超臨界CO2流體提取復方川芎丹參中的有效成分*

張偉，丘泰球

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

超臨界CO2流體提取復方川芎丹參中的有效成分*

張偉，丘泰球

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

通過設計單因素和正交試驗，利用高效液相色譜法(HPLC)測定復方川芎丹參中阿魏酸、川芎嗪和丹參IIA等多指標的含量進行綜合評分，優選出復方川芎丹參中有效成分超臨界CO2最佳提取工藝條件。結果表明:超臨界CO2萃取法提取復方川芎丹參中有效成分的適宜工藝條件是，提取壓力20 MPa，提取溫度55℃，原料粒度為24目，夾帶劑用量為0.75 mL/g。在這一條件下，阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA的提取率分別可達到125.74μg/g(RSD=0.84%)、61.68μg/g(RSD=1.23%)和 131.31μg/g(RSD=0.81%)。

超臨界CO2提取，高效液相色譜法(HPLC)，多指標綜合評分法，阿魏酸，川芎嗪，丹參酮IIA

中藥川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)是傘形科藁本屬植物，具有活血行氣，祛風止痛之功效。中藥丹參是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根，具有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩之功效［1］。川芎中主要藥效成分有川芎嗪、阿魏酸、苯酞類物質［2］等，丹參中主要功效成分主要是丹參酮IIA、丹酚酸［3］等。川芎配伍丹參使二者的藥效有相互協同作用［4］。

超臨界 CO2萃取技術已經廣泛用于精油［5－9］、抗氧化劑［10］、色素［11］、醫藥品［12－13］、殺蟲劑［14－16］等物質的提取中，是一種無毒的綠色提取技術［17］。本文利用超臨界CO2萃取技術提取復方川芎丹參中的有效成分，通過設計正交試驗方案，以測定阿魏酸、川芎嗪及丹參酮IIA多指標的含量，用綜合評分法優選出其提取工藝。

1 材料、試劑和設備

1.1 實驗材料、試劑

川芎、丹參(廣州南北行中藥飲片有限公司，產地四川，質量標準符合《中華人民共和國藥典》);阿魏酸對照品、鹽酸川芎嗪對照品、丹參酮IIA對照品

≥98%)，西安慈緣生化科技有限公司;甲醇(色譜純)，江蘇永華精細化學品有限公司;冰醋酸(分析純)，成都市聯合化工試劑研究所;蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司;CO2(質量分數99.9%)，廣州市卓正氣體有限公司。

1.2 實驗設備

HL－5L/50 MPa-ⅡB型超臨界萃取裝置，杭州華黎泵業有限公司;Dionex高效液相色譜系統(配有P680高壓泵，ASI－100自動進樣器，PDA-100光電二極管陣列檢測器)，美國戴安公司;旋轉蒸發儀(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠;精密電子天平(FA2004)，上海精科儀器廠。

2 實驗方法

2.1 超臨界CO2萃取復方川芎丹參有效成分單因素試驗

通過預實驗，發現原料粒度、提取壓力、提取溫度、提取時間、分離釜壓力和溫度等因素對復方川芎丹參有效成分提取的得率都有影響，并且在使用無水乙醇作為夾帶劑時，可以顯著提高有效成分的得率及縮短提取時間，所以選取原料粒度、提取壓力、提取溫度、提取時間和夾帶劑用量作為考察因素，分離釜I、II的壓力分別設為 6、5 MPa，溫度分別為 35、30℃，以藥物浸膏得率為指標，初步考察各因素對復方川芎丹參有效成分提取的影響。

2.1.1 原料粒度的影響

將川芎和丹參分別粉碎，選取粒徑為12目、24目、40目、60目、80目的川芎和丹參，分別稱取每一粒徑的川芎和丹參各100 g，混合均勻，放入萃取釜進行提取，提取壓力20 MPa、提取溫度50℃、提取時間1.5 h，夾帶劑用量200 mL。將提取物減壓蒸除夾帶劑，稱重，計算浸膏得率。

