煙末蛋白酶解工藝優化的研究

唐 勝，饒國華，陶 紅，趙謀明，*

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣東中煙工業公司技術中心，廣東廣州510145）

煙末蛋白酶解工藝優化的研究

唐 勝1，饒國華2，陶 紅2，趙謀明1，*

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣東中煙工業公司技術中心，廣東廣州510145）

篩選出了適合煙末蛋白酶解的蛋白酶復配組合Acalase2.4L與Flavorzyme500MG。通過單因素實驗及響應面分析法得到最佳酶解條件為：總加酶量10.9‰（以煙末質量計，w/w），酶解時間8h，酶解溫度49℃。該條件下實際測得氨基酸態氮得率為2.270‰，蛋白質回收率為31.88%。

煙末，酶解，響應面分析

煙末是煙葉切絲過程中產生的副產物。我國煙草植物栽培與產量均居世界首位，每年煙葉產量約240萬t，其中約有25%的煙末、煙葉等下腳料不能用于卷煙生產［1］。煙末中含有300多種化合物，包括生物堿、蛋白質、有機酸、甙類、糖類、氨基酸等［2-4］。目前對煙末開發利用有限，大部分被廢棄。將煙末中蛋白質水解成氨基酸，多糖轉化成單糖，利用美拉德反應制備煙用香精是煙末高值化利用的有效途徑［5］。本文利用蛋白酶直接酶解煙末蛋白，相比于酸法、堿法處理具有反應條件溫和且不破壞煙末本身風味物質等優點。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

煙末 由廣東中煙公司提供，為雙喜牌香煙加工過程中產生，蛋白質含量7.00%，40℃烘干，粉碎，過 80目篩；Alcalase2.4L、Protamex、PTN6.0S和Flavorzyme500MG 由丹麥諾維信公司提供；Papain由江門拜奧生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

TIM840自動電位滴定儀 上海摩達科學器材公司；101-3電熱鼓風恒溫干燥箱 上海浦東興榮科學儀器有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙末蛋白酶解工藝 稱取20.0g煙末，溶于100.0g水，加酶水浴振蕩提取，100℃滅酶15min，在4800r/min、常溫條件下離心20min，取上清液，待測。

1.2.2 氨基酸態氮含量的測定 甲醛滴定法［6］。

1.2.3 氨基酸態氮得率的計算 氨基酸態氮得率（‰）=酶解液中總氨基酸態氮/所用煙末總量×1000‰

1.2.4 蛋白質含量的測定 克達爾法［7］。

1.2.5 蛋白質回收率的計算 蛋白質回收率（%）=酶解液中蛋白質的質量/原料中蛋白質的質量×100%

1.2.6 數學模型的建立 分別用五種蛋白酶酶解煙末蛋白，選出氨基酸態氮得率最高的蛋白酶與其余四種1∶1復配，篩選最佳復配組合，用單因素實驗法研究加酶量、酶解時間、酶解溫度對雙酶復配酶解煙末蛋白的影響，采用響應面分析法設計實驗方案，建立數學模型，得出最優工藝條件。

表1 響應面分析因素與水平

2 結果與討論

2.1 蛋白酶雙酶復配組合的篩選

分別采用Alcalase2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S和Flavorzyme500MG酶解煙末蛋白，酶解條件為：加酶量1%，酶解溫度為50±2℃，自然pH。測定各酶解產物的氨基酸態氮得率，結果見圖1。（注：本文中上述蛋白酶在圖中均以簡寫Alc、Pro、Pap、PTN、Fla代替。）

圖1 不同蛋白酶對煙末蛋白酶解效果比較

由圖1可見，五種蛋白酶分別作用于煙末蛋白時，氨基酸態氮得率的變化趨勢大致相同，其中6h到10h氨基酸態氮得率增幅較大，10h到24h氨基酸態氮得率增加緩慢；各蛋白酶不同時間段酶解煙末蛋白的效果不同，酶解10h后，Alcalase2.4L對煙末蛋白酶解效果最好，氨基酸態氮得率為2.190‰。以上說明不同蛋白酶由于酶作用位點的特異性，對煙末蛋白具有不同的酶解能力。

