天麻對灰樹花液體深層發酵的影響

賀宗毅，吳天祥

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

天麻對灰樹花液體深層發酵的影響

賀宗毅，吳天祥*

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

研究中藥天麻對灰樹花液體深層發酵的影響，應用Minitab15軟件設計了Plackett-Burman篩選實驗，篩選出葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、天麻濃度、無機鹽配比4個顯著性影響因素，通過正交實驗對其進行優化，結果表明天麻對灰樹花液體深層發酵的最佳工藝條件為：葡萄糖質量濃度30g/L，蛋白胨質量濃度5.5g/L，天麻質量濃度7g/L，KH2PO4質量濃度1.5g/L，MgSO4質量濃度0.75g/L。每升發酵液中可得到灰樹花胞外多糖為3.91g，與不添加天麻的對照組相比，胞外多糖產量提高了3.4%。

灰樹花，天麻，胞外多糖，發酵

灰樹花（Polyporus frondosus），又名栗子蘑、栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、甜瓜板、舞茸等，屬于真菌門（Eumycota）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、多孔菌屬（Polyporus）的一種大型真菌［1］?；覙浠ㄊ且环N富含多糖、維生素、氨基酸、蛋白質、無機鹽等有效成分的藥、食兩用菌［2］?；覙浠ㄐ云轿陡?，在藥用價值方面可用來治療小便不利、水腫、腳氣、肝硬化、腹水、糖尿病及高血壓、肥胖等疾病。近年來的研究表明，灰樹花中富含的多糖類物質具有明顯的抗誘變、抗衰老、調節免疫［3］、抑制腫瘤［4-5］、抗HIV、保肝護肝等生理活性作用［6-8］。天麻（Rhizoma Gastrodiae）［9］為蘭科多年生寄生菌植物，以蜜環菌的菌絲或菌絲分泌物為營養來源。天麻主要產于四川、云南、貴州，其干燥塊莖富含天麻素，可以入藥，具有平肝、息風、止痙的作用，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇抽搐等癥。近幾年研究表明，向真菌培養基中添加適量的中藥可以促進真菌的生長或提高活性產物的產量［10-11］。本實驗利用灰樹花向發酵培養基中添加了適量的天麻，以胞外多糖產量和菌絲量為考察指標，并用正交實驗優化了灰樹花發酵培養基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花（51616） 購于中國農業微生物菌種保藏管理中心；天麻 購于貴陽市藥房；斜面種子培養基 PDA培養基［12］；液體種子培養基 葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；搖瓶發酵培養基 葡萄糖2%，蛋白胨0.4%，天麻0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；KH2PO4汕頭市金矽化工廠；MgSO4浙江省明礬石精細化工廠；蛋白胨浙江海川化學品有限公司；葡萄糖 汕頭市西隴化工廠；無水乙醇 成都金山化學試劑有限公司。

722型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；高速離心機TDL-40B 上海安亭科學儀器廠；凈化工作臺SW-CJ-1D 蘇州凈化設備有限公司；數顯鼓風干燥箱GZX-9070、生化培養SPX-150B-Z、高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司設備廠；電冰箱 合肥榮事達電冰箱有限公司；分析天平AUY120島津國際貿易公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 斜面種子培養 于母種試管中切取出黃豆粒大小的菌絲塊，接種于斜面中部，25℃恒溫培養9d。

1.2.2 液體種子培養 將培養好的斜面菌種切取蠶豆大小，接種于液體培養基中，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃，150r/min，搖床培養9d。

1.2.3 搖瓶發酵培養 按10%的接種量取液體種子進行接種，250mL三角瓶裝液量 100mL，25℃，150r/min，搖床培養8d。

1.2.4 生物量計算 將發酵液離心（4000r/min，20min），用蒸餾水沖洗菌絲濾餅兩次，再離心，菌絲在90℃電熱恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱重得菌絲生物量。

1.2.5 胞外多糖含量測定 將 100mL發酵液經4000r/min離心20min，得到的濾液用3，5-二硝基水楊酸比色法［13］測還原糖含量、苯酚-硫酸法［14］測總糖含量。胞外多糖含量等于總糖含量與還原糖含量之差。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源的確定 選擇葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉分別作為灰樹花發酵培養基的碳源，質量濃度為3%，以空白組作為對照，其它條件不變。發酵完成后分別測定菌絲生物量及胞外多糖產量，以考察不同碳源對灰樹花生長的影響，實驗結果見圖1。