2.1.2 提取壓力的影響

分別稱取100 g粉碎過40目篩的川芎和丹參粉末，混合均勻，放入萃取釜中，分別在10、15、20、25 和

表1 因素水平表

2.3 HPLC測定阿魏酸、川芎嗪含量方法［18－19］

2.3.1 色譜條件

色譜柱:DIONEX C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm);流動相:甲醇-1%冰醋酸(體積比90∶10);檢測波長280 nm，流速:1 mL/min;柱溫:35℃，進樣量:10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取阿魏酸對照品11 mg、鹽酸川芎嗪對照品5 mg，分別用甲醇溶于5 mL容量量瓶中，定容(濃度分別為2.2和1.0mg/mL)，制成阿魏酸對照品和鹽酸川芎嗪對照品儲備液，各精密吸取1mL，加入到一個10 mL的容量瓶中，甲醇定容，制成阿魏酸和川芎嗪的混合標準品溶液(濃度分別為0.22和0.1mg/mL)。

2.3.3 線性關系

將制備好的阿魏酸和川芎嗪的混合標準品溶液用 0.22μm 微孔濾膜過濾，準確進樣 2、5、10、15、20μL，按2.2.1所述方法測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到阿魏酸和川芎嗪的回歸方程分別為y=10.644x－8.589 4，R2=0.999 9;y=3.998 4x－7.324 5，R2=0.989。結果表明，阿魏酸和鹽酸川芎嗪進樣量分別在0.44～4.4 μg和0.2～2 μg內呈良好線性關系。

2.4 HPLC測定丹參酮ⅡA含量方法［20］

2.4.1 色譜條件

色譜柱:DIONEX C18柱(250 mm×4.6mm 5μm);流動相:甲醇-水(體積比 70∶30);檢測波長265 nm，流速:1 mL/min;柱溫:35℃，進樣量:10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備

精密稱取丹參酮IIA對照品5 mg于50 mL容量瓶中，制成丹參酮IIA對照品儲備液(濃度為0.1 mg/mL)。

2.4.3 線性關系

將制備好的丹參酮IIA對照品儲備液用0.22μm微孔濾膜過濾，準確進樣 2、5、10、15、20μL，按 2.3.1方法測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到丹參酮IIA回歸方程分別為y=8.827 2x－1.725 3，R2=0.999。結果表明，丹參酮ⅡA進樣量在0.2～2 μg內呈良好線性關系。

2.5 樣品溶液的測定

將超臨界CO2提取復方川芎丹參所得的提取物減壓蒸餾，除去夾帶劑，用甲醇溶解轉移至25 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，制成樣品儲備液。精密吸取樣品儲備液1 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容，制成樣品溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，準確進樣10μL，按2.3.1和2.4.1所述方法分別測定其中阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA的含量。

3 結果與分析

3.1 單因素結果30 MPa壓力下進行提取，提取溫度50℃，其他條件同2.1.1。將提取物減壓蒸除夾帶劑，稱重，計算浸膏得率。

2.1.3 提取溫度的影響

分別稱取100 g粉碎過40目篩的川芎和丹參粉末，混合均勻，放入萃取釜中，分別在 30、40、50、60 和70℃的提取溫度在進行提取，提取壓力20 MPa，其他條件同2.1.1。將提取物減壓蒸除夾帶劑，稱重，計算浸膏得率。

2.1.4 提取時間的影響

分別稱取100 g粉碎過40目篩的川芎和丹參粉末，混合均勻，放入萃取釜中分別提取0.5、1、1.5、2.0和2.5 h，其他條件同2.1.1。將提取物減壓蒸除夾帶劑，稱重，計算浸膏得率。

2.1.5 夾帶劑用量的影響

分別稱取100 g粉碎過40目篩的川芎和丹參粉末，混合均勻，放入萃取釜中，分別按 0.25、0.5、0.75、1.0和1.25 mL/g加入夾帶劑無水乙醇進行提取，其他條件同2.1.1。將提取物減壓蒸除夾帶劑，稱重，計算浸膏得率。

