biotechnology and Bioengineering，1998，58:464－477.

Study on Rapid Detection Method of the Microbial Biomass in Food by Microcalorimetry

Nong Wei-liang，Guan Xiao，Xu Fei
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

In this paper，the thermogram with respect to the growth of bacteria in beef was determined with microcalorimeter.The results indicated that the total amount of bacteria could be calculated by thermal effect of bacteria growth in the range of 103～106CFU/mL under the condition of active time 24 h and incubation for 4 h in optical culture.And there was no significant difference between the results obtained by the method of microcalorimetry and platecount.

microcalorimetry，microbial biomass，rapid detection

碩士研究生(徐斐教授為通訊作者)。

*上海市教委科研創新項目(08ZZ77)，上海市研究生創新基金項目(JWCXSL0902)，上海高校選撥培養優秀青年教師科研專項基金(slg－07047)

2010－01－25，改回日期:2010－08－23