香菇子實體中水溶性多糖LFI和LFII的分級精制及其結構表征*

張洪濤，趙小亮，范尊曉，羅宸，朱莉，毛江川，詹曉北，毛延卿

1(江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(中國海洋大學醫藥學院海洋藥物教育部重點實驗室，山東青島，266003)

3(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫214000)

4(杭州眾芝康菇生物技術有限公司，浙江杭州，310015)

香菇多糖(lentinan，簡稱LNT)最初是由Chihara等人從香菇中分離得到β-1，3/6葡聚糖，因其生物活性強、安全性高、來源廣泛而引起人們的重視，近年來更是在國內外形成了一股開發香菇多糖的熱潮［1－3］。武漢大學的張俐娜教授在國內較早開展了香菇多糖的結構與流變學特性的研究，通過采用不同的溶劑實現了水溶性多糖和水不溶性多糖的分離與分級制備，并對不同組分的單糖組成進行了分析［4］，對水不溶性多糖中α-1，3葡聚糖的結構進行了表征［5］，但是對水溶性多糖組分進行結構表征方面的研究至今仍鮮有報道。

在闡明食品中功能因子的量效與構效關系研究日益強化的今天，對香菇子實體中水溶性多糖的結構進行表征將有助于深入地挖掘其功能，理解其功效機制。ZHANG等對純熱水提取的水溶性多糖進行了結構表征［6］，將其鑒定為含有 β-1，3/6 和 α-1，4/6 鍵的葡聚糖;WANG等用水提法對香菇子實體進行提取，獲得的多糖為β-1，3/6葡聚糖［7］;Jeff等在水提的基礎上，用DEAE-Celluose柱子依次用水，0.5 mol/L和1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，結果表明:水洗脫液中多糖為含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成的α-雜多糖［8］，NaCl流動相中的多糖則為含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成的β-雜多糖［9］。大量研究表明，不同提取流程獲得的多糖，其組成有差別［3］。因此，對不同的提取流程，仍需要進行多糖的結構分析與表征。

課題組在進行香菇多糖組分與組成分析過程中，主要采用了張俐娜教授所用的分離提取方法，如圖1所示。但是到目前為止，對水提取部分多糖LFI和LFII的結構、組成進行表征的工作仍然沒有進行。針對這一問題，本文主要利用IR，甲基化分析(GC-MS)和NMR技術對LFI和LFII的結構進行了表征與分析。此外，考慮多糖提取液中有色素、蛋白質、無機鹽、低分子量物質等雜質，針對這一問題，本文也對利用不同樹脂來除去香菇中提取多糖的色素方法進行了探索。本研究將為香菇子實體中可溶性多糖的提取、質量控制、功能挖掘與構效關系分析提供有用的信息與數據。

1 試驗材料與方法

1.1 水溶性多糖的分級提取

將香菇子實體真空干燥2.5 h，然后再在常溫下進行干燥，直到水分低于7%，用氣流粉碎機進行粉碎，粉碎物直接過120目振動篩，收集備用。水溶性多糖的提取參照ZHANG［5］等的方法，(1)稱取香菇多糖粉末 100 g，按 1∶20(g∶mL)溶于 0.9%NaCl水溶液中，60℃溶解12 h后8 000 r/min離心10 min，得到上清液LFⅠ;(2)沉淀按1∶20(g∶mL)比例加入到80℃水中，處理10 h后8 000 r/min離心10 min得到上清液LFⅡ。具體流程如圖1所示。

圖1 水溶性多糖的分級提取流程Fig.1 The procedure of water-soluble polysaccharides extracted from Lentinus

1.2 色素的去除

樹脂的預處理。AB-8和DA201:按1∶1.5將樹脂浸泡在95%乙醇中，24 h后裝柱水洗至無醇味。JK008:先用質量分數為5%的HCl浸泡，12 h后裝柱洗脫至中性;再用質量分數為5%的NaOH浸泡，12 h后洗脫至中性。

樹脂的選擇。分別量取20 mL上清液LFI和LFII，每份上清液中各加入 3 mL AB-8、DA201、JK008三種樹脂，確定了對提取液LFⅠ用6 mL AB-8樹脂/10 mL提取液，LFⅡ用2 mL AB-8樹脂/10 mL提取液進行色素脫除。

