熱處理過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯變化的動力學研究*

吳平，夏濤，高麗萍，戴前穎，王云生，李釗

(安徽農業大學教育部茶葉生物化學與生物技術重點實驗室，安徽合肥，230036)

熱處理過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯變化的動力學研究*

吳平，夏濤，高麗萍，戴前穎，王云生，李釗

(安徽農業大學教育部茶葉生物化學與生物技術重點實驗室，安徽合肥，230036)

利用Arrhenius動力學方程，研究了不同熱處理(4～100℃)條件下，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)發生降解、異構化和脫沒食子化反應的變化規律，并建立了相關的動力學預測模型。結果表明:熱處理過程中EGCG發生的降解、異構化和脫沒食子化反應均屬于一級動力學反應，可用Arrhenius方程進行擬合(R2＞0.9)，反應速率常數K均隨著溫度的升高而增加，預測模型中的Ea(活化能)和A(頻率因子)分別為53.90 kJ/mol和5.698×104、98.60 kJ/mol和7.315×1012、85.34 kJ/mol和5.112×1010，表明EGCG 易發生降解，而發生異構化反應難;各模型的預測值與實際值的相對誤差＜13%，因此可根據Arrhenius方程對熱處理條件下EGCG的變化進行預測。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，降解，異構化，脫沒食子化，動力學模型

兒茶素是以2-苯基苯并吡喃為基礎結構的類黃酮化合物中的黃烷醇類［1］。在茶樹鮮葉中兒茶素含量可以達到干重的12%～24%，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)又是其中的主體成分(50%～60%)［2］。自從1929年日本人首次從茶葉中提取分離出EGCG以來，許多科學工作者對EGCG生理功效進行了研究，發現它具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、抗菌消炎、降糖和降壓等多種生物學功能［3－4］。

EGCG的穩定性較差，在加工和儲藏過程中的濕熱作用下，極易發生降解、氧化和異構化等反應，從而改變兒茶素原有的生理活性，并對茶飲料的茶湯品質產生不良影響［5－9］。溫度、pH 值和金屬離子等都影響著兒茶素穩定性，而溫度是其中最關鍵的因子之一［10－13］。利用化學動力學模型研究環境因素對兒茶素穩定性、兒茶素氧化降解和異構化的影響，不僅可以深入探討兒茶素變化的機理，也為茶飲料商品品質變化提供了監控手段。目前國內外的一些研究者已經利用化學動力學模型對冷藏魚［14］、冷卻肉［15］和刀豆［16］等生鮮及加工食品的品質變化進行研究，并且很好預測了其貨架期。

本實驗利用化學動力學模型及Arrhenius方程，對熱處理條件下EGCG發生降解、異構化和脫沒食子化反應的變化規律進行研究，并建立動力學預測模型，為解決兒茶素穩定性問題提供理論依據，并為實時監控茶飲料的生產銷售過程中的兒茶素動態變化提出可行方案。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，購于福州日冕科技開發公司，純度為90%;沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子酸(GA)(純度均為99.9%)的標準品，購于美國 Sigma公司;超純水，杭州娃哈哈飲用水。實驗用的甲醇、乙腈和乙酸為色譜級的試劑，購于 Tedia公司(USA)。

日本 Shimadzulc－20AD高效液相色譜儀，SPD6AV可調波長紫外檢測器(日本島津公司);LC－solution色譜工作站，數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，TB－214Denver電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，KQ－500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱處理實驗

EGCG標準溶液的配制:稱取1.000g的EGCG，用超純水將其溶解并定容在1L的容量瓶中，配制成質量濃度為1.000mg/mL的標準溶液。

分別將 EGCG 標準溶液置于 4、20、40、60、80 和100℃水浴下處理不同時間。處理完畢后的溶液，用0.45μm的水相濾頭進行過濾，用HPLC檢測EGCG、GCG和GA的含量變化。

HPLC分析條件:色譜柱為Phenomenex Synergi4u Fusion－PR 80A(250 mm×4.60 mm);流動相A為1%的乙酸;流動相B為純乙腈;流動相B的線性梯度變化0～20 min為10%～13%，21～40min為13%～30%，41 min回到10%;流速1.2mL/min;進樣體積5μL;檢測波長280 nm。

1.2.2 EGCG降解、異構化和脫沒食子化的動力學模型建立

利用Excel軟件和DPS處理系統，對不同熱處理條件下反應溶液中殘留的EGCG、產生的GCG和GA的含量進行回歸分析，確定反應的級數，計算反應速率常數K，并計算反應活化能Ea及Arrhenius方程。

1.2.3 預測模型的驗證和評價

為了驗證建立的預測模型的準確性，將在60℃(333K)和100℃(373K)條件下分別處理240 min和120 min后檢測反應溶液的EGCG、GCG和GA的實際含量與模型預測的結果進行了比較。

