一株產內切菊粉酶菌株培養條件的響應面優化

茍亞峰，王 丹，孫 丹，張 巖，葛 娟，高劍峰

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000)

菊芋(Jerusalem artichoke)原產于北美，后經歐洲傳入亞洲，在我國廣泛種植。菊芋適應性強，特別適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非農業耕地種植［1］，且產量高，價格低廉。菊芋塊莖中含糖量高，可達其干重的60%～70%，菊芋中的儲存性多糖是以菊粉(inulin)形式存在的，菊粉又名菊糖，由D－果糖殘基經β(l－2)糖苷鍵脫水縮合而成，直鏈結構，末端連接一個葡萄糖分子。菊粉的分子式表示為GFn［2］。菊粉酶(Inulinase)是能夠水解 β－2，1－D－果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶［3］名為 β－2，1－D－果聚糖酶(EC3.2.1)。菊粉酶的來源廣泛，自然界中的植物和動物消化道中的許多微生物都可以產生菊粉酶［4－5］。由于微生物生長繁殖快，生活周期短，酶產量高，并且能夠水解大量存在于菊芋等植物塊莖中的菊粉，用于生產果糖漿、低聚果糖、燃料酒精等［6－8］，具有十分重要的生產價值和廣闊的利用前景，內切型菊粉酶隨機作用于菊糖中間，水解產物主要是低聚果糖［9］。由于低聚糖具有防齲齒［10］、降血脂、抗腫瘤等功能，而且還具備獨特的能促進腸道中有益菌群雙歧桿菌增殖的生理活性，因此倍受食品科技界的重視［11］。功能性低聚糖的研究和開發被認為是21世紀重要的課題，隨著人們生活水平的提高，保健食品的需求量日益增加，這將為功能性低聚糖的研究和開發創造良好的機遇［12］，同時又為農副產品等自然資源的綜合利用提供了一個很好的發展途徑，前景十分廣闊［4－5］。本實驗從新疆石河子鹽堿地菊芋生長的根際土壤中經過初篩、分離純化和復篩后得到1株具有高產內切菊粉酶活力的菌株(G－60)，在單因素實驗基礎上，采用PB實驗設計方法考察8個發酵因素，篩選得出3個關鍵因素，再利用最陡爬坡實驗及 Central Composite Design 響應面設計［13－17］確定主要影響因素的最佳濃度，以提高內切菊粉酶酶活。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊粉 西安斯諾特生物技術有限公司;菌株選育培養基:初篩培養基(菊粉40.0g/L，蛋白胨10.0g/L，Na2HPO410.0g/L，NH4Cl 20.0g/L 瓊脂 15.0g/L，初始pH7.2)、發酵培養基(菊粉40.0g/L，酵母膏7.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，Na2HPO410.0g/L，NH4Cl 20.0g/L)、PDA培養基(馬鈴薯(去皮，切碎)200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂 20.0g/L，pH 自然［18］)、斜面培養基(查氏培養基［19］)。以上培養基在配制完成后，均需121℃高壓滅菌20min;3，5－二硝基水楊酸等所有試劑及藥品均為分析純。

HANNA pH211型PH計 烏魯木齊祥生儀器有限公司;721分光光度計 北京市六一儀器廠;SPX－80生化培養箱 上?？坪銓崢I發展有限公司;HY－B1回旋振蕩器 江蘇省金壇市醫療器械儀器廠。

1.2 產內切菊粉酶菌株的篩選

從新疆石河子鹽堿地菊芋生長的根際土壤中分組取土壤置于無菌水中，180r/min搖床振蕩分散。取樣液 1mL 按 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6稀釋后，涂布于初篩選培養基，28℃培養3～5d。挑取單菌落，平板劃線方法純化培養，移入斜面保藏。

將純化后菌種接種于PDA培養基上培養5～7d，待孢子成熟后刮取適量孢子與無菌水制成孢子懸液。250mL三角瓶中發酵培養基裝量50mL，加入上述孢子懸液 1mL，28℃，180r/min 振蕩培養 3～5d，然后進行復篩。

1.3 內切菊粉酶活力測定

1.3.1 酶液制備 將復篩得到的菌株按5%(體積分數)接種量接入裝量50mL發酵培養基的250mL的三角瓶中，28℃，180r/min搖床培養60h后，12000r/min、4℃離心10min取上清液即為酶液。