使用旋轉蒸發的方法濃縮脫色素的上清液LFI和LFII。將濃縮液置于磁力攪拌器上，分別緩慢加入95%的乙醇至乙醇終體積分數為75%，混合均勻后于4℃冰箱隔夜，4 500 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于水后，置于截流量為7 000 Da的透析袋中，用離子水透析，每12 h更換1次水，透析2天。將透析液減壓冷凍干燥后備用。

1.3 分子質量分布測定

凍干后的LFI和 LFII溶于水中，配成1 mg/mL(含0.2 mol/L NaCl)溶液，經過0.45 μm醋酸纖維素膜過濾(Whatman，Maidstone，UK)，然后用于高效凝膠色譜(HPSEC)-多角度光散射聯用 (MALLS)(DAWN HELEOSII，Wyatt Technology，USA)，SHODEX OHpak SB-803-HQ(8 mm×300 mm，Showa Denko K.K.，Tokyo，Japan)柱(SB-804-HQ 作為保護柱)于25℃進行分離。激光光源為He-Ne laser，658 nm線性偏振激光，檢測角度18個。0.1 mol/L NaNO3(含有0.02% 的疊氮化鈉)作為流動相，流速為0.5 mL/min。數據處理用Wyatt Astra software軟件。Mw(weight-average molecular weight)表示質均分子質量，Mn(number average molecular weight)表示數均分子量，分子質量分布指數(polydispersity index，PDI)用Mw/Mn來計算。

1.4 多糖LFI和LFII的傅里葉變換紅外光譜(IR)分析

采用KBr圓盤法處理［10］:在紅外燈照射下，取少許多糖和3～4勺KBr(多糖∶KBr質量比約為1∶50)于研缽中研細，取適量壓成透光薄片，上樣，使用Nicolet Nexus 470 FT-IR紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內進行檢測分析，分辨率設置為32 scans/4 cm－1，分析軟件為 Omnic software(version 7.0)。

1.5 多糖LFI和 LFII的核磁共振(NMR)分析

NMR分析樣品的準備:將50 mg多糖LFI和LFII分別在P2O5真空干燥箱中充分干燥后溶解于0.5 mL D2O中，真空冷凍干燥，重復3次，最后將樣品用0.5 mL DMSO－d6溶解轉移至核磁管中，在25℃下進行一維1H-NMR分析和13C譜NMR分析，采用MestReNova軟件進行數據輔助解析。

1.6 多糖LFI和 LFII的甲基化及氣質聯用(GC/MS)分析

甲基化:充分干燥的LFI和 LFII多糖樣品2 mg置于微量反應管中，加入攪拌子，N2保護下加入1 mL無水DMSO，超聲波助溶5 min，攪拌使其充分溶解。隨后加入處理后NaH約50 mg，室溫攪拌反應1 h，緩慢滴加0.5 mL CH3I反應1 h，加入1 mL ddH2O終止反應。向反應混合物中加入1 mL氯仿萃取，4 500 r/min離心10 min收集氯仿層，經減壓濃縮至干，用少量氯仿溶解轉移至安瓿瓶中干燥后中加入2 mol/L三氟乙酸振蕩溶解后于110℃水解4 h。將水解產物轉移至微量反應瓶，加入0.5 mL dd H2O完全溶解后，加入0.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液(含0.48 mol/L NaBD4)室溫反應4 h。反應結束后加入20%的醋酸水溶液(約100 μL)至反應液pH呈中性。反應物經減壓濃縮至干后于真空減壓干燥箱中干燥。再加入0.5 mL無水吡啶溶解，攪拌溶解后，加入0.5 mL乙酸酐反應1h后，加入1 mL ddH2O淬滅，反應物加入二氯甲烷萃取3次，合并萃取液后再用2 mL ddH2O萃取4次，棄去水相，收集二氯甲烷層，減壓濃縮至干后于真空干燥箱中干燥后備用。

GC-MS分析:樣品用適量二氯甲烷溶解后進樣GC-MS分析。參照 CCRC(complex carbohydrate research center，http://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)數據庫進行數據分析。

