半定量RT-PCR檢測副溶血弧菌TLH基因的表達差異

陳 星，潘迎捷，孫曉紅，趙 勇

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

半定量RT-PCR檢測副溶血弧菌TLH基因的表達差異

陳 星，潘迎捷，孫曉紅，趙 勇*

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

副溶血弧菌是廣泛存在于近海區域、鹽湖和海產品中的食源性致病菌，會引起大規模的食物中毒。TLH是副溶血弧菌最主要的毒力因子之一，通過比較tlh的表達量可以間接比較同種菌株在不同應激條件下以及不同菌株之間的毒力差異。本文以在不同條件下培養的三株Vp為材料，分別提取其總RNA，以16S rRNA為內標基因，運用半定量反轉錄—多聚酶鏈反應（RT-PCR）檢測副溶血弧菌不耐熱溶血毒素（tlh）基因在不同應激條件下的表達差異。結果表明，在5%的鹽度下，三株Vp的tlh基因的表達量都高于其他鹽濃度；25℃下，tlh的表達量高于在其他溫度條件下；在三株Vp中，ATCC33846中tlh mRNA的表達量最低，ATCC33847中的表達量最高。

副溶血弧菌，tlh，16S rRNA，RT-PCR，基因表達

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于近海區域、鹽湖及魚、貝類等海產品中，是沿海地區引起食物中毒的重要病原菌，可導致患者出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應，嚴重者可引起敗血癥［1］。近年來，由感染引發的食物中毒已經成為世界范圍內嚴重的食源性公共衛生問題之一，在日本，由該菌引起的食物中毒占全國食物中毒例數的20%～30%；我國國家食源性疾病監測網數據顯示，沿海省份，副溶血弧菌引起的食物中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，已經高居微生物食物中毒首位［2］。為確保食品安全，保護人民身體健康，歐盟、美國等發達國家對水產品中的副溶血性弧菌做出了明確的規定，如歐盟規定副溶血弧菌不得檢出，而美國規定＜l×104/g。我國已將該菌列為主要的檢驗或監測對象。目前，該菌是多數進出口水產品必檢的致病菌之一［3］。目前研究認為副溶血弧菌的主要致病因子是其產生的多種溶血毒素，主要有耐熱的直接溶血毒素（thermostable direct hemolyticus，TDH），相對耐熱的直接溶血毒素（Tdh-related hemolysin，TRH）和不耐熱溶血毒素（themolabile hemolysin，TLH）。國外對TDH和TRH的功能和致病性研究較多，對TLH的研究相對較少，生化實驗表明TLH是一種非典型的磷脂酶，能溶解人和馬的紅細胞［4］，美國Gooch等人根據副溶血弧菌無論是臨床分離株，還是環境分離株都含有TLH基因，并具有種屬特異性的特點，利用TLH基因制備基因探針檢測和監測副溶血弧菌，但目前TLH的功能和致病性仍不清楚［5］。RT-PCR是目前檢測和定量基因表達最敏感和可靠的方法，特別是當組織標本量有限、基因表達量低，以及樣品間表達差異很小的時候［6］。郭麗等人用半定量RT-PCR法分析大鼠不同組織肌肉生長抑制素基因的表達［7］；李勁松等人用一步法提取RNA反轉錄-多聚酶鏈反應檢測漢坦病毒［8］。本文運用RT-PCR法檢測副溶血弧菌不同菌株和同種菌株在不同的生長條件（鹽度、溫度）下tlh基因mRNA表達的差異，研究結果為探討副溶血弧菌tlh基因表達和環境適應性之間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

副 溶 血 弧 菌 ATCC17802、ATCC33846、ATCC33847 均購自中國科學院微生物研究所，三株副溶血弧菌的基因型見表1；RNA提取和RT-PCR及相關試劑如Trizol試劑、瓊脂糖 購自Invitrogen公司；氯仿/異戊醇（24∶1）、異丙醇、無水乙醇、氯仿、焦碳酸二乙酯（DEPC） 購自上海生工生物公司；DnaseI、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthsis Kit、PCR試劑盒等 購自TAKARA公司；NaCl等 購自國藥集團。

