中性蛋白酶水解豌豆蛋白水解條件的優化及水解產物乳化性的研究

胡婷婷，胡二坤，吳欣欣，劉 奕，張 賽，郭興鳳*

（1.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河南職業技術學院 烹飪食品系，河南 鄭州 450002）

中性蛋白酶水解豌豆蛋白水解條件的優化及水解產物乳化性的研究

胡婷婷1，胡二坤2，吳欣欣1，劉 奕1，張 賽1，郭興鳳1*

（1.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河南職業技術學院 烹飪食品系，河南 鄭州 450002）

以生產淀粉的副產物豌豆蛋白粉為原料，研究了中性蛋白酶酶解條件對豌豆蛋白乳化性的影響.首先通過單因素試驗研究了加酶量、反應時間、底物濃度、反應溫度、pH值對豌豆蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響；在單因素試驗的基礎上設計響應面試驗，研究各因素及其交互作用對豌豆蛋白乳化性的影響，優化出的最佳酶解條件為：加酶量0.13%、反應時間32.5 min、pH8.0、反應溫度52.8℃，此時豌豆蛋白的乳化活性為35.82 m2/g，乳化穩定性為45.88 min，比改性前豌豆蛋白的乳化性有了明顯提高.

豌豆蛋白；中性蛋白酶；乳化性

0 引言

豌豆含有豐富的蛋白質、淀粉、礦物質、維生素［1］.豌豆蛋白的必需氨基酸組成比較平衡，與FAO/WHO推薦模式較為接近［2］.目前為止，我國豌豆加工重點是豌豆淀粉的提取利用，而對提取淀粉后的副產物豌豆蛋白粉尚未進行充分的開發和利用，目前絕大部分僅作飼料之用，造成蛋白質資源的浪費［3］.這主要是由于在淀粉加工過程中豌豆蛋白質發生變性，其功能特性受到影響，限制了其在食品工業中的應用，因此對這種副產物進行改性以提高其功能特性顯得十分必要.目前對植物蛋白的改性有物理法、酶法、化學法和基因工程法.酶法改性具有反應條件溫和、副反應少、改性程度易控制的特點，特別是在營養成分的保留上，具有不可比擬的優點，是目前常用的改性方法.

本試驗利用中性蛋白酶水解改善豌豆蛋白粉的乳化性，研究了加酶量、反應時間、底物濃度、反應溫度、pH值對豌豆蛋白乳化性的影響，在單因素試驗的基礎上采用響應面方法（RSM）優化改性條件，探索中性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉乳化性的最佳條件，并對酶改性前后豌豆蛋白粉的功能特性進行對比研究，以期為豌豆淀粉生產的副產物的開發利用提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試驗材料

豌豆蛋白粉：山東健源食品有限公司；中性蛋白酶（Neutrase 0.8 L）：諾維信中國投資有限公司；一級大豆油：中糧艾地盟糧油工業（菏澤）有限公司.

1.1.2 主要試驗試劑

十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉，均為分析純.

1.1.3 主要試驗儀器

CHA-S恒溫振蕩器：金壇市華峰儀器有限公司；LDA-2離心機：北京醫用離心機廠；FA25高剪切分散乳化機：上海弗魯克液體機械制造有限公司；722S可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠.

1.2 試驗方法

1.2.1 豌豆蛋白粉基本成分的測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3—2010《直接干燥法》；灰分含量的測定：參照GB 5009.4—2010《灼燒稱重法》；粗脂肪含量的測定：參照GB 5009.5—2003《索氏抽提法》測定；粗蛋白含量的測定：參照GB 5009.5—2010《凱氏定氮法》測定；氮溶指數的測定：參照GB 5511—85附錄A.

1.2.2 酶解過程

稱取一定質量（精確到0.000 1 g）的豌豆蛋白粉于錐形瓶中，加入Na2HPO4/KH2PO4緩沖溶液（1 mol/L/15 mol/L），預熱，加入蛋白酶后在恒溫振蕩器中振蕩酶解一定時間，沸水浴滅酶，冷卻后稀釋定容至1%底物濃度（g/mL），離心（4 000 r/min，10 min），取上清液待測.