2 實驗結果

2.1 樹脂用量對脫色率和多糖保留率的影響

AB-8、DA201兩種樹脂的用量對香菇多糖提取液脫色率和多糖保留率的影響如圖2所示(由于JK008脫色效果極弱，數據未展示)。從圖2可以看出，與DA201樹脂相比，AB-8樹脂對提取液LFⅠ、LFⅡ中的色素吸附效果較好，AB-8對多糖的吸附率也高于DA201樹脂。優化結果為:對提取液LFI用6 mL AB-8樹脂/10 mL提取液，LFII用2 mL AB-8樹脂/10 mL提取液進行色素脫除，此條件下色素脫除率分別為72%和53%，多糖保留率分別為43%和62%。AB-8有著較好的脫色和脫蛋白效果。

圖2 AB-8和DA201樹脂用量不同對LFI(LF1)和LFII(LF2)中色素脫出和多糖保留的影響Fig.2 The effect of amount used AB-8 and DA201 on pigments removing and polysaccharides keeping

2.2 分子質量分布分析

LFI和LFII分子質量如表1所示。從表1可以看出，LFI的Mw是1.350×106g/mol，LFII的 Mw 是2.771×106g/mol。LFII的分子質量比LFI大，這是由于LFII的提取溫度較高造成的，因為溫度越高，多糖的溶解性越好。Mw/Mn是衡量分子均一的指標，比值接近1支鏈越少，支鏈比較多的甚至高達20～50。LFI和 LFII的Mw/Mn分別是1.010和1.029。

2.3 IR光譜分析

LFI和LFII的紅外光譜如圖3所示。圖3中在2 931 cm－1和1 362 cm－1處有2組吸收峰，該吸收峰分別代表了糖類化合物C—H伸縮振動和變角振動，而在3 390～3 420 cm－1吸收峰則代表了糖類化合物O—H 伸縮振動［11］，為多糖特征吸收峰［12］，1 249 和1 643 cm－1處也為多糖的特征吸收峰，這些峰在LFI和LFII的IR圖中均可以看到，這說明兩者均為多糖。950～1 250 cm－1有強吸收峰，表示其為呋喃單體，在LFI和 LFII中均可以看到，說明LFI和LFII的單糖組成為呋喃單體類型。

表1 LFI和LFII分子量Table 1 Experimental results of the Mw and Mn of LFI and LFII at 25℃

圖3 LFI和 LFII紅外光譜Fig.3 IR spectra of LFI and LFII

1 732 cm－1處為－COOH中 C=O的特征吸收峰和1213 cm－1處－COOH中OH變角振動吸收峰，LFI和LFII的紅外光譜中均沒有觀察的該吸收峰，這表明LFI和LFII均不含葡萄糖醛酸。810 cm－1是甘露糖特征吸收峰［12］，LFI和 LFII的IR圖譜觀察到810 cm－1，表明LFI和 LFII均含有甘露糖。

在926 cm－1、844 cm－1和822 cm－1處有吸收峰為α-(1→3)-D-葡聚糖的特征吸收［5］。920 cm－1是 α-D-葡聚糖的特征吸收峰，LFI的紅外光譜圖中觀察到927 cm－1吸收峰，這表明LFI含有α-D-葡聚糖單元。

890 cm－1處吸收是 β-吡喃糖苷鍵的特征峰［11，13－14］，從 LFII的 IR 圖中可以看到，在 889 cm－1有吸收峰，則表示LFII分子中有β-D-Glc的C—H差相異構吸收峰，即LFII中含有β呋喃構型糖單元。β型葡聚糖C—H直立鍵在(891±7)cm－1有弱吸收，LFII的IR圖中可以看到在921 cm－1有吸收峰表明LFII含有β-D-Glc單元。