表1 三株副溶血弧菌的基因型

1.2 不同培養條件下副溶血弧菌tlh基因表達水平比較

將三株副溶血弧菌 ATCC17802、ATCC33846、ATCC33847接種于含1%NaCl的 TSB培養基中，37℃培養過夜，以10%的比例轉接于1%NaCl的TSB培養基中，37℃培養3h至OD600為0.8，離心沉淀；菌體用不同NaCl濃度（1%、3%、5%、8%、10%）的TSB培養基重懸，37℃繼續培養3h，或者菌體在含1%NaCl的TSB培養基中重懸，分別放在不同溫度下（4、10、20、25、30、37℃）繼續培養3h；離心沉淀，抽提總RNA用于tlh基因轉錄水平差異的檢測。

1.3 總RNA的提取與反轉錄

用經典的Trizol法提取總RNA：取副溶血弧菌菌液1mL于1.5mL離心管中，4℃，12000r/min離心1min；棄上清，菌體用液氮速凍，磨成粉末，把粉末轉到1.5mL離心管中（液氮上操作，保證低溫），加入800μL Trizol，振蕩1min，冰上靜置3min，反復振蕩3次；加入200μL氯仿/異戊醇（24∶1）；12000r/min離心5min；將上清500μL轉入1.5mL離心管中（不要吸取中層物質，否則會有DNA污染），加入與上清等體積的異丙醇（預冷），-20℃放置1h或更長時間（充分沉淀）；12000r/min離心 5min；小心移去上清，用70%的乙醇洗2遍，每次700μL，12000r/min離心3min；小心地盡可能吸走上清，超凈臺上倒置將酒精空干，加入40μL DEPC水溶解；-80℃保存。

總RNA提取后的純化：用無RNase的DNase I處理消除總RNA池中污染的少量DNA。依據DNase I試劑的說明書進行RNA的純化。普通PCR驗證基因組DNA已完全降解。

反轉錄反應按試劑盒說明書操作，產物cDNA置于-20℃保存。

1.4 RT-PCR反應檢測

采用16S rRNA為內參基因，以檢測tlh基因的表達情況。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：

反應體系為25μL，其中1.5μL反轉錄產物，16S rRNA和tlh的引物各0.8μL，Taq酶0.3μL。94℃預變性5min后，94℃變性60s，56℃退火45s，72℃延伸60s，循環35次。聚合酶鏈反應產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，根據tlh相對于內參的表達水平，計算其在不同應激條件下的表達差異。

2 結果與分析

2.1 提取的總RNA質量分析

2.1.1 普通瓊脂糖電泳檢測結果 本文運用TRIzol法提取出Vp的總RNA，操作步驟簡單，試劑普通，價格低廉；經瓊脂糖凝膠電泳檢測，都可以觀察到23S、16S和5S rRNA，且目的條帶清晰，其中23S rRNA的條帶較亮，亮度基本為16S rRNA的2倍，且沒有拖帶現象［9］。表明該方法所提取的RNA基本無降解，完整性好，完全可用于下游的RT-PCR。

圖1可看出，不同鹽度下提取的三種Vp的總RNA呈現很大差異：1%、3%、5%鹽度處理后的Vp總RNA目的條帶清晰、明亮（泳道1、2、3、6、7、8、11、12、13）；而8%、10%鹽度處理后的Vp總RNA目的條帶模糊，可以忽略不計（泳道4、5、9、10、14、15）。且泳道3明顯比泳道1、2暗，可以初步推出副溶血弧菌在1%和3%的鹽度下生長最好。

圖1 不同鹽度處理后提取的3種Vp總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

圖2可看出，不同溫度下提取的三種Vp的總RNA呈現很大差異：20、25、30、37℃處理后的Vp總RNA目的條帶清晰、明亮（泳道3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17、18）；而4℃和10℃處理后的 Vp總RNA目的條帶模糊，可以忽略不計（泳道1、2、7、8、 13、14）。且泳道4、10、16明顯比其他泳道亮，可以初步推出副溶血弧菌在25℃下生長最好。

