裙帶菜酸性多糖的分離純化與鑒定*

錢垂文，張志東，王一飛

1(暨南大學生物醫藥研究開發基地，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學第一附屬醫院，廣東廣州，510632)

裙帶菜酸性多糖的分離純化與鑒定*

錢垂文1，張志東2，王一飛1

1(暨南大學生物醫藥研究開發基地，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學第一附屬醫院，廣東廣州，510632)

利用水煮法及乙醇分級沉淀獲得裙帶菜粗多糖(UPPS-2)，粗多糖經DEAE離子交換層析獲得2個純化組分(UPPS-2.1、UPPS-2.2)。對UPPS-2.1、UPPS-2.2樣品進行了系列的理化特性鑒定(包括分子質量、糖含量、蛋白含量、硫酸基含量、葡萄糖醛酸含量、單糖組成及含量、糖苷鍵構型等)。試驗結果表明:UPPS-2.1、UPPS-2.2的相對分子質量分別為1.5×105、9.4×104;糖含量分別為27.49%、31.06%;蛋白含量分別為0.00%、1.14%;硫酸基含量分別為16.90%、26.33%;二者的單糖組成相同(包括海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖)，但組成單糖的含量差異較大，前者以巖藻糖(85.78%為主，而后者主要以巖藻糖(35.93%)和甘露糖(55.76%)為主;紅外光譜測定結果表明，二者均具有多糖特征吸收峰，糖苷鍵構型主要為β-糖苷鍵。經純化后獲得多糖組分UPPS-2.1是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻聚糖為主的雜多糖硫酸酯，而UPPS-2.1則是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻糖和甘露糖組成的雜多糖硫酸酯。

裙帶菜，多糖，純化，鑒定

裙帶菜(Undaria pinnatifida(Harv.)Suringar)屬褐藻門裙帶菜屬，是一種溫帶性多年生大型褐藻，主要分布在日本、朝鮮半島和我國大連、青島沿海。我國產裙帶菜主要作為食材出口到日本，年產值約10億元。由于出口國單一，國內消費市場尚未形成，產品不能進行深加工，附加值低，價格逐年下降。

裙帶菜營養豐富，被譽為“天然海洋蔬菜之首”，具有重要的營養價值和保健功能，同時在藥物研發方面也顯示出潛在的開發前景［1－3］。裙帶菜中含有多種營養成分，據初步分析100 g干品中含粗蛋白11.6 g，脂肪 0.32 g，糖類 37.81 g，灰分 18.93 g，還含有多種維生素，其中糖類是裙帶菜中重要組成成分。目前國內外對裙帶菜多糖的提取工藝研究報道較多，由于多糖成分、結構復雜，對其理化性質深入研究的很少。本文利用現代先進儀器設備及經典檢測方法對裙帶菜多糖的理化性質作了一個較為全面的研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

新鮮裙帶菜，產自大連海域(5月份)。

DEAE-Cellulose 52離子交換樹脂(Whatman公司進口分裝)，標準單糖、苯酚、三氟乙酸、咔唑、硫酸銅、酒石酸鈉等試劑，均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 裙帶菜多糖的分離純化［4］

1.2.1.1 裙帶菜多糖的初步純化

用自來水將裙帶菜洗凈→蒸餾水洗2次→50℃烘干→粉碎→加熱浸提(攪拌)→離心取清液→加熱濃縮(原體積的1/8)→乙醇沉淀(含醇量達75%)→4℃靜置12 h→離心取沉淀→50℃干燥→粗多糖干品(UPPS-0)→將粗多糖加水復溶→加入乙醇至醇含量達20%→4℃靜置12 h→離心→沉淀依次用丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌，50℃干燥得褐藻膠(UPPS-1)→上清繼續加入乙醇至醇含量達60%→4℃靜置12 h→離心→沉淀依次用丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌，50℃干燥得裙帶菜多糖初品(UPPS-2)

1.2.1.2 裙帶菜多糖的精純(DEAE離子交換層析)

裝柱:將活化后的DEAE-cellulose 52離子交換填料裝填柱型為26cm×20cm層析柱(柱床高度為15cm)。

平衡:用20mmol/L的 Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床3個柱床體積。

上樣:稱取UPPS-2(多糖初品)100 mg用15mL 20mmol/L的Tris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上樣。

洗脫:依次用 20mmol/L的 Tris-HCl液及用20mmol/L 的 Tris-HCl溶液配成的含 0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl溶液洗脫。

