菊粉的酶法生物轉化在食品中應用的研究進展

戰榮榮，沐萬孟，李赟高，張 濤，江 波*

（江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

菊粉的酶法生物轉化在食品中應用的研究進展

戰榮榮，沐萬孟，李赟高，張 濤，江 波*

（江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

菊粉是我國分布廣泛、含量豐富的重要農副產品，利用菊粉酶對其進行生物深加工可高效實現菊粉在食品領域的低成本、多方向、高附加值利用。本文綜述國內外菊粉應用于食品的酶法研究開發現狀，對不同類型菊粉酶生物轉化產品的性質及食品應用、酶的微生物來源及菊粉酶的最新研究進展進行闡述。

內切型菊粉酶；外切型菊粉酶；菊糖果糖轉移酶；低聚果糖；高果糖漿；雙果糖酐

菊粉，又稱菊糖，是D-呋喃果糖以β-2,1-糖苷鍵連結而成的多聚果糖，其還原端連接一個葡萄糖基，呈直鏈結構，聚合度一般在30左右。菊粉是我國種植廣泛的重要農副產品，廣泛存在于菊芋、菊苣、牛蒡、大麗花等多種植物的根莖中[1]。菊粉作為一種膳食纖維，由于具有類似脂肪的質構與口感，被長期作為簡單的食品配料應用于食品加工[2]。然而，菊粉存在甜度低、水溶性較差等問題，進行更深層次、高附加值的生物產品開發成為充分利用我國豐富菊粉資源的新方向，也逐漸成為食品領域研究的熱點。

利用微生物發酵或酶解等現代生物轉化方法，菊粉有望實現多種形勢的高附加值產品轉化[3]。菊粉通過發酵策略可獲得單細胞蛋白[4]，檸檬酸[5]，生物燃料如生物乙醇[6]、單細胞油[7]，化學產品如丁二醇[8]、乳酸[9]及糖醇[10]等。菊粉高附加值酶法利用主要應用于食品領域，是借助生物菊粉酶生產食品行業重要的糖類或功能性糖類，其產物屬于天然產品，具有適合現代人們對食品安全性、健康性及功能性等需求的特點，逐漸成為菊粉生物轉化應用極其重要的方向。菊粉酶是菊粉酶法生物轉化的媒介，為糖酐水解酶32家族（glycoside hydrolase family 32，GH32）酶類，按其水解菊粉的方式分為內切型菊粉酶、外切型菊粉酶及菊糖果糖轉移酶3種類型[11]，它們是一類作用于菊糖β-2,1-糖苷鍵的水解酶，可將菊糖水解為不同的單糖或低聚糖?，F階段發現的微生物菊粉酶多來源于霉菌、酵母菌和部分細菌[12]，分布于胞外、胞內及胞壁中，各種微生物的產酶類型、酶活性及性質存在較大差異，且以產外切型菊粉酶微生物最多[13]，更有微生物可以同時產多種類型菊粉酶。菊粉酶通常以I/S的大小來區分內切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I、S分別是以菊粉、蔗糖作為底物時的酶活力，一般認為當I/S＜10時為外切菊粉酶，I/S≥10時為內切菊粉酶[14]，而菊糖果糖轉移酶通常利用高效液相色譜對酶反應產物雙果糖酐進行檢測鑒定[11]。菊粉酶的純化手段一般結合超濾、硫酸銨分段沉淀、離子交換和Sephadex凝膠過濾等，并利用HPLC進行產物分析。對于內、外切混合酶的分離一般采用NaCl線性梯度洗脫進行[15]。利用不同類型的菊粉作底物，菊糖內切型、外切型及轉移酶的主要轉化產物分別為低聚果糖、果糖和雙果糖酐，并逐漸成為這些糖工業化生產的重要方式。需要指出的是，新型菊粉酶作為利用菊粉進行功能性糖——雙果糖酐Ⅲ生產的重要方式，為菊粉在食品領域的應用提供最新研究方向，也為菊粉的酶學生物轉化提供更廣闊的開發空間，如下將以不同類型菊粉酶對菊粉在國內外食品領域的酶法研究及應用進展進行綜述。

1 內切型菊粉酶——低聚果糖

內切型菊粉酶可隨機斷開菊粉鏈內部的β-1,2-糖苷鍵，主要水解產物為低聚果糖，是菊粉食品應用中已商業化的重要開發形式，成為低聚果糖工業化生產的重要工藝。從20世紀80年代初日本及歐美等發達國家開始利用微生物菊粉酶水解菊芋制取果糖，到目前對菊粉低聚糖生產的研究仍然十分火熱。