1.3.2 內切酶酶活測定方法 采用3，5－二硝基水楊酸法(DNS比色法):取1mL酶液，加入4mL 1.5%的菊粉溶液(pH為5.0，0.1mol/L醋酸緩沖液配制)，55℃水浴中保溫10min。取反應液0.5mL加入0.5mL DNS混勻，沸水浴反應5min，迅速冷卻并稀釋至5mL(在完全相同的條件下以滅活的酶液作為對照)，在波長540nm處測定其吸光度值，根據葡萄糖標準曲線計算樣品中還原糖含量［20－22］。

菊粉酶活力單位定義:在上述條件下，每分鐘生成1μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素實驗設計 分別以菊粉、蛋白胨濃度、初始pH和裝液量為單因素進行實驗，根據實驗結果確定Plackett－Burman實驗設計變量范圍。

1.4.2 Plackett－Burman實驗設計 Plackett－Burman設計法是一種兩水平的實驗設計方法，適用于從眾多考察因素中快速有效地篩選出最重要的幾個因素，試圖用最少實驗次數達到使因素的主效應得到盡可能精確的估計。對于N次實驗至多可研究(N－1)個因素，其中(N－4)個實際因素，3個虛擬變量用以誤差估計［23］。

選用N=12的Plackett－Burman實驗設計，對菊粉濃度、初始pH、蛋白胨濃度、酵母膏濃度、發酵時間、發酵溫度、裝液量和接種量8個影響內切菊粉酶活力的相關因素進行實驗研究。每個因素取兩個水平:低水平“－1”和高水平“1”，“1”為“－1”的1.25～1.5倍，一般實驗均選取1.5倍，另設三個空白項對應表中的X4、X8和X11，用以考察實驗誤差。響應值為內切菊粉酶酶活。自變量、編碼和水平因素見表1。

表1 Plackett－Burman實驗因子水平及編碼Table 1 Factors and levels in Plackett－Burman design

1.4.3 最陡爬坡實驗 根據PB實驗分析結果確定最陡爬坡實驗爬坡方向和步長，按一定的梯度增加菊粉和蛋白胨在培養基中的濃度，并按一定的梯度減少裝液量，其余5個因素均取初始濃度，檢測最終發酵液中內切菊粉酶酶活，從而確定菊粉、蛋白胨濃度和裝液量三個因素的最適濃度范圍。

1.4.4 Central Composite Design實驗設計 Central Composite Design實驗設計適用于2～5個因素的優化實驗。以PB實驗篩選得到的對最終發酵液中內切菊粉酶酶活影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡實驗得出的濃度作為中心點，以內切菊粉酶酶活為響應值，通過響應面分析對產酶條件進行優化。實驗因素與水平設計如表2所示。

表2 Central Composite Design實驗因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in Central Composite Design

1.5 數據處理

單因素實驗數據采用excel2003進行處理;Plackett－Burman實驗設計與內切菊粉酶酶活數據分析，采用Design－Expert軟件進行方差分析，建立回歸方程;采用 Design－Expert軟件對 Central Composite Design實驗內切菊粉酶酶活數據進行方差分析及多元回歸擬合。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 不同菊粉濃度對內切酶酶活的影響 由圖1可知，隨著菊粉濃度的增加，內切酶活力先增大后減小，達到55.0g/L時內切酶酶活達到最大。菊粉濃度較小碳源不足影響菌體生長，最終發酵液中內切菊粉酶活力小，隨著發酵液中菊粉濃度的增加內切菊粉酶活力逐漸增大，菊粉濃度為55.0g/L時碳源充足，最終發酵液中內切菊粉酶活力達到最大。發酵液中菊粉濃度大于55.0g/L時，碳源過量，發酵液黏度增加溶氧量減小，影響菌體生長，最終發酵液中內切菊粉酶酶活減小。

圖1 不同菊粉濃度對內切酶酶活的影響Fig.1 Effect of different content of inulin on the endoinulinase activity

2.1.2 不同蛋白胨濃度對內切酶酶活的影響 由圖2可知，蛋白胨濃度在13.0g/L時酶活達到最大值。隨著蛋白胨濃度的增加內切酶活力先增大后減小，蛋白胨濃度為13.0g/L時內切酶酶活達到最大。蛋白胨濃度較小氮源不足菌體生長緩慢，最終發酵液中內切菊粉酶活力小，隨著發酵液中蛋白胨濃度的增加內切菊粉酶活力逐漸增大，蛋白胨濃度為13.0g/L時內切菊粉酶活力達到最大。發酵液中蛋白胨濃度大于13.0g/L時，氮源過量，菌體快速生長發酵液黏度增加溶氧量減小，最終發酵液中內切菊粉酶酶活減小。

圖2 不同蛋白胨濃度對內切酶酶活的影響Fig.2 Effect of different content of peptone on the endoinulinase activity

