亞硫酸法降解沙棘籽原花色素的條件優化1)

田亞新 王運來 韓曉云 劉繼偉 康傳紅

(黑龍江大學，哈爾濱，150080)

我國具有豐富的沙棘資源，在沙棘的根、莖、葉、果實中均有天然原花色素，其中以沙棘籽中原花色素的含量最高。原花色素是一類黃烷－3－醇類單體及其C4－C8或C4－C6鍵連接而成聚合體的多羥基酚類化合物，分子骨架為C6C3C6［1］，是植物生長過程中的次生代謝產物，因在酸性介質中加熱能產生花色素(anthocyanidin)而得名［2］，因其聚合體表現出單寧特性，因此也稱縮合單寧。原花色素具有良好的清除自由基、抗氧化和抗癌等生物活性，已廣泛的應用于食品、化妝品和醫藥等領域。沙棘原花色素的生物活性跟其聚合度密切相關，多聚原花色素因其分子量較大和位阻效應影響了酚羥基的活性［3］，導致其生物活性降低，而天然植物中的原花色素多以多聚體形式存在，因此，原花色素的降解研究受到廣泛關注。目前，研究較多的原花色素的降解方法有催化氫解［4］、微生物降解、亞硫酸降解等方法［5］，相對比較亞硫酸降解方法具備操作簡單、價格低廉等特點，更適合于規模生產。因此，文中采用亞硫酸作為降解試劑，尋求最佳降解條件。

1 材料與方法

沙棘籽，沙棘采自黑龍江省阿城縣，使用組織搗碎機破壞果肉，篩取沙棘籽干燥，再經組織搗碎機粉碎，過60目篩后備用。

沙棘籽原花色素粗提品制備:取干燥的沙棘籽粉20 g，加入一定量的石油醚，在回流裝置中20℃脫脂5 h，自然揮發除去殘余石油醚，得到脫脂沙棘籽粉。稱取20 g脫脂沙棘籽粉進行原花色素粗提，提取條件為60%酒精、料液比為1∶8(g∶L)、pH值為3、提取溫度為20℃，提取60 min(重復3次，合并提取液)，過濾，離心，旋轉蒸發濃縮提取液，得到原花色素粗提品。

沙棘籽原花色素亞硫酸降解單因素優化:60%乙醇溶解沙棘籽原花色素作為待降解溶液。取待降解液，加入一定量亞硫酸，按照設定溫度進行水浴降解。取降解后溶液1 mL，分別用甲醇和乙酸定容至2 mL，測定其500 nm吸光度值，計算出其平均聚合度。分別改變降解溫度、降解時間、料液比和亞硫酸用量，考察各因素對原花色素降解效果的影響。

式中:DP為平均聚合度;m為原花色素質量(μg);n為原花色素物質的量(μmol);M為單體(+)－兒茶素的相對分子質量。原花青素的質量按照傳統的香草醛—鹽酸法測得，物質的量則用香草醛—乙酸的方法測定［7］。

沙棘籽原花色素亞硫酸降解條件優化:根據單因素試驗結果，取反應溫度、反應時間、料液比、亞硫酸用量為優化因素，按照均勻設計表U11(1110)結構設計試驗方案。按照單因素的試驗流程進行降解試驗，測定原花色素的質量和摩爾量，計算平均聚合度，以平均聚合度為試驗結果進行多元回歸分析，得到最佳試驗方案和預測值。最后按照均勻設計法優化得到的試驗條件進行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 亞硫酸降解原花色素的單因素條件優化

2.1.1 反應溫度對降解效果的影響

為考查溫度對亞硫酸降解效果的影響，分別在溫度為50、60、70、80、90 ℃ 條件下進行水浴降解反應。試驗結果表明:在反應時間、料液比、亞硫酸用量一定時，隨著反應溫度的增加，平均聚合度逐漸降低，降解程度也逐漸增加。其中50～60℃變化最為劇烈，60℃以后變化趨緩，在溫度達到80℃時平均聚合度降至最低，原花色素降解效果最佳。

2.1.2 反應時間對降解效果的影響

原花青素的降解需要時間，為了考察反應時間對降解效果的影響，分別在降解時間為30、60、90、120、150 min條件下，檢測降解效果。試驗結果表明:隨著時間的延長平均聚合度降低，最初降解速率最快，30～60 min平均聚合度下降了10%左右，此后降解變慢，120 min時平均聚合度達到最低。