2 結果與分析

2.1 熱處理條件下EGCG的變化

在熱處理條件下，EGCG可能發生降解或水解、自動氧化、異構化和脫沒食子化反應(圖1)，EGCG自動氧化的產物為水溶性的有色物質。雖然從20世紀50年代至今，研究者對兒茶素的酶促和非酶促氧化產物進行了大量研究［17］，但在現有的檢測條件下仍然難以對其定量分析。

Philip Coggon研究表明［18］，在茶多酚氧化酶作用下，約有2%被氧化的EGCG發生脫沒食子酸化作用，產生三策啶(tricetinidin)和自由的沒食子酸(GA)，即發生氧化脫沒食子酸化作用(oxidative degallation)。另外，在微生物單寧酶作用下，EGCG還被水解為EGC和 GA［19－20］，而在茶樹中也發現了類似的水解酶(文章待發表)。圖2結果顯示，在熱處理條件下，隨著EGCG的下降，有GA的產生，但沒有EGC的出現。其中的GA是來自于EGCG水解還是氧化作用有待進一步確定。

圖1 熱處理條件下EGCG的變化

有許多資料表明，綠茶中的一些表兒茶素的異構體(epicatechin epimers)來自于加工過程的熱處理作用［6，8，10］，圖2結果顯示，隨著 EGCG 明顯的減少，而其異構體GCG明顯增加。

圖2 熱處理前(A)后(B)EGCG溶液的HPLC色譜圖(100℃，120min)

2.2 熱處理條件下EGCG的降解

圖3 熱處理條件下EGCG的降解(A，40～100℃;B，4～20℃)

圖3中可以發現，隨著熱處理溫度的增加，EGCG下降明顯加速，置于4℃條件下的溶液，其EGCG降解緩慢，至20天時只降低降8.802%，而在100℃下僅處理10 min就下降了8.264%。

2.3 熱處理條件下EGCG的異構化

從圖4中可以發現，與EGCG變化相反，隨著熱處理溫度的增加，EGCG的異構體GCG呈顯著上升趨勢，當溫度較低時(4℃、40℃)，GCG的生成較緩慢，異構的量在反應20 d和12 h時分別只能達到0.490 8%、2.446%左右;當溫度是 60、80℃時，GCG的生成量顯著增加，分別反應10和6 h時可以達到10.53%、23.04%;當溫度是100℃時，發現GCG的量大量增加，異構量在反應120 min時可以達到56.08%。試驗表明，隨溫度的升高，EGCG異構化越顯著，反應越迅速。

圖4 熱處理條件下EGCG的異構化(A，40～100℃;B，4～20℃)

2.4 熱處理條件下EGCG的脫沒食子化

從圖5中可以發現，隨著熱處理溫度的增加，GA的生成呈現上升趨勢，當溫度較低時(4、40℃)，EGCG的脫沒食子酸的量比較少，且隨時間的延長不會大量的增加。GA的量在反應20 d和12 h時分別只能達到0.402 3%、0.650 5%;當溫度是60、80℃時，發現GA的量有顯著增加，GA的量在反應10 h和6 h時可以達到5.424%、4.996%;當溫度是100℃時，GA的量在反應120 min時能夠達到9.547%。結果表明，隨著溫度的升高，EGCG發生脫沒食子酸的反應幾率越大。

圖5 熱處理條件下EGCG的脫沒食子化(A，40～100℃;B，4～20℃)

2.5 熱處理條件下EGCG變化的動力學模型

Labuza指出，在食品加工和儲藏過程中，大多數與食品質量有關的品質變化都遵循零級或一級反應動力學規律［21］。Wang等指出在(25～100℃)時，EGCG的降解和異構都遵循一級反應動力學和Arrhenius方程［22］，即

式中:t為反應物反應的時間(min);A為反應物反應后的摩爾濃度;A0為反應物反應前的摩爾濃度;K為反應的反應速率常數(min－1)。

式中:K為反應的速率常數;Ea為反應的活化能(kJ/mol);A為頻率因子;T為絕對溫度(K);R為氣體常數(8.3144×10－3kJ/mol);A和Ea都是與反應體系物質本性有關的經驗常數。而反應速率常數K是溫度的函數。

根據上述公式，對不同熱處理下的ln(A/A0)對熱處理時間t作圖，可以得到一條斜率為反應速率常數K的直線。A0和A分別為熱處理前后體系中的EGCG、GCG和GA的摩爾濃度，K為EGCG的降解、異構和脫沒食子酸反應的速率常數(表1)。根據不同熱處理下的反應速率常數K，用lnK對熱力學溫度的倒數(1/T)作圖可以得到一條斜率為－Ea/R的直線，由此可以得到Arrhenius方程中的活化能Ea和頻率因子A(表1)。