圖1 不同碳源對灰樹花深層發酵的影響

碳源是灰樹花能量代謝的來源，不同種類的碳源對其發酵產胞外多糖的影響差異顯著，由圖1可以得出，灰樹花能夠比較好地利用麥芽糖和葡萄糖，但是以葡萄糖作為碳源時胞外多糖產量最高，質量濃度為2.21g/L，菌體生物量也最高，故選葡萄糖作為碳源。

2.1.2 氮源的確定 以葡萄糖為碳源，分別選擇蛋白胨、尿素、酵母膏、硫酸銨、磷酸二氫銨作為發酵培養基的氮源，質量濃度為0.4%，以空白組作為對照，其它條件不變。發酵完成后分別測定菌絲生物量及胞外多糖產量，考察不同氮源對灰樹花生長的影響，實驗結果見圖2。

氮是灰樹花生長過程中不可缺少的元素，研究了上述5種氮源，從圖2中可得出，灰樹花對有機氮源的利用優于無機氮源（尿素除外），其中又以蛋白胨為最佳，所以選擇蛋白胨為氮源。

圖2 不同氮源對灰樹花深層發酵的影響

2.1.3 碳源質量濃度對菌體生長的影響 在發酵培養基中分別添加不同質量濃度的葡萄糖，其它條件不變，發酵完成后研究其對胞外多糖及菌絲生物量的影響，結果如圖3所示。

圖3 葡萄糖添加量對灰樹花深層發酵的影響

由圖3可得出，在一定的葡萄糖濃度范圍內，胞外多糖產量和菌體干重隨著葡萄糖濃度的增大而增大。當葡萄糖質量濃度為30g/L時，胞外多糖和菌體干重達到最大值；當葡萄糖濃度超過30g/L時，胞外多糖產量和菌體干重都呈下降趨勢，故選擇葡萄糖質量濃度為30g/L。

2.1.4 氮源質量濃度對菌體生長的影響 向發酵培養基中分別添加不同質量濃度的蛋白胨，其它條件不變，研究其對胞外多糖及菌絲生物量的影響，結果如圖4所示。

圖4 蛋白胨添加量對灰樹花深層發酵的影響

由圖4可以看出，隨著蛋白胨質量濃度的增加，灰樹花生長旺盛，菌體干重及胞外多糖產量增加。當蛋白胨質量濃度為6g/L時，菌體干重達到最大值，此時胞外多糖產量亦達到最大值，當蛋白胨質量濃度超過6g/L時，灰樹花菌體干重及胞外多糖產量均趨于平穩，說明6g/L的蛋白胨能夠滿足灰樹花的生長，所以選擇蛋白胨質量濃度為6g/L。

2.1.5 無機鹽配比對灰樹花發酵的影響 藥用真菌的生長離不開各種無機離子，其中P、K、Mg等元素為真菌生長所必需。在其它條件不變的情況下，將KH2PO4∶MgSO4按質量比為2∶1的比例添加進行合并考察，結果見圖5。

圖5 不同無機鹽配比對灰樹花深層發酵的影響

由圖5可知，當KH2PO4和MgSO4的質量濃度分別為2g/L和1g/L時，灰樹花發酵最好，此時胞外多糖含量及菌體干重分別為3.12g/L和8.6g/L。

2.1.6 天麻質量濃度對菌體生長的影響 灰樹花是藥食兩用真菌，在搖瓶培養基中加入適量的天麻，利用灰樹花強大的分解轉化能力，對天麻中的纖維、糖類、蛋白質等物質加以利用?；覙浠ㄔ谏L代謝過程中可以對天麻中的主要成分天麻素進行轉化利用，從而提高胞外多糖的產量。在其它條件不變的情況下，不同質量濃度的天麻添加量對灰樹花發酵的影響結果見圖6。

圖6 天麻添加量對灰樹花深層發酵的影響

從圖6中可以看出，天麻的添加量對灰樹花胞外多糖的產生具有一定的促進作用。當天麻質量濃度為7g/L時，胞外多糖產量及菌體干重均達到最大值，但隨著天麻質量濃度的升高，灰樹花菌體生物量隨之降低?？赡苁翘炻橹械哪承┏煞謱覙浠ňz的生長產生了抑制作用，所以選擇天麻質量濃度為7g/L。