2.1.3 料液比對降解效果的影響

為考查料液比對亞硫酸降解效果的影響，配置料液比分別為1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12(g ∶L)，進行水浴降解反應。試驗結果表明:在其他條件不變時，隨著料液比的增加，平均聚合度有降低趨勢，但當料液比超過1∶9后，變化不明顯。

2.1.4 亞硫酸用量對降解效果的影響

亞硫酸作為降解劑，其用量對降解效果應該有一定的影響，在保證反應體系總體積一定的情況下，分別加入 0、1、2、3、4 mL 的亞硫酸，考察亞硫酸用量對降解效果的影響。試驗結果表明:在反應時間、反應溫度、料液比一定時，隨著亞硫酸用量的增加，平均聚合度逐漸降低，當亞硫酸用量為1 mL時，平均聚合度為最低值。

2.2 均勻設計法優化原花色素降解條件

通過原花色素單因素優化結果表明，反應溫度、反應時間、料液比和亞硫酸用量對降解都具有一定的影響。為了綜合考察各種影響因素，采用均勻設計法進一步進行降解條件優化。按照均勻設計表U11(1110)結構設計試驗方案，以平均聚合度為考察指標，進行設計優化。優化方案及結果見表1。

表1 沙棘籽原花色素亞硫酸降解均勻設計優化方案及試驗結果

按照表1數據，利用Excel中的Linest函數分別建立針對表1中各因素一次一元回歸方程、二次一元回歸方程、一次二元回歸方程，判斷復相關系數(R2，越接近1越好)，以及比較F統計值與置信度分別為0.05、0.01的臨界F值(通過 Finv函數計算)的大小(F統計值應大于臨界F值)，優選以上回歸方程，并再次利用Linest函數形成新的回歸方程為:y=0.000172x+18.730814x－0.000038x1x2x3+0.002352x1x3+0.000971x1x2－0.111792x1－0.040954x2+0.096 241x3－7.109 051x4+5.771 492，其中x1代表反應溫度(℃);x2代表反應時間(min);x3代表料液比;x4代表亞硫酸用量。

經計算，F統計值為22.35，置信度為0.01時的臨界F值為11.39，置信度為0.05時的臨界F值為5.19，F統計值大于臨界F值;R2=0.95，比較接近于1。由F統計值和R2值可以得出結論，得到的回歸方程顯著性較好。

利用Qbasic程序，預測到最佳降解時間為60 min、降解溫度為80℃、料液比為1∶8、亞硫酸體積分數為12%時，得到最低平均聚合度。按照以上方案進行驗證試驗，降解前平均聚合度為13.42，降解后平均聚合度為7.53，降解效果明顯。

3 結束語

考慮到試驗研究所考察的水平數較多，文中在單因素試驗的基礎上，采用均勻設計法設計試驗方案。均勻設計方法是一個空間填充設計方法，尋求試驗數值點內的均勻分散，其在合理的試驗組數內能夠暴露出各個因素以及因素之間對結果的影響情況，具有節約性、穩定性和靈活性等特點，目前，已在多個領域內廣泛應用。試驗結果表明，均勻設計法設計的試驗方案合理，結果可靠。

亞硫酸降解方法具備降解效率高、操作簡單、價格低廉等特點，非常適合于工業化生產。但是，考慮到沙棘籽原花色素主要用于食品和藥品，降解后亞硫酸的去除是一個非常值得重視的問題，需要科學工作者進一步地研究和探討。

［1］Prieur C，Rigaud J，Cheynier V，et al.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds［J］.Phytochemistry，1994，36(3):781－784.

［2］Gabetta B，Fuzzati N，Griffini A，et al.Characterization of proanthocyanidins from grape seeds［J］.Fitoterapia，2000，71(2):162－175.

［3］Jorge M.Ricardo D S，Darmon N，et al.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds［J］.J Agric Food Chem，1991，39(9):1549－1552.

［4］杜曉，唐偉，廖學品，等.落葉松多聚原花色素的Pd/C催化氫解反應研究［J］.化學研究與應用，2005，17(4):456－459.

［5］劉文潔，戴晶晶，周興燕，等.葡萄籽原花青素化學降解工藝研究［J］.食品工業科技，2009，30(7):229－231.

［6］田亞新.沙棘籽原花色素提取分離及性質研究［D］.哈爾濱:黑龍江大學，2008.

［7］姚開，何強，呂遠平，等.葡萄籽提取物中原花青素含量的測定［J］.食品與發酵工業，2002，28(3):17－19.