2.1.3 不同pH對內切酶酶活的影響 由圖3可知，初始pH對內切酶酶活影響較顯著，pH在5.5～7.5之間酶活無明顯變化，小于5或大于7.5時內切酶酶活急劇下降。培養基pH小于5或大于7.5時，菌株不能正常生長菌液濃度極小，最終發酵液中內切菊粉酶酶活降低。

2.1.4 不同裝液量對內切酶酶活的影響 由圖4可知，裝液量與酶活顯示負效應關系，隨著裝液量增大酶活降低，裝液量為40～60mL之間酶活無顯著變化。裝液量減小溶氧充分，有利于菌體生長，隨著裝液量的增加單位體積發酵液獲得溶氧量減小，阻礙菌株生長，發酵液中菊粉內切酶酶活降低。裝液量很小時雖然單位體積發酵液菊粉內切酶酶活較高，但總酶液量減少，故選取裝液量為40～60mL進行Plackett－Burman實驗。

圖3 不同pH對內切酶酶活的影響Fig.3 Effect of different pH on the endoinulinase activity

圖4 不同裝液量對內切酶酶活的影響Fig.4 Effect of different liquid medium volume on the endoinulinase activity

2.1.5 不同接種量對內切酶酶活的影響 由圖5可知，接種量為6%時內切酶酶活達到最高，隨后接種量增大酶活無顯著變化。接種量增大有利于縮短發酵周期，使發酵菌種能夠快速進入對數生長期，由圖5可知接種量為5%時內切菊粉酶酶活已達到較大值，隨著接種量的進一步增大，酶活略有升高，但增大接種量對發酵液濃度和裝液量均產生影響，故取接種量為4%～6%進行Plackett－Burman實驗。

圖5 不同接種量對內切酶酶活的影響Fig.5 Effect of different inoculum concentration on the endoinulinase activity

2.1.6 不同發酵時間對內切酶酶活的影響 由圖6可知隨著發酵時間的延長酶活逐漸升高，發酵72h后，延長發酵時間酶活無明顯變化。發酵72h后，發酵液中營養成分減少，菌體生長進入穩定期，發酵液中菊粉內切酶酶活達到最大值。

表3 Plackett－Burman實驗設計結果Table 3 Plackett－Burman design layout and experimental results

圖6 不同發酵時間對內切酶酶活的影響Fig.6 Effect of different fermentation time on the endoinulinase activity

以此單因素實驗結果為依據選取 Plackett－Burman實驗設計變量范圍:菊粉濃度高水平“1”為60.0g/L，低水平“－1”為40.0g/L;蛋白胨濃度高水平“1”為15.0g/L，低水平“－1”為 10.0g/L;pH 高水平“1”為7.5，低水平“－1”為5.5;裝液量高水平“1”為60mL，低水平“－1”為 40mL;發酵時間高水平“1”為72h，低水平“－1”為48h;酵母膏濃度高低水平分別取 5.0、7.5g/L［18］;發酵溫度高低水平分別為27、29℃［19］;接種量高低水平分別為 4% 、6% 。

2.2 Plackett－Burman實驗設計結果與分析

Plackett－Burman實驗設計與結果見表3。采用Design－Expert軟件對表3中的內切菊粉酶酶活數據進行方差分析，得到了各影響因子的顯著性(表 4)。

表4方差分析結果表明，所得回歸方程達到顯著(p=0.0285＜0.05)，實驗數據的變異性可以用此回歸模型來解釋。在Plackett－Burman實驗設計的水平范圍內X6對內切菊粉酶酶活力影響極顯著(p=0.0057＜0.01)，X1和 X9對內切菊粉酶酶活力的影響顯著(p＜0.05)，其他因素在所考察的水平范圍內對內切菊粉酶酶活無顯著影響。因此，對G－60發酵生產內切菊粉酶最主要的影響因子是菊粉濃度(X1)、蛋白胨濃度(X6)和裝液量(X9)。其中，菊粉和蛋白胨的濃度對內切酶酶活產生正效應影響，裝液量對內切菊粉酶酶活具有負效應影響。選取此三因素為研究對象，做進一步的優化實驗。

表4 Plackett－Burman實驗方差分析Table 4 Variance analysis for Plackett－Burman experimental results

2.3 最陡爬坡實驗結果與分析

如表5所示，隨著菊粉、蛋白胨濃度和裝液量的變化，發酵液中的內切菊粉酶酶活先升高后降低，當菊粉濃度、蛋白胨濃度和裝液量分別為70.0g/L、22.5g/L和50mL時，所對應的最終發酵液中的內切菊粉酶酶活達到最大值14.48U/mL。選取菊粉濃度為70g/L、裝液量50mL和蛋白胨濃度為22.5g/L作為實驗中心點，進行Central Composite Design優化實驗。

