牛肉預煮液作為培養基氮源的可能性探討

張小永，羅愛平，唐會周

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

牛肉預煮液作為培養基氮源的可能性探討

張小永，羅愛平*，唐會周

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

牛肉預煮液進行離心、過濾等預處理后，將其濃縮至原體積的75%、50%，主要測定總氮、氨基酸態氮含量。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌為質控菌株，檢驗三種不同濃度牛肉預煮液替代普通肉湯的靈敏度，并觀察三種質控菌株分別在不同濃度牛肉預煮液配制的營養瓊脂上生長的菌落形態。結果表明：原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液總氮含量分別為2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸態氮含量分別為0.945、1.425、1.890mg/mL；磷酸鹽實驗、堿性沉淀實驗、色素生成實驗以及靈敏度均符合培養基要求。三種質控菌株的菌落形態、菌落大小、色素生成均符合菌株的生長特性，在50%的濃縮液牛肉預煮液配制的營養肉湯中培養24h，靈敏度均能達到10-9，敏感性最強，故可將總氮、氨基酸態氮含量分別達4.088、1.890mg/mL的濃縮液替代用于此三種質控菌株培養的牛肉浸液。

牛肉預煮液，總氮，培養基，牛肉浸液

預煮是牛肉深加工中重要的工藝環節之一［1］，預煮后所剩的湯汁即為牛肉預煮液。牛肉預煮液中含氮物質豐富，包括游離氨基酸、二肽、尿素、胍的衍生物、嘌呤堿等［2］，是一類可再利用的氮源。牛肉浸液是動物組織浸液中最古典的培養基成分，由切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉絞碎，煮制過濾而得［3］。它是培養基基礎液，廣泛用于配制營養肉湯、營養瓊脂、半固體等培養基，主要為微生物生長繁殖提供可溶性含氮物、核酸降解物、維生素及無機鹽等，以補充蛋白胨營養成分的不足。牛肉預煮液是牛肉制品生產過程中的副產物，在生產過程中作為廢棄物排放，不僅導致污染環境，而且是一種資源的浪費。本實驗擬探討牛肉預煮液替代牛肉浸液作為微生物培養基有機氮源的可能性，旨在為牛肉預煮液的綜合利用尋求一條途徑，為現代生物技術及產業化發展的重要基礎性材料尋求質優價廉的原材料。

表1 麥氏比濁管配制表

1 材料與方法

1.1 材料與設備

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌 貴州大學食品營養與安全系微生物實驗室提供；牛肉預煮液 貴州永紅食品有限公司提供，預煮的牛肉與水質量比（m/m）為1∶1；瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；牛肉膏 上?？禎櫳锟萍加邢薰?。

CD4-2低速離心機 北京醫用離心機廠；凱氏定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司；LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；真空旋轉蒸發儀 上海雅榮生化設備儀器有限公司；HI208臺式pH測定儀 北京哈納科儀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肉預煮液預處理

1.2.1.1 工藝流程 牛肉預煮液→粗濾→精濾→離心→濃縮

1.2.1.2 操作要點 粗濾：牛肉預煮液在10～15℃條件下靜置，使脂肪凝固，便于過濾，用四層紗布過濾。精濾：取濾液進一步用濾紙過濾。離心：將精濾處理的牛肉預煮液3500r/min離心30min，濾液備用。濃縮：離心處理的牛肉預煮液在55℃，真空度0.02MPa條件下濃縮，濃縮至原體積的75%、50%，121℃、30min高壓滅菌，置4℃下保存備用。原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液以下分別簡稱1、2、3號液。

1.2.1.3 麥氏比濁管的制作及使用 分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液，取口徑相等質地相同的試管10支，按表1所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號碼備用。

將0.9%（w/v）NaCl無菌生理鹽水洗下的三種質控菌株分別加入與標準管大小相同的無菌試管中。被測定試管加入0.9%（w/v）NaCl無菌生理鹽水，直至濃度與所要求的標準管濃度相同。與標準比濁管相比較，視其濁度相當于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當菌數乘以稀釋倍數即可得到每毫升中所含細菌的數量。如細菌原液1∶5稀釋后其濁度與第3管相當，則原液每毫升含菌數為9×5=45億。