圖2 不同溫度處理后提取的3種Vp總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

2.1.2 不同處理后提取的總RNA質量比較 分別取2μL總RNA溶液，用SMA4000核酸及蛋白分析測定儀測定濃度、A280、A260、A230等數值，并計算 A260/A280、A260/A230等數值。

從表2可以看出，經過不同鹽度處理后提取的總RNA質量呈現很大差異：隨著鹽濃度的升高，總RNA溶液的濃度呈明顯的下降趨勢，其中在1%鹽度下，RNA濃度達到最大；8%和10%鹽度下，RNA濃度很低，這與瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果一致。當鹽度在1%～5%之間時，三個菌株的A260/A280值基本在1.9和2.1之間，A260/A230值基本大于2.0且小于2.4，表明RNA樣品含酚類、多糖類物質和蛋白質等雜質少，基本沒有多聚糖、胍鹽或者β-巰基乙醇的污染［10］；而當鹽度大于8%時，這兩個值就不足以為依據了。由此可以大體判斷出Vp的最適生長鹽度為1%～3%，當鹽度≥8%時，Vp就難以生長繁殖了。

從表3可以看出，經過不同溫度處理后提取的總RNA質量也呈現很大差異：隨著溫度的升高，總RNA溶液的濃度先上升再下降再上升，在25℃下，濃度達到最大值，其次是37℃下，濃度值也較大；在4～20℃之間，RNA濃度很低。這與瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果基本相似。當溫度在20～37℃之間時，三個菌株的A260/A280和A260/A230值都符合相應的標準。由此可以判斷出Vp的最適生長溫度為25～37℃，當溫度≤20℃時，Vp就難以生長繁殖了。

表2 不同鹽度處理后提取的3種Vp總RNA的質量比較

表3 不同溫度處理后提取的3種Vp總RNA的質量比較

2.2 tlh基因反轉錄——聚合酶聯反應結果

取相同量的各種總RNA進行反轉錄PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增的16S和tlh聚合酶聯反應產物片段大小同預期的結果一致，tlh基因有條帶說明該基因有表達，見圖3和圖4。

由圖3可看出，不同鹽度下生長的Vp tlh基因條帶的亮度差異很大，ATCC17802和ATCC33847這兩種菌 tlh基因均在 5%鹽度下亮度最大，而ATCC33846的tlh基因在任何鹽度下條帶都很暗。

圖3 不同鹽度處理后3株不同Vp中tlh的表達

由圖4可看出，不同溫度下生長的Vp tlh基因條帶的亮度差異很大，ATCC17802和ATCC33847這兩種菌tlh基因均在25℃下亮度最大，而ATCC33846的tlh基因條帶亮度不太明顯。

圖4 不同溫度處理后3株不同Vp中tlh的表達

2.3 tlh基因表達差異分析

由瓊脂糖凝膠電泳得出在不同鹽度和溫度處理后提取的總RNA中tlh均有表達，通過凝膠成像系統分析軟件的數據可以清楚看出，不同菌株和同種菌株在不同生長條件下tlh的表達呈現很大差異，由圖5和圖6明顯看出，ATCC33846的tlh表達量比其他兩株菌都低，ATCC17802和ATCC33847這兩種菌的tlh基因均在5%鹽度和25℃下表達量最大。這與2.1中提RNA的結果存在明顯差異，說明副溶血弧菌在最適生長條件下時，tlh基因的表達量并不是最大。

圖5 不同鹽度處理后3種不同Vp中tlh的表達

圖6 不同溫度處理后3株不同Vp中tlh的表達

3 討論

副溶血弧菌及其毒素可引起食物中毒、反應性關節炎和心臟疾病等多種疾病。本實驗通過在不同條件下培養Vp，經過提取其總RNA，RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳等環節分析tlh的表達差異，進而為探討副溶血弧菌tlh基因表達和環境適應性之間的關系提供基礎［11］。

