提高飼料中志賀氏菌檢測準確性的技術方法研究

趙光華 馬紅芳 董小海 胡京枝

（河南省農科院農業質量標準與檢測技術研究所，河南鄭州 450002）

志賀氏菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，人類和靈長類是其適宜宿主。但近年來，越來越多的動物病理研究表明，志賀氏菌除感染人類引起痢疾之外，還能感染猴、犢牛、仔豬、雞、鴨等動物，成為動物的新發病原菌[1-2]。志賀氏菌極易產生耐藥性，并且能在養殖場內發生水平、垂直傳染，給養殖企業管理帶來很大困難，有時甚至會造成重大經濟損失。隨著養殖規模的擴大、飼料工業的發展，動物源性成分在飼料中的使用比例逐漸增高，由此帶來飼料受致病菌污染的風險逐漸增大。因此，飼料受志賀氏菌污染的風險也在迅速提高[3]。

生物技術的發展，帶動了志賀氏菌的檢驗技術也在不斷完善，目前已形成常規生化鑒定方法、免疫學方法、分子生物學方法等三大類方法[4]。各類方法均有明顯的優缺點，但生化鑒定方法是唯一的仲裁國標方法，具有相當高的鑒定準確性，大多數的法定檢驗機構都在使用該方法，但也存在一定的漏檢率，特別是菌相復雜、干擾菌比較多的情況下，漏檢率更高[5]，對養殖企業、飼料生產企業等帶來很多非常不利的影響，甚至產生嚴重的經濟損失。本研究結合檢測工作實際，對國標生化鑒定方法檢測飼料中志賀氏菌過程中存在的問題進行了優化試驗，提出了很好的優化方案，經歷了實際工作的檢驗，進一步提高了飼料中志賀氏菌檢測的準確性，取得了良好的檢測效果。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

大腸埃希氏菌（Escherichia coli,CMCC44102）、志賀氏菌（Shigella,CMCC51571）、沙門氏菌（Salmonella,CMCC50071），中國藥品生物制品檢定所；腸道增菌肉湯、GN增菌液、志賀氏菌增菌液、XLD培養基、HE培養基、EMB培養基、SS培養基、沙門氏菌生化鑒定管、志賀氏菌生化鑒定管、大腸埃希氏菌生化鑒定管，青島海博生物工程公司。

全自動微生物鑒定系統（BIOLOG MicroStationTM）、GENⅢ細菌鑒定板（GEN III MicroPlateTM），美國BIOLOG公司。

電熱恒溫培養箱、生物顯微鏡、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 增菌培養基的優化試驗

分別取沙門氏菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌斜面菌株各一接種環，接種于100 ml營養肉湯培養基中，37℃培養18 h，然后分別轉種于腸道增菌肉湯、GN增菌液、志賀氏菌增菌液中，接種量為一接種環，37℃培養6 h。培養物在EMB平板上劃線分離，37℃培養18 h，觀察菌落生長情況。各隨機挑選10個菌落，用全自動微生物鑒定儀并加血清學試驗進行鑒定，分析不同增菌培養基對志賀氏菌的增菌效果。

1.2.2 增菌時間及增菌條件的優化試驗

將沙門氏菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌營養肉湯混合培養物分別接種于兩組1.2.1中對志賀氏菌增菌效果最好的增菌液中，接種量各一環，一組于37℃好氧條件下分別培養0.5、6、20，另一組于37℃厭氧條件下分別培養0.5、6、20。將兩種培養條件不同培養時間的增菌液分別于EMB平板上劃線分離，37℃培養18 h，觀察菌落生長情況。并隨機挑選10個菌落，用全自動微生物鑒定儀并加血清學試驗進行鑒定，分析不同增菌培養基對志賀氏菌的增菌效果。

1.2.3 選擇性分離培養基的選擇

取1.2.1中的對志賀氏菌增菌效果最好的混合增菌液，分別于XLD、HE、SS、EMB培養基平板上劃線分離，37℃培養18 h,觀察菌落生長情況，記錄志賀氏菌疑似菌落和雜菌菌落。挑選10個疑似菌落，用全自動微生物鑒定儀并加血清學試驗進行鑒定，分析不同分離培養基對志賀氏菌的選擇性分離效果。

1.2.4 生化試驗

對1.2.3中XLD分離培養基上挑選的10株疑似志賀氏菌分別進行營養瓊脂斜面純培養，分別用志賀氏菌生化鑒定管和GENⅢ細菌鑒定板進行生化鑒定試驗，結合血清學鑒定結果，分析兩種生化鑒定方法的準確性。

2 結果

2.1 由表1可知，選擇三種增菌液分別增菌6 h后，在EMB平板上分離驗證，志賀氏菌增菌液在有沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下對志賀氏菌的選擇性增菌效果最好。隨機挑選的10株菌中，經鑒定志賀氏菌有6株，占60%的比例，這是因為增菌液中添加了新生霉素提高了對沙門氏菌的抑制作用，減少了沙門氏菌的干擾。腸道增菌液和GN增菌液在有沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，對志賀氏菌的選擇性增菌效果不顯著，腸道增菌液中大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌均得到增殖，未體現出對志賀氏菌的選擇性，GN增菌液中沙門氏菌增殖效果較好，可能是沙門氏菌的優勢增殖抑制了志賀氏菌的生長。

