傣家酸魚中乳酸菌的分離鑒定及乳酸發酵的初步研究*

張振宇，李忠孝，袁明龍，袁明偉，陳海云，杜剛

(云南民族大學云南省生物高分子功能材料工程技術研究中心，云南昆明，650500)

乳酸是世界上公認的三大有機酸之一，是重要的生物化工產品，在醫藥、食品等工業有廣泛的應用［1］。目前工業上生產乳酸的方法主要有化學法、酶法和生物發酵法。生物發酵法生產乳酸因具有產品的光學純度高，原料來源廣泛，生產成本低廉和產品的生物相容性好等特點，成為國內外生產L-乳酸的重要方法。

隨著世界聚乳酸產業的興起，乳酸發酵日益受到人們的重視，乳酸生產菌種的選育技術更是受到普遍關注，已有諸多成功的實例表明菌種水平的提高是降低乳酸生產成本的關鍵措施之一。目前發酵法生產L-乳酸常用的微生物可分為兩類:一類為乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，另一類為根霉菌屬(Rhizopus sp.)。國外主要以淀粉、葡萄糖等糖類或牛乳為原料，以德氏乳桿菌、干酪乳桿菌或保加利亞乳桿菌為主進行L-乳酸的發酵生產;國內主要以淀粉為原料，以米根霉進行L-乳酸發酵生產的研究［2-4］。

已有從腌漬魚、肉制品中分離選育乳酸菌種用于食品加工的報道［9-11］，但直接用于乳酸發酵的則比較少見。本文從德宏傣家酸魚中分離乳酸菌，以期獲得用于乳酸發酵的優良菌種，為乳酸發酵生產提供新的微生物菌株資源。

1 材料與方法

1.1 酸魚樣品

樣品采自云南省德宏傣族景頗族自治州3個地區3戶采用傳統工藝手工制作酸魚的農家。

1.2 培養基

MRS培養基:葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，吐溫 -80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，CH3COONa 1 g，MnSO40.25 g，MgSO40.58 g，KH2PO42 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

產酸菌株篩選培養基［11］:葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，CH3COONa 1 g，檸檬酸三胺2 g，吐溫 -80 1 mL，K2HPO42 g，KH2PO42 g，MgSO40.2 g，FeSO40.01 g，MnSO40.25 g，NaCl 0.01 g，瓊脂16 g，CaCO316 g，溴甲酚紫 0.4 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。

乳酸發酵培養基:葡萄糖100 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，吐溫 -80 1 mL，檸檬酸三胺 2 g，CH3COONa 1 g，K2HPO42 g，KH2PO42 g，MgSO40.2 g，FeSO40.01 g，MnSO40.25 g，NaCl 0.01 g，CaCO360 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。

明膠液化培養基［7］:MRS培養基分裝為每支5 mL，每支加0.6 g明膠。

產 H2S 培養基［7］:蛋白胨 10 g，牛肉膏 5 g，葡萄糖 2 g，半胱氨酸 0.5 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.3。

1.3 實驗儀器與設備

ScoutⅡ型電子天平，奧豪斯國際貿易上海有限公司;LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;SW-CJ-ZFD型無菌操作臺，蘇凈集團安泰公司;快速混勻器，常州國華電器有限公司;奧立龍-868型離子酸度計，上海斯坦福生物科技發展有限公司;101A型電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司;HP-900型隔水式恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司;ZHWY-2102型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;雙目顯微鏡，上海華巖儀器設備有限公司;Nikon ECLIPSE E200顯微鏡，北京冠普佳科技有限公司;海爾 BCD-218A/D型冰箱，青島海爾股份有限公司;UNICO 7200型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜，安捷倫科技有限公司;TGL-15B高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;5331型PCR儀，德國Eppendorf股份公司;Tanon 2500型凝膠成像系統，上海天能科技有限公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1 產酸菌株的分離純化

在無菌條件下，稱取酸魚樣品1 g加入99 mL無菌生理鹽水中，勻漿后作梯度稀釋。分別吸取不同梯度稀釋液各200 μL涂布于改良MRS培養基上，每個稀釋度做3個平行，在32℃下培養48～72 h。隨機挑取菌落，進行反復劃線分離純化，挑取單菌落接種于產酸菌株篩選平板中央，用封口膜包裹平板，于32℃恒溫箱中培養，篩選出產生黃色透明水解圈的菌株。觀察菌株的菌落形態特征及顯微形態特征。

1.4.2 產酸菌株的生理生化特征

通過明膠液化試驗、產H2S試驗、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發酵產氣、七葉苷水解、淀粉水解等生理生化試驗實驗對菌株進行初步的鑒定［7］。