Trizol法為傳統的經典RNA純化方法，采用這種方法時反應經3個主要環節，即先用液氮研磨破碎細胞壁，再用Trizol溶解破壞細胞中的核酸、蛋白質、多糖等物質，之后用有機溶劑去除蛋白質和多糖等其它細胞組分，其后再利用選擇性沉淀試劑如高鹽氯化鋁沉淀溶出的總RNA［12］，使RNA與殘留的多糖、多酚及蛋白質等雜質分離，再經過70%乙醇的漂洗沉淀，可使總RNA沉淀中多糖的含量極大地降低，從而得到純度較高的RNA；最后用乙醇沉淀RNA。這種方法的優點是樣本裂解較充分，蛋白質消化較完全。本實驗用該方法提取出的總RNA濃度較高，純度大，完全可以用于接下來的RT-PCR實驗。

16S是所有細菌都具有的基因片段，它在不同來源的副溶血弧菌中很保守，且該基因表達很穩定，所以本文選用16S基因片段作為比較副溶血弧菌tlh基因表達差異的內標。通過引入內標，就可以進一步確定RNA量和反轉錄得到的cDNA量的一致性。Bej等的研究結果顯示，tlh基因具有種特異性，可以作為種特異性標志物。該研究中的引物序列被后來的多個研究采用，并且也出現在FDA-BAM中［12］；Ellison和Taniguchi等的研究也表明，tlh具有較高的實用性［13］；TDH和TRH因為其直接的溶血作用或腸毒素作用，一直以來被作為副溶血弧菌的主要檢測基因，近來的研究表明，TDH基因家族廣泛存在于人類致病性弧菌中，如大多數霍利斯弧菌，某些擬態弧菌，非O1群霍亂弧菌等，TDH相關基因同源性約為93%～96%，提示TDH基因的檢出并不一定是副溶血弧菌［14］；而且，日本學者研究證明，來自海產品及海水的副溶血弧菌菌株僅1%TDH陽性，提示TDH在環境來源的副溶血弧菌中檢出不高［15］。另外，Jaime等對29株來自西班牙、亞洲和美國等臨床和環境分離的菌株研究表明，29株中僅2株TRH陽性，TDH和TRH均陰性1株，表明單憑TDH和TRH的檢出作判斷，還不能有效地控制副溶血弧菌感染引起的流行［16］。因此，本次研究以tlh基因作為目標基因。反轉錄PCR可以有一步反應和兩步反應法，本實驗所使用的為兩步反應法，即將反轉錄反應和PCR分兩步進行，避免了在實驗過程中出現的由于初始所提取的總RNA質量欠佳所導致的后期實驗失敗的情況，對整個的實驗流程的控制優于一步反應法。TLH作為副溶血弧菌最主要的毒力因子之一，通過比較tlh的表達量可以間接比較不同生長條件和不同菌株之間的毒力差異。本實驗結果顯示，不同菌株間和不同應激條件下tlh基因表達差異顯著：在三株實驗菌株中，ATCC33847的tlh表達量最高，ATCC33846表達量最低。在5%鹽度下，3株副溶血弧菌tlh的表達量均顯著大于其他鹽濃度條件；25℃下，3株副溶血弧菌tlh的表達量均顯著大于在其他溫度條件下，這與副溶血弧菌的最適生長條件（1%的鹽度和37℃）呈現明顯差異，這說明基因的表達不僅受細胞內部轉錄調節因子的影響，還與環境的不同有很大關系。

本研究運用RT-PCR法檢測tlh基因的表達差異，不僅得出副溶血弧菌在不同條件下的生長差異及最適生長條件，同時也得出tlh基因的表達差異和最適表達條件，并由此得出最適生長條件和最適表達條件的差異性，對研究外界環境對Vp的tlh基因的表達的影響提供基礎，進而為探討tlh基因的功能和致病性打下基礎。

［1］Douet JP，Castroviejo M.Study of the haemolytic process and receptors of thermostable direct haernolysin from vibrio parahaemotyticus［J］.Res Microbiol，1996，147（1）：687-696.

［2］劉代新，寧喜斌，張繼倫.響應面分析法優化副溶血性弧菌生長條件［J］.微生物學通報，2008，35（2）：306-310.

［3］許如蘇，陳茹，林彩華，等.副溶血性弧茵LUXTM熒光PCR快速檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2008，38（12）：1075-1079.