表1 3種腸道增菌液對志賀氏菌增菌效果比較

2.2 由表2可知，志賀氏菌增菌液在不同增菌時間、不同增菌條件下對志賀氏菌的選擇性增菌效果差異明顯。試驗結果顯示，37℃厭氧增菌條件下，不同增菌時間對志賀氏菌的增菌選擇性均比37℃好氧條件下的選擇性好，特別是存在沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，這很符合飼料樣品中的菌相特征。因為志賀氏菌、大腸埃希氏菌均為兼性厭氧，所以厭氧條件下抑制了沙門氏菌的快速增殖。在增菌時間上，增菌6 h時對志賀氏菌的選擇性最好，隨著增菌時間的延長，選擇性又有降低的趨勢。

表2 志賀氏菌增菌液中不同增菌時間、不同增菌條件對志賀氏菌增菌效果比較（%）

2.3 XLD、HE、SS、EMB四種培養基中，均含有乳糖成分，抑菌劑、酸堿指示劑等略有不同，典型的志賀氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌均可形成典型菌落，具有較好的選擇性，但在檢測宋內氏志賀氏菌時，因其乳糖發酵陽性，與大腸埃希氏菌、乳糖遲緩陽性的沙門氏菌在XLD、HE、SS、EMB四種培養基上具有相似的培養特性，選擇性較差。但在檢測實踐中，經多次試驗，仍然發現上述四種分離培養基對志賀氏菌的選擇性分離有明顯差異，結果見表3。從上述四種培養基中挑選出的各10株疑似志賀氏菌，經后續鑒定，XLD培養基上鑒定志賀氏菌的準確率最高，EMB培養基的準確率最低，故可優先選用XLD培養基。

2.4 志賀氏菌的生化反應復雜，常規生化試驗因人員影響、試劑影響等造成試驗誤差較大，本試驗選用美國BIOLOG全自動微生物鑒定儀結合GENⅢ細菌鑒定板進行自動化生化鑒定試驗，鑒定準確率高，結果重現性好，克服了人員和試劑誤差，鑒定結果見表4。

從表4可以看出，不論是福氏志賀氏菌還是生化反應明顯不同的宋內氏志賀氏菌，BIOLOG全自動微生物鑒定儀結合GENⅢ細菌鑒定板均能準確鑒定出結果，鑒定結果的可信性高達100%，并且在18～48 h的培養 時間內，鑒定結果非常穩定。

表3 不同選擇性培養基對志賀氏菌的分離效果比較

表4 BIOLOG全自動微生物鑒定儀對志賀氏菌的鑒定結果

3 討論

3.1 本試驗是利用陽性菌株添加的方法進行試驗設計，樣品菌相明確。在實際樣品檢測過程中，樣品菌相復雜，但沙門氏菌、大腸埃希氏菌是最主要的干擾菌，與本試驗設計的干擾因素是一致的。在對疑似菌落進行確證試驗時，陽性率比本試驗結果偏低，因此在分離平板上挑選可疑菌落時，應增大挑選可疑菌落的數量，特別是存在沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，以免發生漏檢。

3.2 通過本試驗發現，增菌過程對志賀氏菌的檢測準確性影響很大，因為沙門氏菌、大腸埃希氏菌的優勢增長，可能對志賀氏菌的增長產生很強的抑制作用，造成后期選擇性分離或TSI試驗時，挑選不出可疑菌落，造成漏檢。因此，志賀氏菌的增菌條件、增菌培養基選擇、增菌時間等應嚴格控制。

3.3 在檢測宋內志賀氏菌（D群）時，因宋內志賀氏菌與大腸埃希氏菌、類志賀鄰單胞菌等極為相似，生化反應與A、B、C群也有很大區別，極易造成漏檢?？捎蒙抽T氏菌顯色平板和EMB平板進行分離，沙門氏菌顯色平板上藍色菌落而EMB平板上無色菌落則可視為宋內志賀氏菌可疑菌落，再進行生化及血清學鑒定，此方法不易漏檢。

3.4 沙門氏菌屬和部分志賀氏菌屬均能代謝利用甘露醇，因而在GN增菌液中均能快速增殖，要特別注意志賀氏菌屬與不產硫化氫的沙門氏菌和變形桿菌的區別。由于都不發酵乳糖或遲緩發酵乳糖，它們在XLD、HE、SS、EMB培養基平板上都有相似的菌落特征，大都為無色半透明菌落，容易漏檢或錯判?？梢赃x用沙門氏菌顯色培養基、志賀氏菌顯色培養基結合TSI生化試驗來加以鑒別。

3.5 志賀氏菌屬沒有動力，沒有鞭毛抗原，主要是菌體（O）抗原，個別志賀氏菌有K抗原，并且極個別志賀氏菌會發生自凝集反應。某些不活潑的大腸埃希氏菌、A-D菌也能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集反應。志賀氏菌屬又分A、B、C、D四個群抗原，因此志賀氏菌屬的血清學反應復雜，又有一定的不確定性，可對志賀氏菌血清學鑒定優化如下∶分別選用1.5%瓊脂培養物和100℃煮沸20 min濃菌液作玻片凝集試驗，同時用生理鹽水作對照自凝試驗，若均不凝，則可直接判斷為陰性。若凝聚，則可按B、D、A、C群的順序進行群多價血清凝集試驗，陽性菌株至少與其中一群多價血清發生凝集。

4 小結

綜上所述，選用志賀氏菌增菌液在37℃厭氧條件下培養6 h增菌，再用XLD、EMB培養基等分離培養，以B、D、A、C群的順序進行群多價血清凝集試驗，最后結合全自動微生物鑒定，能顯著提高飼料中志賀氏菌檢測方法的準確性，有效減少雜菌干擾，降低漏檢率。

（參考文獻若干篇，刊略，需者可函索）