表1 熱處理條件下EGCG變化的動力學模型參數

從表1結果可以看出，各熱處理方程的線性關系良好(R2＞0.9)，表明回歸方程具有較高的擬合度，反應屬于一級反應動力學反應機理;EGCG的降解、異構和脫沒食子酸反應速率常數K均隨著溫度的升高而增加的，即隨著處理溫度的升高，各反應的速率增大;EGCG降解反應的活化能最低、而EGCG異構化反應的活化能最高，說明不同反應對溫度的敏感程度有差異，EGCG的降解反應最易發生，而異構反應最難發生;由各個反應的活化能Ea，再根據式(1)得到EGCG降解反應的預測模型A=A0e－kt。和EGCG異構和脫沒食子酸反應的預測模型A=A0ekt。

其中:t為EGCG反應液處理的時間(min);A為EGCG反應溶液反應后其中殘留的EGCG、產生的GCG和GA的含量的摩爾濃度(mmol/L);A0為EGCG反應溶液反應前其中EGCG、GCG和GA的摩爾濃度(mmol/L);K為分別為EGCG降解、異構和脫沒食子酸反應的速率常數(min－1)。

2.6 預測模型的驗證和評價

為了驗證2.5建立的預測模型的準確性，將在60℃和100℃條件下分別處理240 min和120 min后反應溶液的EGCG、GCG和GA的實際含量與模型預測的結果進行了比較(表2)，結果表明實際含量和預測值的相對誤差均在13%以內，因此利用本文建立的模型可以快速、可靠、實時地預測EGCG的變化。

表2 EGCG熱處理的預測值和實驗值的比較

3 結論和討論

在茶葉加工制作或茶飲料的儲存過程中，兒茶素是不穩定的，易發生降解、氧化和異構化反應，從而影響其商品價值［23－24］。已經有許多這些方面研究，并從化學動力學角度進行討論，其中的關注點多集中在兒茶素的氧化機理上［25－27］。實際上，除了氧化聚合外，在茶葉加工或茶飲料的儲存過程中，兒茶素的變化是復雜的，同時進行多方面的反應，目前尚沒有建立化學動力學模型來應用于兒茶素的降解、氧化和異構化等反應。故利用化學動力學模型，綜合考慮環境因素對兒茶素降解、氧化和異構化等反應的影響，才能正確理解兒茶素的變化，并判斷其穩定性差的問題。

與Rong Wang的研究結果相似的是［12］，本研究發現，在不同熱處理條件下，EGCG的降解、異構化和脫沒食子化反應都遵循一級動力學反應，可以用Arrhenius方程進行擬合;從各反應的反應速率常數K和活化能Ea看，雖然EGCG的降解、異構化和脫沒食子化反應，隨著處理溫度的升高，各反應速率都增大，但不同反應對溫度的敏感程度有差異，EGCG降解最易發生，而異構化最難。由此推測，茶葉生產加工貯藏過程中，避免過高溫度即可降低異構化。但由于EGCG降解的活化能較低，僅僅依靠降低溫度的措施較難維持兒茶素的穩定性是不夠的，所以需要結合食品級的添加劑或除氧等相關措施來控制緩解兒茶素在低溫時的降解反應。

由于EGCG的氧化產物比較復雜，無法進行定量分析，故本研究無法計算EGCG氧化反應的活化能，并判斷EGCG氧化反應發生的難易程度。因此，如何快速準確定量EGCG的氧化產物，是今后研究的重點。

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Kinetics Study on EGCG Changes During Thermal Processing

Wu Ping，Xia Tao，Gao Li-ping，Dai Qian-ying，Wang Yun-sheng，Li Zhao
(Kdy Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology Ministry of Education，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

This paper studied the variation of degradation，epimerization and de-gallate acid reaction of Epigallocatechin Gallate(EGCG)under the conditions of different heat treatment(4～100℃)by using the Arrhenius equation，and established the related kinetic predicting model.The results showed that the degradation，epimerization and de-gallate acid reaction of EGCG complied with the first order reaction during heat treatment，the Arrhenius equation was able to be used to fit(R2＞ 0.9)，the rate constants went up as the temperature raised.The Ea(activation energy)and A(frequency factor)in prediction model were 53.90kJ/mol and 5.698 × 104，98.60kJ/mol and 7.315 ×1012，85.34kJ/mol and 5.112 × 1010，respectively，which indicating that the degradation of EGCG was the most easily reaction，and epimerization of EGCG was the most difficult reaction;the relative error of the model predicted value and actual value was less than 13%.Therefore，the changes of EGCG was able to be predicted according to Arrhenius equation under the condition of heat treatment.

EGCG，degradation，epimerization，de-gallate acid，kinetics model

碩士研究生(夏濤教授為通訊作者，E-mail:xiatao62@126.com)。

*教育部重點科技項目(02067)和安徽省人才基金項目資助內容

2010－06－11，改回日期:2010－09－13