芡實多糖的粗提取及其對羥自由基的清除效果

趙翾，李紅良，葉倩雯

1(仲愷農業工程學院，輕工食品學院，廣東廣州，510225) 2(東莞市廣益食品添加劑有限責任公司，廣東東莞，523220)

芡實多糖的粗提取及其對羥自由基的清除效果

趙翾1，李紅良2，葉倩雯1

1(仲愷農業工程學院，輕工食品學院，廣東廣州，510225) 2(東莞市廣益食品添加劑有限責任公司，廣東東莞，523220)

對芡實多糖的提取工藝進行了研究，并探討了其對羥自由基的清除效果。通過單因素試驗分別考察了浸提溫度、浸提時間、乙醇濃度、水料比對芡實多糖提取量的影響，并確定了各因素的適用范圍。利用Design-Expert軟件設計了正交試驗，并通過響應面分析法確定了芡實多糖的最佳提取工藝條件。結果表明:芡實多糖的最佳提取工藝條件為浸提溫度92℃，浸提時間6 h，乙醇體積分數85%，水料比26∶1(mL∶g)，提取的芡實多糖提取量為0.62 mg/g，其對羥自由基的清除率為46.42%。

芡實，多糖，羥自由基，提取，清除，響應面法

芡實(Semen euryales)是睡蓮科1年生水生草本植物芡(Euryale ferox Salisb)的種子成熟種仁［1］，是我國傳統著名滋補防病保健中藥材之一，具有養血安神、益腎固精、去濕健脾、止瀉止滯等保健功效，對腎虧脾虛，小便失禁、白帶崩下、慢性腹瀉、輕度浮腫、腰腿關節痛等癥均有顯著的治療作用。芡實營養豐富，蛋白質含量較豐富，氨基酸總量豐富且種類齊全，維生素含量也較為豐富;碳水化合物含量高達77%～78%，除6%左右為不溶性纖維素外，多數可被人體消化吸收，是比較理想的膳食纖維源［2～4］。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統中最佳條件并能研究各因素間交互作用的數學統計方法，該方法試驗次數少、周期短，求得的回歸方程精度高，已經被廣泛用于食品工業［5］。本試驗利用中心組合設計(central composite design)優化芡實多糖的提取工藝，為進一步研究芡實多糖的組成、結構和其與生物學活性提供必要的科學數據。

1 材料與方法

1.1 原料

芡實(市售);濃硫酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、苯酚、水楊酸、無水乙醇等，均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

6202高速粉碎機(北京環亞天元機械技術有限公司)，HWS12型電子恒溫水浴鍋(上海恒科科學儀器有限公司)，BS110S型分析天平(常熟雙杰測試儀器廠)，RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，LXJ-ⅡB型離心機(上海安亭科學儀器廠)，SpectrumLab54紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)。

1.3 芡實多糖提取方法

芡實多糖的提取采用水溶醇析法，其原理是根據多糖較易溶于水、堿、酸當中，而難溶于乙醇、石油醚、氯仿等溶劑的性質，用水先將粗多糖從芡實中提取出來，然后加入乙醇將其沉淀，同時除去單糖、低聚糖、甙類及生物堿等雜質［8］。具體操作流程如下:

芡實→粉碎過篩→芡實粉→熱水浸提→浸提液→離心→上清液→真空濃縮→乙醇沉淀→粗多糖→測定多糖含量

1.4 多糖測定方法

本研究采用苯酚-硫酸法［9］測定多糖提取量。

1.4.1 葡萄糖標準曲線的制作

精密稱取0.040 2 g葡萄糖，用蒸餾水溶解后定容到500mL，搖勻配制成80.4μg/mL的葡萄糖標準溶液，精確吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，分別置于試管中，加蒸餾水補至2mL。加5%苯酚試液1mL，搖勻。迅速滴加濃硫酸5mL，快速搖勻，放置5 min。置沸水浴中加熱15 min，取出，用冷水迅速冷卻至室溫。同時用蒸餾水作空白，于490 nm處測定吸光度。

1.4.2 換算因子的計算

精密稱取干燥至恒重的芡實多糖20 mg，用蒸餾水溶解后定容至100mL。吸取多糖溶液0.5mL，按照1.4.1測定吸光度，由回歸方程計算出溶液中葡萄糖的含量，按下式計算換算因子。

式中:m為稱取多糖的質量(μg)，c為多糖液中葡萄糖的含量(μg/mL)，D為多糖的稀釋倍數。測定濃度為0.20μg/mL的芡實多糖吸光度為0.35，計算得換算因子為1.60。

