甘蔗糖蜜預處理對產L-蘋果酸的影響與培養基N源添加

李永成，鐘秋平

（海南大學食品學院，海南?？?70228）

甘蔗糖蜜預處理對產L-蘋果酸的影響與培養基N源添加

李永成，鐘秋平

（海南大學食品學院，海南?？?70228）

研究了經煮沸、活性炭、亞鐵氰化鉀、磷酸與硫酸預處理的糖蜜對黃曲霉生長與合成L-蘋果酸的影響以及培養基中N源添加。以經各種預處理的糖蜜培養黃曲霉，其生物量大小分別是：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法。硫酸能有效除去糖蜜中影響菌體生長的膠體物質，用硫酸處理的糖蜜作培養基時，其菌體生長量比煮沸處理高25%。用硫酸與亞鐵氰化鉀聯合處理，對L-蘋果酸合成最有利，其產酸達到59.6g/L。糖蜜培養基需添加1g/L硫酸銨為N源，較適培養基配方（g/L）為：糖120，NH4（SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370，pH5.5。

L-蘋果酸，甘蔗糖蜜，黃曲霉

L-蘋果酸是一種重要的有機酸，在醫藥、化工和食品工業上有著廣泛應用。自然界中存在的蘋果酸都是L-蘋果酸，廣泛存在于水果和蔬菜中。與檸檬酸相比，L-蘋果酸的酸味別致，具有酸味柔和、爽快、刺激性緩慢、保留時間長的特點。以之調配出的食品、飲料更接近天然果汁風味，是一種優良的食品添加劑。在醫藥上，L-蘋果酸具有重要的生理功能，直接參與人體代謝；在印染、化工及其他工業，L-蘋果酸也具有廣闊的應用前景。目前發酵法生產L-蘋果酸的工藝主要有三類：一是糖質原料一步發酵法［1-2］；二是兩步發酵法，即采用兩種不同功能的微生物，其中之一先將糖質或其他原料轉化生成延胡索酸，另一種微生物再將延胡索酸轉化成L-蘋果酸；三是以延胡索酸為原料的直接發酵法［3-4］。甘蔗糖蜜是南方糖廠的副產物，大部分用來生產酒精。研究以甘蔗糖蜜為原料，黃曲霉為生產菌，采用一步發酵工藝來生產L-蘋果酸，對提高甘蔗糖蜜的綜合利用與深度開發水平有一定實際意義。甘蔗糖蜜中含總糖量為50%～58%，膠體物質為8%～10%。除此之外，糖蜜中還含有較多的B族維生素和多種氨基酸，其中每克甘蔗糖蜜約含生物素1～3μg，氨基酸總含量約為 0.3～0.5μg［5］。甘蔗糖蜜豐富的營養成分為L-蘋果酸生產菌黃曲霉的生長提供了良好的營養條件，但其中膠體物質與金屬離子（Fe、Zn、Cu等）等雜質會妨礙黃曲霉的生長與L-蘋果酸合成［6-7］，在發酵前需進行預處理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗糖蜜 海南那大糖廠提供（碳酸法糖蜜）；實驗試劑 均購自于上海醫藥集團公司，均為分析級試劑；標準品 L-蘋果酸 Sigma公司；黃曲霉（Aspergillus flavus） 本實驗室保存，從本校橡膠林土壤中篩選，經紫外線、亞硝基胍（NTG）誘變獲得，能穩定合成L-蘋果酸；培養基 試管斜面培養基采用麥芽汁培養基：4～5Be′麥芽汁，瓊脂15g/L，pH自然；種子培養采用麥芽汁培養基，不加瓊脂；發酵培養基（g/L）：糖蜜經預處理后，稀釋至總糖濃度120，加NH4（SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370（單獨滅菌，接種前加入），pH5.5。

SPX-150B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HYG-A全溫搖瓶柜 江蘇太倉實業設備廠；TGL-20M臺式冷凍高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；752紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；MP5002電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；DHG-9070A恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；HP1100高效液相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖蜜預處理［7］

1.2.1.1 無處理（對照） 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.2 煮沸法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加熱煮沸20min，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.3 活性炭法 糖蜜經1∶1去離子水稀釋后，加1%顆粒炭吸附處理，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.4 亞鐵氰化鉀法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加0.1%亞鐵氰化鉀，調節酸堿度至pH6.5，煮沸30min后，同時加1%活性炭，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.5 磷酸法 糖蜜用1∶1離子水稀釋后，加熱煮沸，加濃磷酸至pH2.0～3.0，靜置過夜，過濾，濾液加入新配制的石灰乳回調至pH6.0左右，65～70℃保溫30min，同時加1%活性炭，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.6 硫酸法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加硫酸至pH2.0～3.0，后續操作與磷酸法相同。