1.2.3 乳化性的測定

用移液管量取上清液20 mL于100 mL小燒杯中，再加入10 mL大豆油，混合后用高速剪切乳化機以10 000 r/min的速度均質1 min，制得乳狀液.分別在0 min、30 min時用微量移液器吸取底部的乳狀液50 μL，加入25 mL 1 mg/mL SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液中混合均勻（稀釋500倍），以1 mg/mL SDS溶液作空白對照，測定其在500 nm處的吸光度A［4－7］.

乳化活性用乳化活力指數（EAI，m2/g)表示，即每克蛋白質的乳化面積.

式中：A0——0時刻的吸光度值；

ΔT——時間差，min；

ΔA——ΔT內的吸光度差.

1.2.4 豌豆蛋白酶改性產物的制備及性質研究

在酶改性豌豆蛋白乳化性的優化條件下制備豌豆蛋白水解液，冷凍干燥得到酶改性豌豆蛋白.分別在不同pH和鹽濃度條件下對酶改性前后豌豆蛋白溶解性、乳化性及乳化穩定性進行測定，研究中性蛋白酶對豌豆蛋白功能特性的影響.

式中：C——溶液中樣品蛋白質質量濃度，g/mL；

Φ——油相體積分數，Φ=1/3；

N——稀釋倍數，N=500；

L——比色池光徑，L=1 cm.

乳化穩定性（ES，min）用下式計算.

2 試驗結果與討論

2.1 原料基本組成成分（表1）

表1 原料組成成分 %

2.2 單因素試驗

2.2.1 加酶量對改性豌豆蛋白乳化性的影響

準確稱取1 g豌豆蛋白粉若干份于錐形瓶中，分別加入25 mL pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液（底物濃度4%，g/mL），按加酶量（酶與豌豆蛋白粉質量之比E/S，g/g）0.00%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%加入蛋白酶，酶解溫度為50℃，酶解時間60 min.加酶量對豌豆蛋白乳化性的影響見圖1.

1.2.1 供試材料發芽。按照《農作物種子檢驗規程》(GB/T 3543.4—1995)要求，從鑫兩優212雜交標準種、親本及純度待測樣品中均隨機取200粒種子，均勻置于發芽床上，在溫度為30 ℃、光照為750 lx、濕度為75%的條件下發芽3～7 d。

圖1 加酶量對改性豌豆蛋白乳化性的影響

從圖1可以看出：隨著加酶量的增加，乳化活性（EAI）逐漸下降，超過一定加酶量后水解產物的EAI迅速降低；而水解產物的乳化穩定性（ES）則隨著加酶量的增加逐漸上升.在蛋白酶催化下，蛋白質的分子結構發生變化，隨著酶解過程的進行，疏水性基團增多，使蛋白質平均疏水性增加，即親油性增加，蛋白質分子聚集在油滴表面，降低了油水界面表面張力，導致乳化活性降低.隨著加酶量的增加，酶解速率增大，蛋白質水解為較多的小肽，水解后的小肽較易吸附在油水界面的黏膜上，在油-水界面形成高黏彈性的保護膜，因此適當添加酶有助于乳化穩定性的提高.

2.2.2 酶解時間對改性豌豆蛋白乳化性的影響

準確稱取1 g豌豆蛋白粉若干份于錐形瓶中，分別加入25 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，按E/S0.12%加入蛋白酶，酶解溫度為50℃，酶解時間分別取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，酶解時間對豌豆蛋白乳化性的影響見圖2.

圖2 酶解時間對改性豌豆蛋白乳化性的影響

從圖2可以看出：隨著酶解時間的延長，EAI先升高后降低，而ES逐漸上升.蛋白質乳化作用涉及到同一分子中的親水基和疏水基及其在油-水表面形成保護膜的黏彈性以及抵抗形變的能力.隨著水解的進行，相對分子質量逐漸減少，溶液黏度下降，乳化性隨著酶解慢慢提高，但過度的水解造成蛋白質分子太小，不能在油-水界面形成高黏彈性的保護膜，因而乳化能力降低［8］；隨著水解時間的延長，豌豆蛋白的溶解性增加，可溶性蛋白分散在水中，有利于形成一個黏彈性好且穩定的膜，因此乳化穩定性逐漸增加.