1.4.3 芡實多糖提取量的計算

稱量芡實粉末(過40目篩)，按料液比1∶30(g∶mL)加入蒸餾水，水浴浸提2 h，浸提液3 000 r/min離心15 min后取上清液，上清液用旋轉蒸發儀濃縮到10mL，然后加入乙醇溶液沉淀，棄去上清液，沉淀加水溶解并定容至250mL。吸取0.5mL測定多糖的含量。

其中:m'，試液中葡萄糖的質量(μg);f，換算因子;V，測定時吸取的樣品液體積(mL);250，稀釋樣液總體積;m，稱取試樣質量(g)。

1.4.4 羥自由基清除率的測定

本試驗采用水楊酸作為羥自由基捕捉劑，在Smironff等報道的方法上進行改進。具體測定方法如下:在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2mL、不同濃度粗多糖溶液2mL、6 mmol/L H2O2溶液2mL，搖勻，靜置10 min。再加入6 mmol/L水楊酸溶液2mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm處測得不同粗多糖濃度下的吸光度Ai，用水代替水楊酸時測得某濃度粗多糖的吸光度為本底吸光度Aj，用水代替抗氧化劑時測得的吸光度為對照吸光度A0。按下式計算得到羥自由基的清除率［10］。

2 結果與分析

2.1 浸提溫度對多糖提取量及芡實多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實粉，加入60mL的蒸餾水，分別置于 50、60、70、80、90、100 ℃下浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測定多糖提取量及其對羥自由基的清除率。結果見圖1。

圖1 浸提溫度對多糖提取量及芡實多糖清除羥自由基效果的影響

由圖1可知，隨著浸提溫度的升高，芡實多糖的含量增加較明顯，溫度上升到90℃時，浸出的多糖提取量達到最大值;當溫度超過90℃以后，多糖的含量呈現下降趨勢。芡實多糖清除羥自由基的能力隨浸提溫度變化的趨勢相同。故浸提溫度選擇在90℃左右比較適宜。

2.2 浸提時間對多糖提取量及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實粉，加入60mL的蒸餾水，置于 70℃下分別浸提 1、2、3、4、5和6 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測定多糖提取量及其對羥自由基的清除率。結果見圖2。

圖2 浸提時間對多糖提取量及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

由圖2可知，隨著浸提時間的延長，芡實多糖的含量逐漸增加，浸提時間5 h時達到最大，然后隨著浸提時間的延長，芡實多糖提取量開始下降。芡實多糖清除羥自由基的能力與芡實多糖提取隨浸提時間變化的趨勢相同。故浸提時間選擇在5 h左右比較適宜。

2.3 乙醇濃度對多糖提取效果及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實粉，加入60mL的蒸餾水，置于70℃下分別浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，分別加入3倍體積的50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測定多糖提取量及其對羥自由基的清除率。結果見圖3。

由圖3可知，隨著乙醇濃度增加，芡實多糖的含量逐漸增加，乙醇體積分數為80%時達到最大，然后隨著乙醇體積分數的增大，芡實多糖提取量開始下降。芡實多糖清除羥自由基的能力隨乙醇濃度變化的趨勢相同。故乙醇體積分數選擇在80%左右比較適宜。

圖3 乙醇濃度對多糖提取量及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

2.4 水料比對多糖提取效果及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

稱取2 g粉碎度為40目的芡實粉，以水料比(mL∶g)為 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 加入蒸餾水，置于70℃下浸提2 h，浸提離心后取上清液濃縮，加入3倍體積的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并測定多糖提取量及其對羥自由基的清除率，結果見圖4。

圖4 水料比對多糖提取量及對芡實多糖清除羥自由基效果的影響

從圖4可知，隨著水料比的增加，芡實多糖的含量逐漸增加，水料比為30∶1時達到最大，然后隨著水料比的增大，芡實多糖提取量開始下降。芡實多糖清除羥自由基的能力隨水料比變化的趨勢相同。故水料比選擇在30∶1左右比較適宜。

2.5 響應面分析

本試驗采用Design-Expert7.1.6軟件中的中心組合設計原理設計正交試驗。根據單因素試驗結果，選取浸提溫度(A)、浸提時間(B)、乙醇體積分數(C)和水料比(D)4個因素作為試驗因素設計試驗，試驗因素及水平見表1。試驗設計見表2，共有19個試驗點，其中16個析因點，3個中心點。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗設計及結果

采用響應面分析法分析正交試驗結果，得到分別以多糖提取量和羥自由基清除率為響應值的回歸方程(1)和(2)。

對正交試驗結果的方差分析見表3和表4。

從表3和表4可知，不論是以多糖提取量為響應值還是以羥自由基清除率為響應值，建立的數學模型均是顯著的，失擬項不顯著，說明建立的該數學模型可以很好地擬合試驗情況，可用于試驗結果的預測。即可以使用該數學模型推測試驗結果。