1.1 低聚果糖的性質及食品應用

低聚果糖（inulooligosaccharides，IOS）為由2～10個果糖組成的低聚化合物，又稱果寡糖。IOS具有抗腫瘤和刺激雙歧桿菌生長的作用，也可作為膳食纖維用于防治糖尿病和減肥，還可用于改善腸胃功能降低血脂和預防高膽固醇等。在食品中具有廣泛應用，常被用于糖果、水果制品、牛奶制品、酸奶、鮮奶酪、烘焙食品、冰激凌和調味料等[16]。

1.2 IOS生產現狀及內切型菊粉酶生產IOS

利用微生物產內切型菊粉酶作用于菊粉可獲得較高純度的IOS，其副產物僅有少量果糖，逐漸取代以蔗糖為原料利用果糖基轉移酶酶解制備低聚果糖（fructose oligosaccharides，FOS）的工藝，并成為現階段IOS工業化生產的重要工藝。菊粉IOS的優良酶法生產工藝首先對微生物具有較高要求，是微生物產內切型菊粉酶在無外切酶及轉移酶存在時對菊粉進行的轉化方式，因此優良的內切型菊粉酶微生物資源對IOS的生產具有重要意義。能產生內切型菊粉酶的微生物有真菌如青霉屬、曲霉屬，酵母如克魯威屬、念珠菌屬，細菌如桿菌屬、假單胞菌屬等[17]，如表1所示。目前為止不同來源的菊粉資源，利用內切型菊粉酶固定化及現代分離純化手段可實現70%～95%的IOS轉化率。Nguyen等[18]通過殼聚糖固定化菊粉內切酶實現了菊芋汁固定床反應器的持續性發酵，其固定化酶的半衰期達48 d，IOS產率為66%。此外，菊粉底物的反應形式對IOS產量也有較為重要的影響。Jin Zhenyu等[28]發現，A. ficuum菌株所產菊粉內切酶利用菊芋汁的能力優于菊芋粉，可使IOS產量由50%增至80%。

表1 生產IOS的內切菊粉酶微生物來源Table 1 Biochemical properties of endo-inulinase derived from various microorganniissmmss

1.3 內切型菊粉酶的分子水平研究現狀

圖1 A.ficuum菌株菊粉內切酶INU2的晶體結構[[3344Fig.1 The crystal structure of endo-inulinase INU2 from A. fi cuum[34]

野生型微生物菊粉內切酶產量及酶活力等都相對較低，單一產內切型菊粉酶的微生物較少，使得酶制劑的純化工藝較難、生產成本較高，借助現代分子生物學技術構建因工程菌株、通過深入了解酶的結構及作用機制進行分子水平的基因改造等成為解決這一問題的有效途徑，也成為現在內切型菊粉酶的研究重心和熱點。Yun等[32]將Pseudomonas sp.內切菊粉酶基因進行原核表達使IOS的產率為78%，此后利用聚苯乙烯固定化及生物反應器等技術使菊粉內切酶50℃穩定工作17 d，IOS的產量達150 g/（L·h）。Kim等[33]先后探索了Arthrobacter sp.S37菌株菊粉內切酶基因EnIA的作用機制，E323、E519及D460是活性中心的關鍵氨基酸，E323及E519為親核基團，而D460為酶催化的必需基團，并嚴重影響該酶的pH值特性。2012年Pouyez[34]首次將內切型菊粉酶INU2（Aspergillus ficuum）晶體結構成功解析，如圖1所示，其晶體結構的催化中心比其他GH32水解酶類多一個催化反應口袋，這個口袋有兩個loop環和一段W-M（I）-N-D（E）-P-N-G保守序列構成，這個額外的反應口袋可能是形成內切菊粉酶活性的關鍵，也可有效解釋Trp40對其酶活具有重要作用及菊粉底物裂解機制。

2 外切型菊粉酶——高果糖漿

外切菊粉酶可作用于菊粉鏈非還原性末端的糖苷鍵，逐一水解釋放出果糖，是工業化生產高果糖漿的重要生產方式；高果糖漿（high-fructose syrup，HFS）是果糖含量高達90%的第3代果葡糖漿產品，目前在美、日等國，果葡糖漿已成為最重要的甜味劑之一，并且其生產發展勢頭強勁，已越來越受到國內外的重視與歡迎[35]。