1.2.1.7 硫酸與亞鐵氰化鉀聯合處理（硫酸+亞鐵氰化鉀）法 先用硫酸處理（硫酸法），然后加0.1%亞鐵氰化鉀，調節酸堿度至pH 6.5，同時加1%活性炭，攪拌30min，過濾，濾液供實驗。

1.2.2 黃曲霉的培養 糖蜜經預處理后，添加其它成分與N源，500mL的三角瓶裝培養液100mL，發酵溫度35℃，旋轉式搖床培養，轉速200r/min。N源及其添加量通過N源添加實驗來確定。

1.2.3 分析測定

1.2.3.1 總糖測定 直接取發酵液樣，采用硫酸-苯酚法。

1.2.3.2 總酸測定 采用酸堿滴定法。發酵結束后，用與70g碳酸鈣等當量的硫酸中和，加熱10min，使蘋果酸充分游離出來，過濾，用蒸餾水重新定容至100mL，取濾液進行滴定。

1.2.3.3 膠體測定方法［8］用100mL量筒取已處理但未過濾糖液100mL，室溫靜置4h，以沉淀物所占體積表示（mL）。

1.2.3.4 菌體生物量測定 干重法，發酵液3000r/min離心10min，取菌絲體，70℃下干燥至恒重。

1.2.3.5 蘋果酸分析［6］采用HPLC法。色譜條件：色譜柱，XDB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相：0.5%磷酸二氫銨，pH 2.5，流速1mL/min；紫外檢測器，波長214nm。

2 結果與討論

2.1 糖蜜預處理對糖質量的影響

糖蜜中的膠體帶負電荷，其等電點偏酸性，用酸處理使膠體帶電荷為零而沉降，另外還可使部分金屬如Ca離子等沉淀。亞鐵氰化鉀法主要是除去Fe離子［9］，與酸處理比較，其對膠體的去除不理想。結果如表1，在單因素處理中，酸處理膠體去除率高，糖液清澈，色度低；煮沸法處理對膠體去除效果最差。

表1 不同處理對糖質量的影響

2.2 糖蜜預處理對黃曲霉生長的影響

用經不同預處理的糖蜜培養黃曲霉，各種預處理對黃曲霉生長的影響如圖1。在單因素處理中，煮沸法與活性炭法處理的菌體生長量均較低，硫酸法最高，硫酸法的最大生物量（17.48g/L）比煮沸法的（13.97g/L）要高25%，對于不同預處理的糖蜜，黃曲霉生物量大小依次為：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法＞對照；從黃曲霉平均耗糖速率來說，快慢順序依次為（表2）：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法＞對照，硫酸法明顯優于活性炭法與煮沸法（P＜0.05），該順序與各處理的膠體去除率（表1）剛好一致，這說明膠體物質會阻礙黃曲霉生長。而聯合處理中，硫酸法+亞鐵氰化鉀聯合處理對黃曲霉生長影響與硫酸法沒明顯區別（P＞0.05）。

圖1 糖蜜預處理對黃曲霉生長的影響

2.3 糖蜜預處理對產酸的影響

產酸情況（含量與純度）與菌種、培養基成分與發酵條件等有關。培養基成分要求既要能滿足黃曲霉生長的需要，又要含有產酸所需要的成分，如維生素、金屬離子，金屬離子對產酸影響很復雜［1-2］，不同離子種類與濃度對產酸與酸的種類都有影響，如有報道［2］，Mn2+對產L-蘋果酸有促進作用，而Cu2+卻有強烈抑制作用，Fe2+則對雜酸特別是檸檬酸的產生有較大影響［7］。糖蜜有豐富的金屬離子［9-10］，亞鐵氰化鉀主要作用是絡合糖蜜的金屬離子。為了把酸去除膠體與鐵氰化鉀絡合金屬離子兩種作用結合起來，實驗采取了硫酸法+亞鐵氰化鉀聯合處理。與煮沸法、活性炭法比較，表3表明，亞鐵氰化鉀處理對L-蘋果酸含量與純度有一定的促進作用，而硫酸法+亞鐵氰化鉀法處理對L-蘋果酸含量與純度均有良好影響，這應當與兩種方法的復合效應有關。