菌液的稀釋按下列公式計算：

如原液5mL，每毫升含菌45億，今欲稀釋為每毫升含菌10億的溶液，應加無菌生理鹽水的毫升數為：（5×45）/（10-5）=17.5mL，即細菌原液5mL加生理鹽水17.5mL稀釋即成。

1.2.2 牛肉預煮液理化指標測定

1.2.2.1 總氮含量測定 凱氏定氮法，按 GB/T 9695.11-2008。

1.2.2.2 氨基酸態氮測定 雙指示劑甲醛滴定法，按GB/T 5009.39-2003。

1.2.2.3 還原糖測定 高錳酸鉀滴定法，按 GB/T 5009.7-2008。

1.2.2.4 pH測定 HI208臺式pH測定儀測定。

1.2.2.5 顏色、澄明度和沉淀 分別取1、2、3號液各50mL加熱煮沸，冷卻后直接觀察溶液的顏色、澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.6 堿性沉淀 分別取1、2、3號液各100mL，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液調pH8～9，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后直接觀察澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.7 磷酸鹽沉淀 分別取1、2、3號液100mL、磷酸二氫鉀0.5g，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液調pH7.4～7.6，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后直接觀察澄明度和沉淀［3］。

1.2.3 菌種活化 制備營養瓊脂斜面培養基，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌三種質控菌種逐代培養至第3代（F3），保存備用。

1.2.4 靈敏度測定［4-5］采用3次3管法，分別測定1、2、3號液替代營養肉湯的靈敏度。取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌第3代（F3）培養菌株，用0.9%（w/v）NaCl無菌生理鹽水制成均勻菌液，此菌液濃度相當于麥氏比濁管第10管濃度。將此濃度菌液用生理鹽水分別進行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9五個稀釋度分別接種1mL于三種濃度牛肉預煮液濾液9mL小管，各3管，同時各取3個試管不接種菌懸液作陰性對照。37℃培養3d，逐日觀察結果。

1.2.5 色素生成測定 取三種質控菌菌懸液0.1mL，分別接種于1、2、3號液制成的三種營養瓊脂平皿內，用L型玻棒涂勻，37℃培養24h。同時各取3個平皿不接種菌懸液作陰性對照。

營養瓊脂配制：牛肉預煮液原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液各1000mL；氯化鈉，5g；瓊脂，15g；pH7.2～7.6。

1.2.6 菌落形態觀察 同色素生成測定。

2 結果與分析

2.1 理化指標測定結果

1、2、3號液理化指標測定結果見表2。

表2 牛肉預煮液理化指標測定結果

表3 三種不同濃度牛肉預煮液替代營養肉湯的靈敏度

如表2所示，1、2、3號液，總氮含量分別為2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸態氮含量分別為0.945、1.425、1.890mg/mL；均為澄清，微黃；沉淀、磷酸鹽沉淀及堿性沉淀在實驗中均無。據薛麗華等報道［4］，華安牛肉浸液中總氮含量為3.68mg/mL。結果表明：濃縮牛肉預煮液可達到普通牛肉浸液水平，可將濃縮至原體積50%即總氮含量達4.088mg/mL、氨基酸態氮含量達1.890mg/mL的牛肉預煮液作為傳統牛肉浸液的替代品。

2.2 靈敏度

靈敏度是培養基質量的一項重要指標，是指一種培養基對某一種微生物在該培養基中能得以良好生長的最低接種量。如表3所示，1號液接種金黃色葡萄球菌，37℃培養24h后靈敏度達10-8，培養48h后靈敏度達10-9；接種大腸桿菌，37℃培養24h后靈敏度達10-8，但不及接種金黃色葡萄球菌敏感，3管檢驗管中僅有2管呈陽性，在培養48h后靈敏度達10-9；接種沙門氏菌，37℃培養24h后靈敏度達10-8，培養48h后靈敏度仍為10-8，培養72h后靈敏度達10-9。

2號液接種金黃色葡萄球菌，37℃培養24h后靈敏度10-9；接種大腸桿菌，37℃培養24h后靈敏度達10-8，培養48h后靈敏度達10-9，但不及接種金黃色葡萄球菌敏感，3管檢驗管中僅有2管呈陽性；接種沙門氏菌，37℃培養24h后靈敏度達10-9。