收集:用Waters自動收集儀收集，每管10mL，每組收30管。收集液用苯酚-硫酸顯色法跟蹤檢測多糖，在波長為490nm處測定吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內的洗脫液合并，真空旋轉蒸發濃縮，蒸餾水透析2天，冷凍干燥，得到裙帶菜多糖的精純產物。

1.2.2 裙帶菜多糖的鑒定

1.2.2.1 多糖相對分子量的測定［5］

1.2.2.2 多糖樣品中總糖含量測定［6］

1.2.2.3 多糖的樣品中蛋白質含量的測定(Lowry法)［7］

選用核酸蛋白測定儀(美國Beckman公司)。

1.2.2.4 多糖紫外光譜分析［8］

所用紫外分光光度計為日本島津公司UV-1700型。

1.2.2.5 多糖樣品中總硫酸基含量的測定［9］

1.2.2.6 多糖樣品中葡萄糖醛酸含量的測定——硫酸-咔唑法［10］

1.2.2.7 裙帶菜多糖的單糖組成

(1)利用高效離子色譜分析單糖組分［11－12］。離子色譜儀(美國戴安公司TCS-2500型)，色譜條件:分離柱采用Dionex公司Carbo PacTMPA10預處理柱、Carbo PacTMPA10(2.0 mm×250 mm)檢測柱;脈沖安培檢測器工作參數:E1為100 mV，400 ms;E2為－2 000 mV，20 ms;E3為600 mV，10 ms;E4為－100 mV，70 ms。流動相:采用濃度為20 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗。流速:0.25mL/min;上樣量:25μL;溫度 30℃。

(2)薄層色譜(TLC)分析［13］。

1.2.2.8 裙帶菜多糖的結構分析

(1)紅外光譜測定多糖的糖苷鍵構型［14］。取裙帶菜多糖樣品各2 mg，與100～200 mg KBr混合于瑪瑙研缽中研細，壓片，在紅外光譜儀(德國BRUKER EQUINOX55型)上作全波段(4 000～400cm－1)掃描。

(2)比旋光度法［15］。分別稱取多糖各10 mg，蒸餾水溶解并定容至25mL，T=20℃，以數顯自動旋光儀型(上海WZZ-2A型)測定多糖旋光度，以蒸餾水為空白。

2 結果與討論

2.1 裙帶菜多糖的純化結果

裙帶菜多糖UPPS-2經DEAE-Cellulose52離子交換柱層析，洗脫曲線如圖1。

圖1 多糖UPPS-2在DEAE-52層析柱上的洗脫曲線

通過苯酚-硫酸法檢測顯示在第76、102管(即380、510 min)分別出現吸收峰值，對應洗脫條件為0.3、0.5mol/L NaCl溶液。分別合并72～82管，99～107管，得到UPPS-2.1、UPPS-2.2兩個組分，經凍干后，UPPS-2.1為白色纖維狀，質量43.7 mg;UPPS-2.2為淺黃色纖維狀，質量9.8 mg，離子交換層析的產率分別為43.7%及9.8%。

2.2 裙帶菜多糖的鑒定結果

2.2.1 裙帶菜多糖的理性特性

UPPS-2及UPPS-2.1、UPPS-2.2純化組分的部分理化特性多糖結果見表1。

表1 裙帶菜多糖鑒定(部分)結果

2.2.2 多糖的紫外吸收光譜圖

由圖2～圖4可見，3種多糖的紫外吸收圖譜與Lowry法所測蛋白質含量的結果一致。

2.2.3 裙帶菜多糖的單糖組成

2.2.3.1 離子色譜分析

保留時間(min):1，海藻糖(Fuc)4.87;2，鼠李糖(Rha)8.08;3，阿拉伯糖(Ara)9.08;4，半乳糖(Gal)11.40;5，葡萄糖(Glu)12.52;6，甘露糖(Man)/木糖(Xyl)14.30。

圖2 UPPS-2的紫外光譜圖

圖3 UPPS-2.1的紫外光譜圖

圖4 UPPS-2.2的紫外光譜圖

圖5 各標準單糖的離子色譜圖

圖6 UPPS-2.1的離子色譜圖

圖7 UPPS-2.2的離子色譜圖

將裙帶菜多糖UPPS-2.1/UPPS-2.2的單糖組成高效粒子色譜圖與標準單糖的高效離子色譜圖進行比對確定其單糖組成，同時對各峰面積進行定量計算確定各單糖組成的相對含量，結果見表2。