2.2 超臨界CO2萃取復方川芎丹參有效成分正交試驗

在單因素實驗基礎上，按表1設計提取試驗的因素水平表。選L9(34)正交表對復方川芎丹參有效成分進行超臨界萃取。分別稱取100g粉碎過篩的川芎和丹參藥材，混合均勻，放入超臨界CO2萃取裝置中萃取2 h，利用HPLC法測定萃取物中阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA的含量。以阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA含量為評價指標，采用綜合評分法進行數據分析(其權重系數分別為阿魏酸:0.35，川芎嗪:0.35，丹參酮IIA:0.3)。

3.1.1 原料粒度的影響

圖1 原料粒度對復方川芎丹參浸膏得率的影響

從圖1中可以看出，在粒度＜60目，復方川芎丹參浸膏的得率隨著原料粒徑的減小而增大，而當粒度上升到80目時，浸膏的得率呈下降趨勢。這是因為在一定范圍內，原料的粒徑變小，細胞壁被破壞的程度增大，整個原料的顆粒被溶劑浸潤的時間縮短，有效成分溶劑化的速度和擴散速度則自然加快，同時粒徑減小也增加了超臨界CO2與原料的接觸面積和提取通道，從而有利于提高提取率，但并不是原料的粒徑越小越好，原料過細，雖然此時對原料細胞壁的破壞更加徹底，但卻增加了原料的堆積密度，通透性變差，致使超臨界CO2只能沿著阻力小的線路穿過料層，形成許多針孔，使提取顯著不均勻。同時，顆粒太細，不僅會導致流路堵塞，使提取柱柱壓過高，而且還會造成原料結塊，提取不利，因此，提取過程中原料的粒徑應該適當，故選擇顆粒粒徑為40～60目。

3.1.2 提取壓力的影響

圖2 提取壓力對復方川芎丹參浸膏得率的影響

從圖2中可以看出，隨著提取壓力的增大，復方川芎丹參浸膏得率也增大，這是因為提取壓力的升高意味著超臨界CO2密度的增加。當壓力超過20 MPa后，再增大萃取壓力，浸膏得率增加的速度已經放緩。雖然提取壓力越大，浸膏得率越高，然而壓力增加，生產成本也增加，而且壓力過高還會增加不安全因素，因此最終選擇提取壓力為20 MPa。

3.1.3 提取溫度的影響

圖3 提取溫度對復方川芎丹參浸膏得率的影響

從圖3中可以看出，當提取溫度從30℃升高50℃時，復方川芎丹參浸膏得率呈上升趨勢，當提取溫度＞50℃后浸膏得率呈下降趨勢。這是因為溫度對萃取效果的影響主要體現在2個方面:(1)溫度升高時，溶質的蒸汽壓升高，且分子熱運動加快，擴散性加強，因此增強了傳質;(2)在一定壓力下升高溫度，萃取劑CO2的密度降低，溶解能力下降。因此，提取溫度選擇40～50℃較為合適。

3.1.4 提取時間的影響

圖4 提取時間對復方川芎丹參浸膏得率的影響

圖4 結果表明，隨著提取時間的延長，浸膏得率也相應的增加，但其浸膏得率的曲線斜率是逐漸減小的，以至最后趨于平緩。從工藝和生產而言，也不應用延長時間來提高生產率。因此較佳提取時間為1.5 ～2 h。

3.1.5 夾帶劑用量的影響

圖5 夾帶劑用量對復方川芎丹參浸膏得率的影響

圖5結果表明，復方川芎丹參浸膏得率隨著夾帶劑用量的增大而迅速增大，但當萃取劑用量＞1.0 mL/g后，夾帶劑用量的增加對萃取率的增強效果已經開始放緩，因此選擇夾帶劑用量為0.75～1.0 mL/g。

超臨界CO2是非極性物質，當提取阿魏酸等極性物質時，需要在高壓下才能使之溶解，且效果不明顯。乙醇無毒，是功能食品及藥物加工過程中唯一允許使用的有機試劑，通過引入無水乙醇作為夾帶劑，不單可以增加超臨界流體的密度，而且其分子質量小，在基體中擴散、滲透能力強，能夠與溶質發生氫鍵締合作用，促使其脫離基體，提高超臨界流體的溶解效果，因此在加入了夾帶劑后，極大地提高了極性物質的提取效果。