將氨基酸態氮得率最高的Alcalase2.4L與其余四種蛋白酶1∶1復配，對煙末蛋白進行酶解，酶解時間為10h，其余條件與單酶酶解相同。測定各酶解液氨基酸態氮得率，結果見圖2。

圖2 不同蛋白酶復配對煙末蛋白酶解效果比較

由圖2可見，Alcalase2.4L與 Flavorzyme500MG的復配效果最佳，在總加酶量相同的條件下，氨基酸態氮得率比單獨用 Alcalase2.4L酶解提高了11.75%，這可能是由于Alcalase 2.4L是由選育出來的地衣芽孢桿菌生產而得，其主要有效成分枯草桿菌蛋白酶A是一種內切蛋白酶；而Flavorzyme500MG是一種在中性或微酸性條件下酶解蛋白質的真菌蛋白酶和肽酶的復合體，該酶由米曲霉經發酵制得，具有外切蛋白酶活性［8］。許多文獻都報道，將內切蛋白酶與外切蛋白酶結合使用可以提高酶解的效果［8-10］。本實驗結果也表明，將內切蛋白酶Alcalase 2.4L與具有外切蛋白酶活性的Flavorzyme500MG復配可提高對煙末蛋白的酶解效果。

總體上來看，用蛋白酶直接酶解煙末蛋白氨基酸態氮得率不高，這一方面與煙末蛋白本身的結構有關；另一方面是由于煙末中纖維素含量較高，一些蛋白被纖維素包裹住，不利于蛋白酶與底物接觸。

2.2 蛋白酶雙酶復配酶解單因素實驗分析

將Alcalase2.4L與Flavorzyme500MG 1∶1復配對煙末蛋白進行酶解，分別考察加酶量、酶解時間、酶解溫度對酶解的影響。

2.2.1 加酶量對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響 由圖3可見，隨著加酶量的增加，氨基酸態氮得率呈上升趨勢，加酶量達到7‰以后，增加緩慢，這是因為酶進行反應時首先要與底物形成一個中間物，即酶底物復合物。當底物濃度大大超過酶濃度時，反應達到最大速度，如果此時增加酶的濃度，可增加反應速度，酶反應速度與酶濃度成正比關系［11］，在一定的酶解時間內，蛋白質的酶解效率越高，氨基酸態氮得率也越高。但是加酶量達到一定比例時會使底物的酶切位點飽和，繼續提高加酶量并不能有效提高酶解效率，反而有可能導致酶自身相互酶解，導致酶活力降低，影響酶解效率的提高。因此，進一步增大加酶量，氨基酸態氮得率并沒有顯著提高。

圖3 加酶量對煙末蛋白酶解效果的影響

2.2.2 酶解時間對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響由圖4可見，隨著酶解時間的延長，氨基酸態氮得率呈上升趨勢，其中2h到6h氨基酸態氮得率增長較快，由1.823‰提高到2.167‰，酶解6h以后，氨基酸態氮得率增長趨于緩慢，這是因為，隨著酶解反應的進行，底物濃度減小，反應位點逐漸被酶分子飽和，產物濃度增加，其競爭性抑制變強，同時酶活性降低，中間復合物在經歷了初始階段的積累后達到了穩態。

圖4 酶解時間對煙末蛋白酶解效果的影響

2.2.3 酶解溫度對雙酶酶解煙末蛋白效果的影響由圖5可見，隨著溫度的升高，氨基酸態氮得率先增加后減小，當溫度升到50℃時，氨基酸態氮得率達到最大，這是因為溫度對酶反應的影響是雙重的：隨著溫度的增加，反應速度也增加，直至最大速度為止；隨著溫度升高而酶逐步變性，即通過減少有活性的酶而降低酶的反應速度。在一定條件下每一種酶在某一溫度下才表現最大的活力，這個溫度稱為該酶的最適溫度，最適溫度是上述溫度對酶反應雙重影響的結果［11］。