表2 純化樣品 UPPS-2.1、UPPS-2.2中單糖的組成及相對百分比

2.2.3.2 薄層色譜(TLC)分析

對UPPS-2.1和UPPS-2.2進行薄層層析分析其單糖組成，結果如圖8所示。

根據UPPS-2.1和UPPS-2.2的Rf值推斷其單糖組成結果與離子色譜結果基本一致，唯一不同的是2種多糖均檢出葡萄糖醛酸，而在離子色譜中未檢出，推測可能因為葡萄糖醛酸的洗脫時間太短，離子色譜未能檢出。

2.2.4 裙帶菜多糖的結構分析

2.2.4.1 紅外光譜測定多糖的糖苷鍵構型［16－17］

UPPS-2.1、UPPS-2.2紅外吸收光譜經查標準圖譜［19］得各多糖紅外光譜解析結果，具體結果見表3。

圖8 UPPS-2.1、UPPS-2.2的薄層色譜圖

表3 UPPS-2.1、UPPS-2.2紅外吸收光譜解析

由表3中可以看出，UPPS-2.1、UPPS-2.2均含有多糖的特征吸收峰，其中3 600～3 200cm－1和1 400～1 200cm－1的2組特征吸收峰是判斷多糖的依據;810cm－1附近為甘露糖的特征吸收峰，它的位置與硫酸根在糖上的連接位置有關，吸收峰位于817.76cm－1及 817.67cm－1說明 UPPS-2.1、UPPS-2.2 的硫酸根連接在巖藻糖的 C2或 C3位;UPPS-2.2在1 243.53cm－1處有較強的吸收峰，表明其硫酸基含量較高。綜合上述結果，可見二種多糖均為巖藻甘露吡喃聚糖，主要由β-糖苷鍵組成。

2.2.4.2 比旋光度法

裙帶菜多糖UPPS-2.1的比旋光度［α］為－75，UPPS-2.2的比旋光度［α］為－37.5。由于UPPS-2.1與UPPS-2.2的比旋光度都為較大的負值，可以判定它們都是主要以β-糖苷鍵連接的，這與紅外光譜測定的結果相一致。

由于多糖結構的復雜性(特別是空間結構的復雜性)，限于目前的研究手段和方法，還無法對其結構做出精確的解析。本課題的研究，為裙帶菜多糖的綜合開發打下良好的實驗基礎。

3 結論

經分離純化獲得兩種多糖中，UPPS-2.1產率較高，相對分子質量為1.5×105，經組成與結構分析，確定其是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻聚糖為主的雜多糖硫酸酯;而UPPS-2.2產率相對較低(9.8%)，相對分子量為9.4×104，組成與結構和UPPS-2.1基本相同，是主要由巖藻糖和甘露糖組成的雜多糖硫酸酯，多糖的硫酸基連接在巖藻糖的C2或C3位上。

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Purification and Identification of Acid Polysaccharide from Undaria pinnatifida

Qian Chui-wen1，Zhang Zhi-dong2，Wang Yi-fei1
1(Jinan Biomedicine Research and Development Center，Jinan University，Guangzhou 510632，China)2(The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To isolate and identify the acid polysaccharides from Undraria pinnatifida.Methods:Crude polysaccharides were extracted by alcohol grade precipitation from boiled Undraria pinnatifida solvent，then the crude polysaccharides were seperated by DEAE-Cellulose 52 chromatography.Two fractions obtained after elution were named UPPS-2.1 and UPPS-2.2.The physicochemical properties of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 were studied including molecular weight，percentage of total sugar，protein，sulfate，and composition of monosaccharides，patterns of glucosidic bond.Results:The molecular weight of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was 1.5 ×105，9.4 ×104respectively，the percentage of total sugar was 27.49%，31.06%，the percentage of protein was 0.00%，1.14%，the percentage of sulfate wa 16.90%，26.33%in UPPS-2.1 and UPPS-2.2 respectively.Monosaccharide composition of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was same，but the percentage of monosaccharides was different by ion chromatography.The purified polysaccharides is mainly composed of β-glucosidic bonds.The main monosackcharide of the UPPS-2.1 was Fuc(85.78%)，whereas in UPPS-2.2 were Fuc(35.93%)and Man/Xyl(55.76%).The SO42－of polysaccharides is link up with C2 or C3 in Fuc.Conclusion:The UPPS-2.1 was mainly composed of Fuc sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.Whereas the UPPS-2.2 was mainly composed of Fuc and Man/Xyl sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.

Undaria pinnatifida，polysaccharide，purification，identification

博士研究生，助理研究員(王一飛教授為通訊作者E-mail:twangyf@jnu.edu.cn)。

*國家自然科學基金廣東聯合基金(U0632010);廣州市天河區科技計劃項目(072G111)基金資助

2010－03－10，改回日期:2010－10－28