2.2.3 底物濃度對改性豌豆蛋白乳化性的影響

分別用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液按底物濃度2%、4%、6%、8%、10%配制豌豆蛋白溶液，按E/S 0.12%添加蛋白酶，在50℃下反應30 min，底物濃度對豌豆蛋白乳化性的影響如圖3所示.

圖3 底物濃度對改性豌豆蛋白乳化性的影響

從圖3可以看出：ES隨著底物濃度的增加而逐漸上升，EAI隨著底物濃度的增加先上升，超過8%時趨于平緩.原因可能是：在一定范圍內增加底物濃度，酶與底物接觸機會增多，促進了酶解反應的進行；但是酶對底物有抑制現象，即隨著底物濃度的增大，體系流動性變差，底物與酶的接觸位點減少，酶解速率變慢［9］.

2.2.4 酶解溫度對改性豌豆蛋白乳化性的影響

圖4 酶解溫度對改性豌豆蛋白乳化性的影響

從圖4可以看出：當溫度從30℃升高到50℃，EAI和ES逐漸增加，而當溫度繼續升高，EAI和ES開始逐漸減少.其原因是：當酶解溫度在30～50℃時，隨著溫度的上升，中性蛋白酶活性逐漸增加，EAI和ES上升；但當溫度大于50℃時，隨著溫度的升高，中性蛋白酶受熱，引起維持酶分子結構的次級鍵解體，導致酶逐漸失活，水解速度下降，水解產物的乳化性逐漸下降［10］.

2.2.5 酶解pH值對改性豌豆蛋白乳化性的影響

分別用pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖溶液配制底物濃度（W/V）8%的豌豆蛋白溶液，按0.12%添加蛋白酶，在50℃下分別反應30 min，酶解pH值對豌豆蛋白乳化性的影響見圖5.

圖5 酶解pH值對改性豌豆蛋白乳化性的影響

從圖5可以看出：在一定pH范圍內，隨著pH增大，ES逐漸增大，EAI先增大后減少.這可能是因為：在一定pH范圍內，pH的變化直接影響分子的構象和酶分子及底物分子的解離狀態，促進或抑制酶的活性和酶促反應速率，造成了水解產物的乳化性能增加或降低［9］；在所選pH范圍內，隨著pH的增加豌豆蛋白的溶解性增加［11］，所以ES最后會逐漸上升.

2.3 響應面方法優化豌豆蛋白的改性條件

2.3.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，乳化性隨底物濃度的增加變化趨勢較緩，因此固定底物濃度8%，考慮加酶量、時間、pH值、溫度4個因素及其交互作用對酶改性豌豆蛋白乳化性的影響.以乳化活性和乳化穩定性為響應值，設計4因素3水平共29個試驗點的Box-Behnken Design響應面分析試驗，響應面試驗設計及結果見表2.

29個試驗點分為兩類：其一為析因點，共有24個析因點；其二為中心點，中心點重復5次，用于估計誤差，以乳化活性和乳化穩定性為響應值，經回歸擬合后，得到各試驗因子對響應值的二次多項回歸方程如下.

2.3.2 響應面試驗方差分析

表2 響應面試驗設計方案與結果

運用 Design Expert6.0.5軟件對29個試驗點的響應值進行回歸分析，各因素的方差分析見表3和表4.

從表3、表4可以看出，所建立的方程具有高度顯著性(α=0.01)，失擬項在α=0.05水平上不顯著，其決定系數分別為0.992 3和0.976 5，校正系數分別為0.970 3和0.963 0，說明各因素對乳化活性建立的模型能解釋97.03%響應值的變化，各因素對乳化穩定性建立的模型能解釋96.30%響應值的變化，說明建立的模型擬合程度較好，可以用于預測不同條件下的改性效果，優化中性蛋白酶改性豌豆蛋白乳化性的條件.

2.3.3 響應面試驗優化分析與結果

響應面分析方法的圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從曲面圖上可以看出最佳參數及各參數之間的互相作用.從各因素交互作用的響應面立體曲面圖中，可以看出本響應面試驗與單因素試驗的結論相吻合.其中酶解pH和溫度及其交互作用對豌豆蛋白乳化性影響見圖6和圖7.