表2 糖蜜預處理對黃曲霉耗糖影響

表3 預處理對L-蘋果酸合成的影響

表4 N源對產酸的影響

2.4 糖蜜培養基對N源的選擇

糖蜜的含N量并不高（0.1%左右），要額外添加適當的N才能滿足黃曲霉生長與產酸的要求。本實驗對N源的種類與量進行了實驗，結果如表4、表5。表4說明無機N源好于有機N源，實驗中發現有機N源耗糖速度慢，殘糖高。有機氮源與無機N源結合使用時，效果不如無機N源單獨使用，這些可能與糖蜜有一定有機N源，不需另外添加有關。無機氮N以硫酸銨效果最好，表5對硫酸銨的添加量進行了實驗，表明硫酸銨的適合添加量在0.1%～0.15%。

表5 硫酸銨的添加量對蘋果酸產量的影響

3 結論

糖蜜含有黃曲霉生長與L-蘋果酸合成的成分，但也含有一些抑制成分，如膠體物質與金屬離子。膠體物質明顯影響菌體的生長，金屬離子對L-蘋果酸合成的影響則比較復雜。糖蜜要經預處理，去除膠體物質與部分金屬離子，才能適合做L-蘋果酸合成的原料。實驗證明，硫酸與亞鐵氰化鉀聯合處理是種較適合的預處理方法，它能有效地去除大部分膠體物質與部分金屬離子，滿足菌體生長與蘋果酸合成需要。糖蜜中N素較少，需額外添加。但糖蜜中生物素豐富，不需特別添加，前人實驗表明［2］，生物素能促進L-蘋果酸的合成。盡管本實驗得到的產酸量不是最高的，其成分對蘋果酸合成影響也需進一步深入研究，但糖蜜原料發酵與其它工藝相比，原料成本相對較低，因此它的大規模推廣有很大意義。

［1］劉建軍，趙祥穎，田延軍，等.糖質原料直接發酵生產L-蘋果酸的工藝條件［J］.食品與發酵工業，2005，31（1）：5-9.

［2］胡純鏗.L-蘋果酸產生菌黃曲霉Aspergillus flavus H-98發酵特性的研究［J］.食品與發酵工業，1998，25（2）：19-22.

［2］施巧琴，吳松剛，鄭騰，等.L-蘋果酸產生菌F-871變株合成延胡索酸酶的研究［J］.菌物系統，2003，22（2）：283-288.

［4］景曉輝，丁友土.發酵法生產L-蘋果酸技術的研究［J］.食品添加劑，2005，26（9）：151-153.

［5］王玉香，王金華，陳平，等.以甘蔗糖蜜為碳源發酵生產黃原膠的研究［J］.南開大學學報：自然科學版，2000，33（1）：15-18.

［6］金其榮，許贛榮，包惠燕，等.黃曲霉發酵薯干粉水解生產L-蘋果酸［J］.微生物學通報，1995，22（5）：276-279.

［7］匡群，孫梅，費克暉，等.甘蔗糖蜜發酵生產檸檬酸［J］.生物技術，2001，11（2）：41-44.

［8］湯興俊，盧林海，楊明智.利用甘蔗糖蜜生產焦糖色素的研究［J］.中國釀造，2003，128（5）：11-13.

［9］金其榮，張繼民，徐勤.有機酸工藝學［M］.北京：中國輕工出版社，1995.

［10］陳寧.氨基酸工藝學［M］.北京：中國輕工出版社，2007.

Effects of cane molasses pre-treantment on L-malic acid production and N addition in medium

LI Yong-cheng，ZHONG Qiu-ping
（School of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Effects of cane molasses pre-treated with boiling，active carbon，potassium ferrocyanide，phosphate and sulfate on L-malic acid production and Aspergillus flavus growth，and N addition in medium was studied.The biomass size order of Aspergillus flavus cultured with pre-treated cane molasses was by sulfate＞phosphate＞potassium ferrocyanide＞active carbon＞boiling.The colloidal substances were effectively removed by sulfate.The biomass of Aspergillus flavus cultured with cane molasses pre-treated by sulfate was 25%higher than that by boiling.lt was favorable for L-malic acid accumulation in Aspergillus flavus when the cane molasses was mixtreated with sulfate and potassium ferrocyanide，and L-malic acid accumulated to 59.6g/L.NH（4SO4）2of 1g/L was required in cane molasses medium，and the adaptive formula（g/L）was sugar 120，NH（4SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370，pH 5.5.

L-malic acid；cane molasses；Aspergillus flavus

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0178-03

2010-02-04

李永成，博士，從事微生物技術研究。

華南熱帶農業大學科技基金資助（RND0420）。