2.4 NMR分析

LFI和 LFII樣品在 DMSO/D2O中的600 MHz1H-NMR圖譜如圖4所示。在1H-NMR圖譜中，β-鍵在4.1～4.9 ppm范圍內有峰，而α-鍵在5.0～5.6 ppm范圍內有峰出現［15］。由圖4知，LFI和 LFII均既含有β-鍵也含有α-鍵。對于13CNMR分析，C1的信號峰一般在100～104 ppm C2，C3，C4，C5和 C6的在60～80 ppm，如果含有糖蛋白則會在20～40 ppm 出現信號峰［16］。δ(C3)(86.7/86.8/86.9 ppm)和δ(C6)(68.8/68.9 ppm)表明多糖存在1，3-和1，6-鍵型的糖單元［17－18］，LFI 和 LFII的均含有這 2 個特征峰，這表明LFI和 LFII均含有1，3-和1，6-鍵型。

圖4LFI(a)和LFII(b)的1H-NMR圖譜Fig.4 1H-NMR chemical shifts of LFI(a)and LFII(b)

LFI和 LFII的1H-NMR譜圖如圖4所示，δ4.96 ppm為α-1Xyl的H1信號峰，δ4.72 ppm為β-1Xyl的H1信號峰，δ4.53 ppm 為β-1Glc6的H1信號峰 (參考http://cell.ccrc.uga.edu/world/xgnmr/)。

圖5LFI(a)和LFII(b)的13C-NMRFig.5 13C-NMR chemical shifts of LFI(a)and LFII(b)

LFI和LFII的13CNMR分析如圖5所示。從圖5中可以看出，LFI和LFII均含有δ103.4的信號峰，這表明兩者均含 β-鍵糖單元［19］。LFI的1H-NMR含有的 δ4.52為 β-1，3，6鍵連接的 Glc的1H 信號峰，δ4.68為β-1，3鍵連接的Glc的1H信號峰，δ4.96為α-1，6 鍵連接的 Glc的1H 信號峰［20］，δ5.22 為 α-1Glc的1H 信號峰，δ5.47 為 α-1Glc4-鍵的1H 信號峰［21］。LFII的1H-NMR 含有的 δ4.53為 β-1，3，6鍵連接的Glc的1H信號峰，δ4.68為β-1，3鍵連接的Glc的1H信號峰，δ4.96為α-1，6鍵連接的Glc的1H信號峰，δ5.22 為 α-1Glc的1H 信號峰［7］。

2.5GC-MS分析

利用改良的Hakomori方法，樣品LFI和LFII依次經甲基化、水解、還原、乙?；筮M行GC-MS分析所得的GC-MS圖譜如圖3所示。參照CRCC(complex carbohydrate research center，http://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)數據庫中的標準譜圖進行數據分析。香菇中多糖成分主要由葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖組成［4，8－9］，結合 IR 和NMR數據，樣品LFI的各單糖衍生物質譜數據如表2所示，樣品LFⅡ的各單糖衍生物質譜數據如表3所示。1，6-Man和1，4，6-Man主要根據已經報道的香菇多糖水提取多糖中Man的鍵型為α，因而將其歸為α-1，6-Man 和 α-1，4，6-Man［9，22－23］。

3 討論

與WANG等［7］利用水提法從香菇子實體中獲得的多糖為β-1，3/6-葡聚糖不同，本研究中的所提取、獲得的水溶性多糖組份為由葡萄糖，半乳糖和甘露糖組成的雜多糖，這一結果與Jeff等的研究中關于水溶性多糖的單糖組成分析相一致［8－9］，但是在Jeff等的報道中，純水提取的多糖為 α型多糖，0.5 mol/L NaCl提取的多糖為α和β混合型多糖，本研究所獲得的LFI和LFII均為α和β混合鍵型多糖;LFI多糖組分由 α-1Man，β-1Glc，α-1Gal，β-1，3-Glc-，α-1，6-Glc-，α-1，4-Glc-和 α-1，4，6-Man-糖單元組成。LFII多糖組分由 α-1Xyl，α-1Gal，β-1Glc，β-1，3-Glc-，β-1，6-Glc-，α-1，6-Man-，β-1，3，6-Glc，α-1，4，6-Man-和 α-1，2，6-Gal-糖單元組成。

表2 基于GC-MS技術的LFI甲基化分析Table 2 GC-MS analysis of alditol acetates of LFI

表3 基于GC-MS技術的LFII甲基化分析Table 3 GC-MS analysis of alditol acetates of LFII

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