表4 乳化穩定性各因素方差分析

圖6 酶解pH和溫度對改性豌豆蛋白乳化活性的影響響應面

圖7 酶水解pH和溫度對改性豌豆蛋白乳化穩定性的影響響應面

從圖6和圖7可以看出，當pH一定時，豌豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性都隨溫度的升高而增加；當溫度升高到一定值時，乳化活性和乳化穩定性又隨溫度的升高而呈下降趨勢.當溫度一定時，隨著pH的增加豌豆蛋白乳化活性和乳化穩定性總體呈先上升后下降的趨勢.因此在本試驗設定條件內，可以選擇一定的因素水平，使豌豆蛋白的乳化活性和乳化穩定性達到預測值.

2.4 模型驗證試驗

綜合考慮乳化活性和乳化穩定性兩個響應值，根據響應面優化得到最佳酶解條件，在實驗室條件下進行適當調整，在加酶量0.13%、時間32.5 min、pH8.0、溫度52.8℃、底物濃度8%的條件下水解豌豆蛋白粉，得到產物的乳化活性為(35.82±0.55)m2/g，乳化穩定性為 (45.88±0.63)min，根據回歸方程得到的預測值為：乳化活性35.78 m2/g，乳化穩定性46.10 min，試驗值與回歸方程的預測值吻合良好，證明該模型能較好地預測實際酶解情況.

2.5 中性蛋白酶改性豌豆蛋白的功能特性研究

2.5.1 pH對中性蛋白酶改性豌豆蛋白溶解性的影響

在溫度為30℃（不添加NaCl）的條件下測定pH對豌豆蛋白溶解性的影響,結果見圖8.

圖8 pH對豌豆蛋白溶解性的影響

由圖8可以看出，經中性蛋白酶改性后豌豆蛋白的溶解性明顯提高，酶改性前后豌豆蛋白在pH4.0左右時溶解度都最小，說明豌豆蛋白質的等電點在4.0左右，此時豌豆蛋白質所帶凈電荷最少，蛋白質與水分子間的相互作用最弱，而蛋白質之間的相互作用增強，分子間聚集形成聚集體，引起豌豆蛋白質的沉淀.當溶液的pH高于蛋白質等電點時，蛋白質發生酸式解離使其本身帶負電荷，且隨著pH的增大電荷數增加，導致蛋白質間的靜電排斥增加，分子分散性變好，因而溶解性增加；同理，當溶液pH低于等電點時，隨著pH的降低，蛋白質的溶解性增大［12-13］.

2.5.2 鹽濃度對中性蛋白酶改性豌豆蛋白溶解性的影響

在30℃，pH 8.0的條件下測定不同NaCl濃度對豌豆蛋白溶解性的影響，結果如圖9所示.

圖9 鹽濃度對豌豆蛋白溶解性的影響

由圖9可以看出，在低鹽離子濃度下，豌豆蛋白的溶解性隨著鹽濃度的增大而增大，這與大部分蛋白質的溶解規律相同［14］.在鹽離子濃度為0.2時，溶解性達到最大，此后隨著鹽離子濃度的增大，溶解性呈下降趨勢.鹽離子通過靜電屏障和干擾蛋白質—水分子相互作用影響蛋白質的溶解性.在較低鹽離子濃度下，靜電屏蔽占主要地位，作用強度與離子間的作用力和蛋白質種類有關，而與無機鹽種類無關，增加離子強度可以增加蛋白質的溶解性，表現為鹽溶作用；鹽離子濃度較高時，無機鹽對蛋白質—水相互作用的

干擾占主導，蛋白質—蛋白質相互作用增強，導致蛋白質分子聚集沉淀，蛋白質的溶解性隨著離子強度的增加而降低，表現為鹽析作用［12］.

2.5.3 pH對中性蛋白酶改性豌豆蛋白乳化性的影響

在30℃，不添加NaCl的條件下測定pH對豌豆蛋白乳化性的影響，結果見圖10.