2.1 HFS的性質及食品應用

果糖是一種天然營養甜味劑，甜度為蔗糖的1.8倍，為山梨醇的1.5倍，其甜度高、熱值低、具有類似蜂蜜的良好風味、結構組成等類似于蔗糖等特性使其成為優秀的果汁甜味劑和低熱值食品原料。果葡糖漿是工業化生成果糖時的混合產物，因生產原料及工藝方法不同果糖含量在40%～90%，此外還含有葡萄糖及低聚糖等成分。HFS作為高濃度果糖類強化甜味劑，具有高滲透壓、強保濕性、高發酵性、低冰點、甜味純正和保健性等多種特性，被廣泛應用于食品焙烤、飲料制品和食品配料等食品領域，成為蔗糖極具潛力的替代性糖產品之一。

2.2 HFS生產現狀及外切型菊粉酶生產HFS

HFS的制備策略較多，主要包括以菊糖、玉米淀粉、葡萄糖和蔗糖為原料的酶法和化學法。美國、日本和我國HFS的傳統工業化制備工藝是以玉米淀粉為原料利用異構酶酶法制備，然而該生產工藝復雜、生產成本也較高，成為HFS工業化生產及食品應用的瓶頸問題。20世紀70年代以后，各國開始關注以菊粉為原料，酸法和酶法水解制備果糖和高果糖漿的生產工藝。其中酸法制備高果糖漿果糖純度較高，但副產物多、色素重、分離精制難，依然不能滿足HFS的食品應用需求。而以菊粉為原料的酶法生產工藝為HFS的工業化生產及食品應用帶來曙光。依靠外切型菊粉酶的HFS生產被稱為一步法催化反應，它以其獨特的工藝簡單、成本低、得率高而備受青睞，逐漸成為國外HFS的主流生產工藝，外切型菊粉酶微生物來源如表2所示。Sirisansaneeyakul等[51]利用A. niger TISTR 3570（可產內切型及外切型菊粉酶）和Candida guilliermondii TISTR 5844菌株（僅產外切型菊粉酶）的菊粉酶混合物降解菊粉，25 h獲得18.2 g/L的果糖產品。Singh等[36]利用K. marxianus YS-1分泌的菊粉內切酶固定化于杜奧萊A568后利用菊粉生產HFS，結果表明菊粉的純度對HFS的產量影響不大，4 h產量達40 g/L左右。

表2 生產HPS的外切菊粉酶微生物來源Table 2 Biochemical properties of exo-inulinase derived from various microorganniissmmss

2.3 外切型菊粉酶的分子水平研究現狀

隨著菊粉外切酶的工業化發酵工藝日趨成熟，逐漸迎來了菊粉外切酶分子及原子水平的研究及機理研究的高潮。菊粉外切酶的基因INU1首次于1991年由Laloux等[55]從Kluyveromyces marxianus中克隆獲得，此后Gao Wei[53]、Liu Bin等[56]又從Bacillus smithii T7中成功克隆INU1基因，并利用化學修飾研究證實其酶的活性中心必定包含2個Trp和一個His殘基，組氨酸是酶與底物結合的關鍵位點，而色氨酸對其熱穩定性有重要的作用。此后Cao Tianshu等[54]又克隆獲得Cryptococcus aureus HYA的INU1基因，并利用pPICZαA載體在畢赤酵母X-33中成功表達。Emanuele等[52]利用動力學對其作用機制進行了研究，以工業化需求對進行動力學模型的溫度及底物濃度進行定義（分別為40～60℃和3～60 g/L），獲得產物果糖和菊糖底物的化學計量關系。目前，外切菊粉酶晶體結構已獲得解析，如Aspergillus awamori[57]及Geobacillus srearothermophilus SK1289p[47]。Aspergillus awamori菊粉外切酶是一種可連接5個寡糖的糖蛋白酶，如圖2所示，其催化區三級結構折疊為兩個區域：獨特的5片β-propeller折疊構成的N端催化區和折疊為β-sandwich結構的C端催化區，從催化中心側鏈殘基距離推測該酶遵循雙位移機制，Asp41及Glu241分別作為親核基團和催化基團，而Asp189通過氫鍵與底物作用，是重要的底物識別基團。

圖2 Aspergillus awamori 菊粉外切酶二級晶體結構[[5577Fig.2 The secondary structure elements of exo-inulinase from Aspergillus awamori[57]