2.4 Central Composite Design實驗設計結果與分析

以菊粉、蛋白胨及裝液量3個重要因素為自變量，各因素編碼水平如表2所示，Central Composite Design實驗設計及結果如表6所示。

表5 最陡爬坡實驗設計及其結果Table 5 The path of steepest ascent experiment design and response values

表6 Central Composite Design實驗設計及其結果Table 6 Central Composite Design design layout and experimental results

采用Design－Expert軟件對表6中的內切菊粉酶酶活數據進行方差分析及多元回歸擬合，得到了各影響因子的顯著性(表7)，獲得內切菊粉酶酶活力(Y)對自變量菊粉濃度A、蛋白胨濃度B和裝液量C的二次多項回歸模型方程為:

Y=－365.02951+55.28084A+42.46365B+6.40737C－4.52879A2－10.12536B2－0.054922C2+2.94000AB－0.030250AC－0.35633BC

由表7可知，方程失擬項不顯著(p=0.2005＞0.05)，說明回歸方程不失擬。方程模型極顯著(p=0.0013＜0.01)，說明方程能夠很好的擬和實驗結果。發酵液中菊粉濃度(A)在發酵中對內切菊粉酶酶活影響顯著;方程的二次項均極顯著;方程的交互項均無顯著差異。同時對回歸方程進行優化，刪除其中t檢驗不顯著項，將二項式方程方程簡化為:

Y=－365.02951+55.28084A－4.52879A2－10.12536B2－0.054922C2

表7 Central Composite Design實驗方差分析Table 7 Variance analysis for Central Composite Design experimental results

利用Design－Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面立體分析圖(圖7～圖9)。對回歸方程進行最值求解，得到模型極值點，即當菊粉、蛋白胨濃度和裝液量的值分別為66.5、21.9g/L和49.38mL時，響應值Y達到最大值，即內切菊粉酶酶活達到最高為23.57U/mL。

圖7 菊粉和蛋白胨對內切酶酶活交互影響的響應面圖Fig.7 Surface of mutual influence for inulin and peptone on the activity of Endoinulinase

根據響應面分析得到搖瓶發酵產內切菊粉酶酶活最高的工藝參數為:菊粉加量66.5g/L、蛋白胨濃度29.1g/L、裝液量49.38mL。在此條件下，內切菊粉酶酶活可達到23.57U/mL。為了驗證響應面分析的可靠性，結合實際實驗條件，選定菊粉65.0g/L、蛋白胨30.0g/L、裝液量50mL，其他不顯著影響因子不變，進行驗證實驗，經過3次平行實驗，測得最終發酵液中內切菊粉酶酶活力的平均值24.62U/mL，與理論預測值23.57U/mL接近，可見該模型能較好的預測實際內切菊粉酶酶活發酵情況。

3 結論

圖8 菊粉和裝液量對內切酶酶活交互影響的響應面圖Fig.8 Surface of mutual influence for inulin and liquid medium volume on the activity of endoinulinase

圖9 蛋白胨和裝液量對內切酶酶活交互影響的響應面圖Fig.9 Surface of mutual influence for peptone and liquid medium volume on the activity of Endoinulinase

在單因素實驗基礎上，利用Plackett－Burman實驗設計，考察影響菌株G－60發酵生產內切菊粉酶酶活的8個相關因素，包括:菊粉濃度、酵母膏濃度、蛋白胨濃度、發酵時間、發酵溫度、初始pH、裝液量和接種量，實驗結果表明菊粉、蛋白胨濃度和裝液量對內切菊粉酶酶活力影響顯著(p＜0.05)，其他因素在所考察的水平范圍內對內切菊粉酶酶活無顯著影響。

在Plackett－Burman實驗的基礎上，通過最陡爬坡實驗，確定Central Composite Design實驗設計中心，對菊粉、蛋白胨和裝液量3個顯著因素進行響應面優化，建立了內切菊粉酶酶活的二次多項式數學模型，分析了模型的有效性與因子間的交互作用，得到了菌株G－60發酵生產內切菊粉酶的優化工藝參數為:菊粉濃度66.5g/L、蛋白胨濃度29.1g/L、裝液量49.38mL。在此條件下，菌種產內切菊粉酶活力達24.62U/mL，優化前內切菊粉酶活力15.88U/mL相比提高了1.55倍。結合實際實驗條件，選定菊粉65.0g/L、蛋白胨30.0g/L、裝液量50mL時酶活達到最大值。

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