3號液接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌37℃培養24h后靈敏度均達到10-9，金黃色葡萄球菌最為敏感，3管檢驗管均呈陽性；大腸桿菌與沙門氏菌3管檢驗管中僅有2管呈陽性。

不同濃度牛肉預煮液的靈敏度實驗表明，靈敏度隨含氮量提高而增強，即1號＜2號＜3號。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌在3號液替代營養肉湯中生長情況均較好。金黃色葡萄球菌在3號液中形成較多懸浮菌；大腸桿菌在3號液中生長形成菌膜，中部生成懸浮菌；沙門氏菌在3號液表面生成菌膜，中部有懸浮菌。

2.3 色素生成實驗與菌落形態觀察

色素生成實驗反映了某種菌在培養基中生長是否符合其本質特性。如表4所示，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別接種到1、2、3號液配制的三種營養瓊脂培養基中，37℃培養24h后，菌落形態均呈S型；金黃色葡萄球菌菌落直徑D為1.4～1.6mm，大腸桿菌菌落為2.0～2.3mm，沙門氏菌菌落為1.6～1.8mm。除金黃色葡萄球菌有金黃色色素生成外，其余2種菌株均無色素生成。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的生長情況，均符合該菌株的生長特性［6-7］。

表4 三種質控菌株的菌落形態和色素生成結果

綜上所述，原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液的磷酸鹽實驗、堿性沉淀實驗、色素生成實驗和菌落觀察，以及靈敏度結果均符合培養基要求［8-9］。

3 結論與討論

3.1 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌是食品衛生檢驗中常規的檢測指標，是保障食品質量安全的控制指標，故本實驗選用此三種菌株探討牛肉預煮液作為培養基氮源的可能性。

3.2 牛肉浸液是以牛肉為原料而制成，成本較高。牛肉預煮液在牛肉制品生產過程中作為廢棄物排放，但經離心、過濾等簡單處理即可變廢為寶，作為微生物培養基氮源。結果表明：原液、濃縮至原體積75%、50%濃縮液的磷酸鹽實驗、堿性沉淀實驗、色素生成實驗和菌落觀察，以及靈敏度結果均符合培養基要求。

3.3 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌在50%的濃縮液替代的營養肉湯中靈敏度達到10-9，敏感性最強；菌落形態、菌落大小、色素生成均符合菌株的生長特性。故可將經預處理的牛肉預煮液濃縮，使其總氮含量達4.088mg/mL、氨基酸態氮含量達1.890mg/mL，替代用于培養金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌三種質控菌株的傳統牛肉浸液，但能否作為其他微生物生長繁殖的氮源還有待進一步研究。

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Study on the possibility of pre-cooked beef fluid nitrogen as a medium to explore

ZHANG Xiao-yong，LUO Ai-ping*，TANG Hui-zhou
（College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Pre-cooked beef liquid to centrifugation and filtration etc，was concentrated to the original volume of its 75%，50%，mainly determination of total nitrogen，amino nitrogen content.Staphylococcus aureus，E.coli，Salmonella strains for quality control，testing of three different concentrations of pre-cooked beef broth liquid alternative to ordinary sensitivity，and to observe the three kinds of quality control strains were pre-cooked beef at different concentrations of nutrient agar solution prepared on the growth of colony morphology.The results showed that：the original pre-cooked beef liquid，concentrated to the original volume of 75%，50%concentrated liquid TN contents were 2.044，3.066，4.088mg/mL，amino acid nitrogen contents were 0.945，1.425，1.890mg/mL.Phosphate test，alkaline precipitation test，pigment-producing testing and sensitivity met the media requirements.Three kinds of quality control strains of colony morphology，colony size，pigment-producing strains were in line with the growth characteristics.Concentrated solution in 50%of the pre-cooked beef liquid nutrient broth prepared to cultivate 24h sensitivity can reach 10-9，the sensitivity of the strongest.Therefore TN，amino nitrogen content were up to 4.088，1.890mg/mL can be alternative to the concentrated solution of three quality control strains used for this culture of beef extract.

pre-cooked beef fluid；total nitrogen；culture media；beef immersion

TS251.9

A

1002-0306（2011）01-0172-04

2010-02-01 *通訊聯系人

張小永（1982-），在讀碩士，研究方向：藥食資源利用。