3 菊糖果糖轉移酶——雙果糖酐Ⅲ

菊糖果糖轉移酶（inulin fructotransferase，IFTase）又稱新型菊糖酶，是一種新型的菊粉水解酶類，可從菊糖非還原末端以相鄰2個果糖基為單位水解菊糖糖苷鍵，同時伴隨分子內轉果糖基反應產生雙果糖酐。利用IFTase生產雙果糖酐的研究主要集中在日本和韓國，作為菊粉在食品應用的新型轉化方式，現階段主要應用于生物轉化開發雙果糖酐Ⅲ（difructose anhydride Ⅲ，DFAⅢ），目前已有日本甜菜制糖株式會社2009年采用北海道大學Arthrobacter sp. H65-7發酵產生IFTase[58]，已實現工業化生產DFAⅢ。然而，目前國內的研究僅本課題組趙萌[11]篩選獲得高產新菌株，并實現高效原核表達。隨后，杭華[59-61]通過中試擴大化酶膜反應器利用IFTase進行DFAⅢ的應用性生產研究，實現400 g/L DFAⅢ的超高濃度生產，為利用菊粉工業化生產DFAⅢ提供了極為重要的探索性研究。

3.1 DFAⅢ性質、食品應用及IFTase酶法生產

雙果糖酐又稱二果糖二酐，是由兩個果糖基組成的一類環狀二糖，其中兩個殘基的還原性末端和相對殘基的非還原性羥基連接，存在16種同分異構體[62]。通過微生物菊粉酶中的菊糖果糖轉移酶轉化菊糖可以合成雙果糖酐Ⅰ[63]、Ⅲ，而其他同分異構體至今仍難以獲得。到目前為止，發現產雙果糖酐I的菌株仍然較少，國際產IFTase的菌株主要集中在日本和韓國。日本食品國家研究所Haraguchi先后發現4株產IFTase菌株可用于生產DFAⅢ[80,82,84]，而現階段最高酶活力是由江南大學Zhao Meng等[64]發現的A. aurescens SK8.001菌株經原核表達實現，該菌株可實現胞內胞外同時產酶，最高胞內酶活力達119 U/mL，胞外酶活力也高達81 U/mL，這一研究成果有望為國內外深化利用IFTase進行菊糖的DFAIII工業化生產提供可能。

DFAⅢ是近年來人們發現的一種新型天然功能性甜味劑，具有促進Ca、Fe、Mg、Zn、Cu等礦物質元素的吸收、增進骨骼生長[65]、利于排尿、改善便秘[66]、預防結腸直腸癌[67]及抑制蛀牙[68]等功能，同時其甜度較高、能量值低，具有良好的耐熱、耐酸等理化特性，具有成為傳統甜味劑蔗糖替代品的潛能。作為無糖或低糖食品的關鍵配料，適用于焙烤食品、飲料、糖果等食品領域，促使其逐漸成為菊粉資源食品開發的重點和熱點方向。

3.2 IFTase生產DFAⅢ的微生物來源及分子水平研究現狀

利用菊粉酶法合成DFAⅢ是利用微生物IFTase水解菊粉獲得以DFAⅢ為主要產物的酶解策略，符合現代人們對食品領域天然產品的追求，也可有效實現菊粉的高附加值生物轉化。此外，利用菊粉還可以通過化學合成實現DFAⅢ的制備（或利用果糖、低聚果糖、果糖多糖原料等[69-70]），然而化學合成過程會產生多種雙果糖酐，且組分復雜，使DFAⅢ的分離純化困難，產量較低。而酶法合成DFAⅢ的副產物只有少量低聚果糖，可全面有效的解決化學法合成DFAⅢ所存在的問題，成為利用資源豐富的菊粉資源進行DFAⅢ工業化生產的最佳途徑，同時也對食品行業新糖源的開發具有重要意義。