表3 回歸方程的方差分析表

圖5 酶解溫度對煙末蛋白酶解效果的影響

2.3 響應面分析以及實驗條件的優化

根據central composite實驗設計原理，綜合單因素實驗所得結果，選取加酶量、酶解時間、酶解溫度三個因素，采用響應面分析法優化提取工藝，其具體實驗方案及結果見表2。

由響應面軟件Design Expert 7.0.0得到的分析結果見表3。

經回歸擬合后，各實驗因子對響應值的影響可通過如下的回歸方程表示：

Y=2.02+0.19A+0.075B-1.292E-003C+ 0.012AB-7.750E-003AC-0.010BC-0.018A2-0.018B2-0.090C2

根據響應面分析法，當“Prob＞F值”小于0.05時，說明模型或因素是顯著的，從結果可知，氨基酸態氮得率數學模型的“Prob＞F值”為0.0055，可見該模型是顯著的，同時由表3可知，模型中A、B、C2是顯著的因素，各因素的交互作用不是很顯著，又因為”Prob＞F值”越小，因素顯著性越高，因此，可得各個因素對氨基酸態氮得率影響的大小順序為：加酶量＞酶解時間＞酶解溫度。

表2 響應面分析實驗方案及結果

根據響應面分析軟件Design-Expert 7.0.0分析，得出煙末蛋白酶解最佳工藝條件是：加酶量10.91‰、酶解時間8.00h、酶解溫度49.03℃，該條件下，氨基酸態氮得率理論值為2.251‰。為進一步檢驗該實驗方法的可靠性，結合實驗室實際條件，選取酶解條件為加酶量10.9‰，酶解時間8h，酶解溫度49℃，進行煙末蛋白酶解實驗，重復實驗三次，實際測得氨基酸態氮得率為2.270‰，驗證實驗結果與理論預測值誤差在1%以內。因此，采用響應面分析法優化得到的提取條件參數準確可靠，具有實用價值。在最優條件下測定蛋白質回收率為31.88%。

3 結論

本文采用五種不同蛋白酶對煙末蛋白進行酶解實驗，選出氨基酸態氮得率最高的Alcalase 2.4L與其余四種蛋白酶 1∶1復配，得到最佳的復配組合Alcalase 2.4L與Flavorzyme500MG，通過單因素實驗研究了加酶量、酶解時間、酶解溫度對酶解的影響，并應用響應面法優化煙末蛋白酶解工藝。結合回歸模型的數學分析得到煙末蛋白酶解最優工藝參數為：加酶量10.9‰、酶解時間8h、酶解溫度49℃，該條件下，氨基酸態氮實際得率為2.270‰，蛋白質回收率為31.88%。

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Study on optimization of enzymatic hydrolysis technology of tobacco powder

TANG Sheng1，RAO Guo-hua2，TAO Hong2，ZHAO Mou-ming1，*
（1.College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Technology Center，China Tobacco Guangdong Industrial Corporation，Guangzhou 510145，China）

Acalase2.4L and Flavorzyme500MG were selected which were suitable for tobacco powder enzymatic hydrolysis.Based on the results of single factor test，the yield response was analyzed using method of response surface analysis.The optimized enzymatic hydrolysis conditions were as follows：total enzyme addition 10.9‰（w/w），enzymatic hydrolysis time 8h，enzymatic hydrolysis temperature 49℃.Under these conditions，the amino acid nitrogen yield could be up to 2.270‰，the protein recovery rate could be up to 31.88%.

tobacco powder；enzymatic hydrolysis；response surface analysis

TS49

B

1002-0306（2011）01-0229-04

2009-11-16 *通訊聯系人

唐勝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

企業橫向課題（粵煙工05XM-QK［2008］-001）；企業橫向課題（粵煙工05XM-QK［2008］第020號）。