［4］Shinoda S，Matsuoka H，Tsuchie T，et al.Purification and characterizaton of a lecithin-haemolysin from Escherichia coli transformed by a vibrio parahaemolyticus gene［J］.J of General Microobiology，1991，137：2705.

［5］Gooch JA，Depaolar A，Kaysner CA，et al.Evaluation of two Direct Plating methods using nonoradioactive probes for enumeration of vibrio parahaemolyticus in oysters［J］.Appl and Environ Microbiol，2001，67（2）：721-724.

［6］傅烈振，朱燕，王寧，等.應用反轉錄聚合酶鏈技術快速檢測豬瘟病毒RNA的研究［J］.中國獸醫科技，1998，28（6）：3-5.

［7］郭麗，王天云，王俐，等.半定量反轉錄-聚合酶鏈反應分析大鼠不同組織肌肉生長抑制素基因的表達［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（11）：2164-2166.

［8］李勁松，孟令英，陳梅玲，等.一步法提取RNA反轉錄一多聚酶鏈反應檢測漢坦病毒RNA［J］.中國公共衛生，1996，10（12）.

［9］胡曉紅，彭惠民，劉昕.PCR及Real-time PCR評價細菌DNA提取方法［J］.重慶醫科大學學報，2008，33（2）：155-158.

［10］FaLeier.ExperimentalguideofRNA Isolation and identification-RNA research methods［M］.Beijing：Chemical Industry Press.

［11］王淑娜，方維煥.熒光定量PCR法檢測副溶血弧菌tdh基因的表達差異［J］.畜牧與獸醫，2008，40（9）：9-13.

［12］BEJ AK，PATTERSON DP，BRASHER CW，et al.Detection of total and hemolysin producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tlh，tdh and trh［J］.Microbiol Methods，1999，36：215-225.

［13］Ellison RK，Malnati E，Depaloa A，et al.Population of vibrio parahaemolyticus in retail oysters from Florid using two methods［J］.Food Prot，2001，64（5）：682-686.

［14］Alam MJ，Tomochika K，Miyoshi S，et al.Environmental investigation of potentially pathogenic V ibrio parahaem olyticus in the Seto-Island sea，Japan［J］.Microbiol Lett，2002，208（1）：83-87.

［15］Cook DW，Bowers JC，DePaola A，et al.Density of total and pathogenic V ibrio parahaem olyticus in Atlantic and Gulf Coast molluscan shellfish at harvest［J］.Food Prot，2002，65（12）：1873-1880.

［16］Jaime Martinez-Urtaza，Antonio Lozano-Leon，Angelo DePaola，et al.Characterization of pathogenic V ibrio parahaem olyticus isolates from clinical sources in spain and comparison with asian and north American pandemic isolates［J］.Clin Microbiol，2004，42（10）：4672-4678.

Expression of tlh gene in Vibrio parahaemolyticus：semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analysis assessment

CHEN Xing，PAN Yin-jie，SUN Xiao-hong，ZHAO Yong*
（Food College，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Vibrio parahaemolyticus is a foodborne pathogenic bacteria which could be widely found in coastal areas，salt lakes and seafoods，it could cause large-scale food poisoning.TLH is one of the most important virulence factors of Vp，we can compare the virulence of strains which in different stress conditions，as well as differences strains by comparing the expression levels of tlh indirectly.ln this paper，three kinds of Vp cultured under different conditions，total RNA were extracted from them，16S rRNA as an internal standard gene，using semi -quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）detection of Vp’s thermolabile hemolysin toxin（tlh）gene expression under different conditions.The results showed that under 5%of the salinity，tlh gene expression level of the three Vp strains were higher than that under other salt.Under 25℃，tlh gene expression level was higher than that under other temperature conditions.Between the three Vp strains，tlh mRNA expression level of ATCC33846 was lowest，tlh mRNA expression level of ATCC33847 was highest.

Vibrio parahaemolyticus；tlh；16S rRNA；RT-PCR；gene expression

Q786

A

1002-0306（2011）01-0141-05

2010-03-16 *通訊聯系人

陳星（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全。

“十一五”國家863計劃重點項目（2008AA100804）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2009）第6-1號）；“十一五”國家科技支撐計劃課題—世博科技專項（2009BAK43B17）。