酶解菊粉生產DFAⅢ的轉化效率與IFTase的酶學性質有直接關系。不同菌株來源的IFTase的基因序列具有高度相似性，但酶活力、最適作用條件、分子質量等具有較大差異，表3給出了迄今為止發現的所有可產DFAⅢ的微生物IFTase性質。自1972年Tanaka[54]首次于產脲節桿菌中發酵生產新型菊粉酶可將菊糖降解為DFAⅢ和少量的低聚果糖以來，此后陸續有13種產DFAⅢ的野生型菌株被報道，至今只有Jung等[71]解析了IFTase三聚體晶體結構，如圖3所示，并提出了分子內果糖基轉移反應機制，如圖4所示，IFTase三聚體結構形成僅可容納一個二糖的底物結合口袋，為酶催化的前提條件，其活性位點分布在單體間的界面，并有6個直接的作用點，4個位于F1，2個位于F2，果糖基F1上的O-1’分別與Arg292、Ser133側鏈結合，O-3’與Glu244羧基結合，O-’與Pro291結合；Asp233*位于另一個亞基上，Asp233*同時與果糖基F2上的O-3、O-4結合；Arg174*胍基與Asp233*羰基相互作用，可穩定Asp233*的定位；另外果糖基F1 O-4'及果糖基F2 O-6分別通過溶劑介導的氫鍵與Tyr197、Gln313結合。末端果糖基F1及相鄰果糖基F2在催化過程中分別作為電子供體、電子受體；Glu244的羧基進攻F1上的3-OH使其去質子化，從而激活受體果糖基F2；Asp233通過氫鍵為F2定位，使得去質子化的F1 3-O更有效地親核進攻F2 2-C，最終使得果二糖從菊糖上脫離。而其他可能存在的作用機理如活性位點殘基的鑒定及作用機制仍不夠清晰，這表明IFTase利用菊粉進行DFAⅢ的研究仍任重道遠，許多基礎性研究仍亟待開展。

表3 利用菊粉生產DFAⅢ的IFTase的性質及微生物來源Table 3 Biochemical and enzymatic properties of inulin fructotransferases (producing DFAⅢ）from various microorganisms

圖3 Bacillus sp. 菊糖果糖轉移酶的亞基結構（A）與晶體結構（B）Fig.3 Subunit structure (A) and crystal structure (B) of inulin fructotransferase from Bacillus sp

圖4 4Bacillus sp. 菊糖果糖轉移酶分子內果糖基轉移反應示意Fig.4 Proposed catalytic mechanisms of inulin fructotransferase from Bacillus sp

此外，一些微生物IFTase具有降解菊糖為DFAI的活性，如Arthrobacter golobiformis S14-3所產IFTase（可產DFAIII）為胞外酶，且以單聚體形式存在，與產DFAⅢ的IFTase具有較高同源性[72]。DFAⅠ作為非還原性糖，甜度為蔗糖的一半，是一種低熱量糖，現階段研究較少，也可作為食品領域菊粉酶法轉化的應用方向。

4 展 望

作為可再生資源的菊粉在食品應用中的高附加值開發應用研究仍處于初級階段。隨著不同微生物菊粉酶的開發，在食品中具有重要功能的IOS益生元和HFS甜味劑產品的研究已有較好基礎，工業化應用也日趨成熟，新型菊粉酶應用于功能性甜味劑DFAⅢ的生產作為新的菊粉開發形式，進一步拓寬了菊粉在食品領域的應用，這也有望成為食品研究的新熱點。此外，為實現菊粉在食品中的酶法高效轉化，除卻各種菊粉酶菌株的繼續發掘外，以提高酶學性質及產量為目的的各種現有野生型菌株的菊粉酶結構、作用機理及分子水平的基因改造成為新的研究熱點，這也必將為IOS、HFS及DFAⅢ等食品糖類的規?；a提供更深入的理論支撐。而利用超濾或納濾等現代酶膜反應器[85]進行新的酶底物反應模式研究，以及固定化技術、現代純化手段等可以有效增進產物轉化效率、降低能耗，也有望成為酶制劑的重要發展方向，這也必將對食品領域菊粉的酶法生物轉化提供更為廣闊的前景和發展空間。

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Enzymatic Biotransformation of Inulin for Application in Foods

ZHAN Rong-rong, MU Wan-meng, LI Yun-gao, ZHANG Tao, JIANG Bo*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Inulin, which is widely distributed and abundant in China, is an important agricultural and sideline product. Biotechnological processing of inulin with inulinase can provide an efficient approach for low-cost, multi-directions, and high-value-added development and utilization of inulin in the field of food. This paper reviews the current situation of research on enzymatic biotransformation of inulin for application in foods. Additionally, the properties of inulinasecatalyzed bio-transformation products and their applications in the food industry as well as the microbial sources and the latest progress of different types of inullinase are elaborated in depth.

endo-inulinase; exo-inulinase; inulin fructotransferase; inulooligosaccharide; high-fructose syrup; difructose anhydride

Q539；TS210.1

A

1002-6630（2014）03-0226-08

10.7506/spkx1002-6630-201403046

2013-03-12

國家自然科學基金項目（21276001；31171705）；江蘇省科技支撐項目（BE2011622；BE2011766；BE2010678；BE2010626）

戰榮榮（1984—），女，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：newlife.zrr@163.com

*通信作者：江波（1962—），男，教授，博士，研究方向為酶在食品生物制造中的應用。E-mail：bjiang@jiangnan.edu.cn