圖10 pH對豌豆蛋白乳化性的影響

由圖10可知，豌豆蛋白改性前后的乳化活性和乳化穩定性隨著pH的變化與溶解性的變化趨勢基本一致，在等電點附近乳化活性和乳化穩定性最差，遠離等電點時乳化活性逐漸上升，在pH8.0左右達到最大.這是因為蛋白質的乳化性跟其本身的溶解性有很大的關系，在蛋白質乳化體系中真正起乳化作用的是可溶性蛋白［15］.豌豆蛋白經中性蛋白酶改性后乳化性有了一定程度的提高，pH8.0時改性前豌豆蛋白乳化活性為(24.57±0.75)m2/g，乳化穩定性為 (33.87±2.32)min，改性后乳化活性為(33.92±2.45)m2/g，乳化穩定性為(39.68±0.86)min，分別提高了38.05%、17.15%.

2.5.4 離子強度對中性蛋白酶改性豌豆蛋白乳化性的影響

蛋白質的乳化性受到諸如蛋白質濃度、溫度、pH、溶解度、離子強度等多種因素的影響.在30℃，底物濃度8%，pH為8.0的條件下測定豌豆蛋白的乳化性，不同離子強度對酶改性前后豌豆蛋白乳化性的影響見圖11.

由圖11可知，豌豆蛋白酶改性后的乳化性明顯好于改性前，且鹽濃度對豌豆蛋白改性前后乳化性的影響與其對溶解性的影響趨勢相同.在鹽濃度為0～0.2 mol/L時，豌豆蛋白酶改性前后的乳化性都隨著鹽濃度的增大而增大，乳化活性和乳化穩定性在鹽濃度為0.2 mol/L時達到最大，此后隨著鹽濃度的增大乳化活性和乳化穩定性逐漸降低.在較低離子強度下增加離子強度可以增加蛋白質自身所帶的電荷，增大蛋白質與蛋白質間的靜電排斥，分散性變好，蛋白質在水中的溶解性增大，進而提高蛋白質的乳化性.

圖11 鹽濃度對豌豆蛋白乳化性的影響

3 結論

以生產豌豆淀粉的副產物豌豆蛋白粉為原料，選定中性蛋白酶進行酶法改性.使用響應面方法優化酶解工藝，并進行數據處理，通過F值的計算加以分析，得到了中性蛋白酶改性豌豆蛋白的最佳條件為：加酶量0.13%、時間32.5 min、pH8.0、溫度52.8℃、底物濃度8%.改性前豌豆蛋白的乳化活性27.48 m2/g，乳化穩定性35.65 min；改性后豌豆蛋白乳化活性35.82 m2/g，乳化穩定性45.88 min，這兩項指標比改性前分別提高了30.35%、28.70%，大大拓寬了豌豆蛋白在食品工業中的應用范圍.

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EMULSIFYING PROPERTIES OF PEA PROTEINS MODIFIED BY NEUTRAL PROTEASE

HU Ting-ting1,HU Er-kun2,WU Xin-xin1,LIU Yi1,ZHANG Sai1,GUO Xing-feng1
(1.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China; 2.College of Cooking Food,Henan Polytechnic,Zhengzhou 450002,China)

Taking the byproduct pea protein powder of starch production process as materials,we studied the influences of neutral protease hydrolysis conditions on emulsifying properties of pea protein.Firstly,we studied the influences of neutral protease addition amount,reaction time,substrate concentration,reaction temperature,and pH value on the emulsifying activity and emulsifying stability of pea protein through single factor experiments.Then,we applied response surface methodology to study the influences of each factor and their interaction effect on the emulsifying protein of pea protein on the basis of single factor experiments,and determined the optimum hydrolysis conditions as follows： neutral protease addition amount 0.13%,reaction time 32.5 minutes,pH value 8.0 and reaction temperature 52.8℃.Under the optimum conditions,the emulsifying activity and emulsifying stability of pea protein were respectively 35.82 m2/g and 45.88 minutes,which were significantly higher than those of pea protein before modification.

pea protein;neutral protease;emulsifying property

TS201.1

B

1673-2383(2012)04-0029-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120829.1722.201204.29_007.html

網絡出版時間：2012-08-29 05:22:00 PM

2012-03-17

胡婷婷（1986—），女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為蛋白質資源開發與利用。

＊通信作者