表3 響應面ANOVA對多糖提取量分析結果

表4 響應面ANOVA對芡實多糖清除羥自由基分析結果

各因素對多糖提取量和羥自由基清除效果的影響由大到小依次為:乙醇濃度＞浸提時間＞水料比＞浸提溫度。其中乙醇濃度對結果有非常顯著的影響，其余因素對結果影響顯著，浸提溫度和乙醇濃度之間的交互作用及浸提時間和乙醇濃度之間的交互作用對結果有顯著影響，而且浸提溫度和水料比的交互作用對羥自由基的清除率也有顯著性影響，它們之間的交互作用響應面圖見圖5～圖9。

圖5 浸提溫度與乙醇濃度對芡實多糖提取量的影響

圖6 浸提時間與乙醇濃度對芡實多糖提取量的影響

圖7 浸提溫度與乙醇濃度對芡實多糖羥自由基清除率的影響

圖9 浸提時間與水料比對芡實多糖羥自由基清除率的影響

由以上數學模型得到4個較優的工藝條件(試驗1～4)，將這4個條件和正交試驗結果最佳的兩個試驗條件一起組成驗證試驗，以尋找芡實多糖提取的最佳工藝條件。驗證試驗設計見表5。

表5 驗證試驗設計表

根據驗證試驗結果，當浸提溫度為92℃、浸提時間為6h、乙醇體積分數為85%、水料比為26∶1(mL∶g)時，芡實多糖的提取量達到最大0.63 mg/g，該條件下得到的芡實多糖對羥自由基的清除率也達到最大46.42%，與理論預測值非常接近。

4 結論

本試驗通過單因素試驗首先分別考察了浸提溫度、浸提時間、乙醇濃度、水料比對芡實多糖提取量及多糖對羥自由基清除率的影響，并以此為依據，采用響應面法建立了數學模型，并獲得了芡實多糖的最佳提取工藝條件為:浸提溫度為92℃，浸提時間為6h，乙醇體積分數為85%，水料比為26∶1(mL∶g)，此條件下芡實多糖的提取量為0.63 mg/g，其對羥基自由基的清除率為46.42%。

［1］李彥連，張愛良.一種重要水生藥用維管植物——芡實［J］.濟寧師專學報，1998，19(6):27.

［2］張汆，薛連海，賈小麗，等.芡實的營養保健價值及其加工利用［J］.中國野生植物資源，2009，28(3):24－27.

［3］譚勝兵，金婷.芡實的營養保健功能及其開發利用［J］.食品工程，2008(3):8－10.

［4］唐長波.芡實的研究現狀與開發前景［J］.蘇州市職業大學學報，2009，20(2):90－92.

［5］孫萍萍，王頡，孫劍鋒，等.響應面法對縊蟶粗多糖提取工藝的優化［J］.水產科學，2010，29(4):203－207.

［6］關海寧;刁小琴;馬松艷，等.Box－Behnken設計協同RSA優化對微波輔助大豆多糖浸提工藝的研究［J］.糧油加工，2010(4):112－116.

［7］趙大慶，孫蘭萍，張斌，等.南瓜水溶性粗多糖提取工藝的優化［J］.農產品加工，2007(11):22－26，58.

［8］金婷.芡實多糖的提取工藝研究［J］.中國食物與營養，2009(5):50－51.

［9］梁蘭蘭、阮征、陳欣榮.米糠多糖提取工藝研究［J］.糧食與油脂，2004(4):3－4.

［10］邵佳，郁建平，胡美忠.草珊瑚水溶性粗多糖提取及抗氧化性能研究［J］.哈爾濱商業大學學報:自然科學版，2007，28(11):283－286.

Preliminary Study on Extraction of Crude Polysaccharides from Semen euryales and Its Scavenging Activity of Hydroxyl Radical

Zhao Xuan1，Li Hong-liang2，Ye Qian-wen1
1(The College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agricultural and Engineering，Guangzhou 510225，China)2(Dongguan Guangyi Food Additive Industry Co，Ltd，Dongwan 523220，China)

The extraction of crude polysaccharides from Semen euryales was studied and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides was also discussed.The effects of extraction temperature，extraction time，ethanol concentration，liquid to solid ratio on the extraction yield of the crude polysaccharides and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides were investigated.Single factor experiments and the orthogonal experiments was designed by Design-Expert software.The model was established by the response surface methodology analysis and the optimal extraction condition was obtained as follows:extraction temperature 92℃，extraction time 6h，ethanol concentration 85%，liquid to solid ratio 26∶1，the extraction yield of crude polysaccharides was 0.63mg/g and the scavenging activity of hydroxyl radical was 46.42%.

Semen euryales，polysaccharide，hydroxyl radical，extraction，scavenging activity，response surface methodology

博士，講師。

2010－07－06，改回日期:2010－10－15