3.2 正交試驗結果和極差分析

表2 正交試驗結果

圖6 阿魏酸(1)、川芎嗪(2)對照品HPLC圖

圖7 樣品HPLC圖(1:阿魏酸，2:川芎嗪)

川芎、丹參兩味中藥在中醫臨床上多同時廣泛用于治療心腦血管疾?。?1］，而川芎嗪、阿魏酸和丹參酮ⅡA、丹參素等都是主要的藥效成分［22－23］，根據文獻［23］分別觀察了丹參酮ⅡA、丹參素、川芎嗪和阿魏酸對ADP誘導大鼠和人血小板聚集的影響，4種成分抑制血小板聚集的相互作用類型為協同作用，4種成分的配比關系為24.8、37.6、25.0和25.3 mg/mL。但由于實驗條件和科研經費所限，筆者不能對所有藥效成分一一測定和評定，綜合考慮，在綜合評分中選取川芎嗪、阿魏酸和丹參酮ⅡA3種化合物的權重系數分別為0.35、0.35和0.30。

由正交表可以明顯看出，各因素作用主次為A＞D＞C＞B，即提取壓力＞夾帶劑用量＞原料粒度＞提取溫度。并且最優提取組合為A2B3C1D2，即提取壓力為20 MPa，提取溫度55℃，原料粒度為24目，夾帶劑用量為0.75 mL/g。

3.3 HPLC測定阿魏酸、川芎嗪和丹參IIA含量結果

按2.2.1和2.3.1所述方法和條件進行測定，得到阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA對照品及樣品的HPLC圖(圖6～圖9)。

圖8 丹參酮IIA對照品HPL C圖

圖9 樣品HPLC圖(丹參酮IIA)

4 結論

利用超臨界CO2提取復方川芎丹參中有效成分是一種經濟有效的方法，其最佳提取工藝為提取壓力為20 MPa，提取溫度55℃，原料粒度為24目，夾帶劑用量為0.75 mL/g。在此條件下對復方川芎丹參重復3次提取，對提取物依法測定，得阿魏酸、川芎嗪和丹參酮 IIA提取率分別為 125.74 μg/g(RSD=0.84%)、61.68 μg/g(RSD=1.23%)和 131.31 μg/g(RSD=0.81%)。

本文采用HPLC法對提取物中阿魏酸、川芎嗪和丹參酮IIA等多指標的含量進行測定，這樣能對提取物的質量進行綜合評定。

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Optimization of the Extraction for Effective Ingredients from Ligusticum chuanxiong Hort.and Salvia miltiorrhiza Bge.with Supercritical CO2

Zhang Wei，Qiu Tai-qiu
(College of Light Industry and Food Science，South Univesity of Technology，Guangzhou 510640，China)

To optimize the extraction for effective ingredients from Ligusticum chuanxiong Hort.and Salvia miltiorrhiza Bge.by Supercritical CO2extraction，single factor experiments and orthogonal test，Multi－index comprehensive evaluation were performed.The content of the interest compounds(ferulic acid，tetramethylpyrazine and Tanshinone IIA)was measured by HPLC.It showed that the optimal extraction conditions were:extraction pressure 20 MPa，extraction temperature 55℃，Granularity size of raw materials were 24 mush，solvent dosage 0.75 mL/g.The yield of ferulic acid，tetramethylpyrazine and Tanshinone IIA was 125.74 μg/g(RSD=0.84%)，61.68 μg/g(RSD=1.23%)and 131.31 μg/g(RSD=0.81%)respectively.

supercritical carbon dioxide extraction，high performance liquid chromatography(HPLC)，multi-index comprehensive evaluation，ferulic acid，tetramethylpyrazine，tanshinone IIA

碩士研究生(丘泰球博士為通訊作者，E-mail:tqqiu@scut.edu.cn)。

*廣東省科技計劃項目(2009A030100007)

2010－02－02，改回日期:2010－09－06