2.1.7 培養時間對灰樹花發酵的影響 在實驗過程中選擇1～11d為發酵周期，在其它條件不變的情況下，考察其對灰樹花發酵的影響，結果見圖7。

圖7 培養時間對灰樹花深層發酵的影響

由圖7可知，第9d時灰樹花產胞外多糖和菌體干重達到最大值，此后隨著時間的延長，胞外多糖產量及菌體生物量趨近于平穩，所以選擇9d作為發酵培養時間。

2.2 Plackett-Burman篩選實驗

根據碳源、氮源濃度、無機鹽元素配比、天麻濃度、培養時間的單因素實驗結果，設計 n=12的Plackett-Burman篩選實驗，每個因子取高（ +1）、低（-1）2個水平，發酵完成后以發酵液中胞外多糖的產量為響應值Y。參數和水平設計見表1，實驗結果見表2，各因素的效應評價及系數估計見表3。P＜0.05說明該因素是顯著的，可對該因素作進一步的考察。從表3可得，葡萄糖質量濃度、蛋白胨質量濃度、無機鹽配比和天麻質量濃度對灰樹花深層發酵產胞外多糖具有顯著性影響。

表1 Plackett-Burman實驗設計參數和水平

表2 Plackett-Burman設計矩陣及結果

表3 Plackett-Burman實驗設計結果分析

2.3 正交實驗

根據Plackett-Burman篩選實驗結果，對葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、天麻濃度及無機鹽配比4個因素進行正交實驗優化。根據單因素中4個因素的實驗結果，取各因素的最優值作為中間水平，進行L9（34）正交實驗。各因素選取水平情況見表4，實驗結果及分析見表5。

表4 正交實驗因素水平表

表5 正交實驗設計及結果分析

正交實驗結果說明，葡萄糖質量濃度是灰樹花深層發酵產胞外多糖的最顯著因素，其余三種因素的顯著性影響程度依次是蛋白胨、無機鹽配比、天麻質量濃度。從表5可知，四因素的最佳組合為：A′1B′2C′1D′2，即葡萄糖質量濃度30g/L，蛋白胨質量濃度5.5g/L，天麻濃度7g/L，KH2PO4質量濃度1.5g/ L，MgSO4質量濃度0.75g/L。按最佳發酵條件，分成A、B兩組進行灰樹花液體深層發酵，B組為不添加天麻的對照組。9d后測得A組胞外多糖質量濃度平均值為3.91g/L，B組的平均值為3.78g/L。與對照組相比A組胞外多糖產量提高了3.4%。

3 結論

通過在灰樹花深層發酵培養基中加入天麻的探索，得出添加天麻可提高灰樹花產胞外多糖產量。并通過Plackett-Burman篩選和正交實驗，確定了添加天麻后的最佳發酵工藝條件：葡萄糖質量濃度30g/L，蛋白胨質量濃度 5.5g/L，天麻濃度 7g/L，KH2PO4質量濃度1.5g/L，MgSO4質量濃度0.75g/L，培養9d，此時胞外多糖含量可達3.91g/L，與對照組相比胞外多糖產量提高了3.4%。實驗表明，添加適量的天麻到灰樹花發酵液中可促進其胞外多糖的產生，為今后進一步研究如何提高灰樹花產胞外多糖奠定基礎。

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Effects of Rhizoma gastrodiae on the submerged fermentation of Polyporus frondosus

HE Zong-yi，WU Tian-xiang*
（School of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The effects of Rhizoma gastrodiae on Polyporus frondosus in submerged were studied.The concentration of glucose，peptone and Rhizoma gastrodiae，and mineral salt ratio were confirmed as the four important factors by plackett-burman experiment.Then，the four important factors were optimized by orthogonal experiment design.The results showed that under the conditions of glucose 30g/L，peptone 5.5g/L，Rhizoma gastrodiae 7g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.75g/L，the yield of exopolysaccharide reached 3.91g/L，the production of exopolysaccharide increased by 3.4%compared with control group.

Polyporus frondosus；Rhizoma Gastrodiae；exopolysaccharide；culture

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0184-04

2010-07-21 *通訊聯系人

賀宗毅（1986-），男，碩士研究生，研究方向：應用微生物。

貴州省優秀科技教育人才省長資金項目［黔省專合字（2009）106號］。