1.4.3 16S rDNA的PCR擴增及測序

菌株用 MRS斜面轉接3次后，接種于30 mL MRS培養基，32℃培養 24 h，取 5 mL培養物于12 000 r/min離心10 min收集菌體，液氮凍融-CTAB法提取基因組 DNA。采用通用引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1495r:5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以基因組DNA為模板進行16S rDNA的PCR擴增。PCR反應體系如下:Taq MIX 12 μL，引物各 1 μL，模板 2 μL，加無酶水補足20 μL。程序如下:95℃預熱5 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，經30個循環后72℃末端延伸10 min，4℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后外送測序，序列用 NCBI的 Blast在GenBank基因庫中進行同源性比對，用MEGA軟件進行系統發育分析。

1.4.4 發酵分析

1.4.4.1 生長曲線與產酸能力試驗

將分離得到的乳酸菌以相同的接種量接種于MRS培養基，32℃，120 r/min條件下培養，每隔2 h取樣測定OD580nm值及pH值，繪制成生長曲線和pH曲線。

1.4.4.2 乳酸的定性分析

采用TLC法對發酵液(發酵培養基中不添加CaCO3)進行分析，展開劑為甲醇∶氯仿(1∶2，v/v)，上行法一次展開，展層后用0.2%溴甲酚綠∶0.05%甲基紅∶0.5 mol/L NaOH(1∶1∶0.15，v/v)溶液噴霧顯色，藍紫色背景下呈現橙黃色斑點，根據發酵液呈現斑點的Rf值與乳酸標準品比較，從而對乳酸進行定性［8］;同時用HPLC法對發酵液進行檢測，根據標準品保留時間定性。色譜條件如下:色譜柱:Agilent E-clipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm ×150 mm;流動相，水∶甲醇(95∶5，v/v，甲酸調 pH 為 3);流速，1 mL/min;柱溫，室溫;進樣量，5 μL;檢測波長，210 nm。

1.4.4.3 乳酸的定量分析

菌株用MRS培養基做種子后按5%接種量分別接至乳酸發酵培養基，用250 mL錐形瓶裝液100 mL進行發酵;35℃，140 r/min振蕩培養72 h后取樣，用EDTA絡合滴定法［8］對發酵液中乳酸鈣進行定量，再按照公式進行乳酸折算。

式中，c為物質的量濃度;M乳酸表示乳酸的摩爾質量，取90.08 g/mol;M乳酸鈣表示乳酸鈣的摩爾質量，取308.3 g/mol。

2 結果與分析

2.1 產酸菌株的分離純化

3份酸魚樣品經MRS平板分離純化得到10株純化菌株。在產酸菌株篩選平板上，菌株sy1、sy3、sy4在平板中央產生明顯的變色溶鈣圈(如圖1所示)，表明3株菌為產酸菌株。形態學觀察發現，sy1為鏈狀長桿菌、較細長;sy3、sy4均為短桿菌、較小;以上3株菌均為革蘭氏陽性菌;結果見表1。對菌株sy1、sy3、sy4進行了部分生理生化實驗，初步判斷3株菌均為乳酸菌，結果見表2。

圖1 初篩平板Fig.1 Results of preliminary screening

表1 菌株形態學觀察Table 1 Results of the morphological identification

表2 菌株的生理生化特征Table 2 Results of physiological and biochemical identification

2.2 16S rDNA序列分析

3株菌16S rDNA PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示，顯示在1 500bp左右均有條帶，說明各菌株目標片段均被成功擴增，將PCR原液外送測序。測序結果用Blast在GenBank基因庫中進行同源性比對，從列出結果中挑選同源性最高且對比菌株為該種模式株的作為鑒定結果，3株乳酸菌16S rDNA序列同源性比對結果見表3。

圖2 16S rDNA PCR產物檢測Fig.2 Results of 16s rDNA PCR product detection

提取相似度在98%以上的相關模式株的序列，利用MEGA5.2軟件將測得序列與GenBank中的登錄菌株16S rDNA序列進行分析，以鄰域連接法構建系統發育樹，獲得菌株sy1、sy3、sy4的分類地位及系統發育地位。由表3和圖3可知，菌株sy1、sy3、sy4與登錄菌株Lactobacillus plantarum KLDS 1.0728同源性均達到99%，并與其聚在一起，所以將3株菌均鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)。菌株提交Gen-Bank，獲得登錄號，其中菌株sy1登錄號為KJ801850，菌株 sy3登錄號為 KM023152，菌株 sy4登錄號為KJ801851。

表3 分離乳酸菌16S rDNA序列鑒定結果Table 3 The identification result of LAB based on 16S rDNA sequencing

2.3 發酵分析

從圖4的生長曲線可看出，菌株sy3生長適應期較短，接種4～12 h為對數增長期，12 h后進入穩定生長期，其最終菌體量是最大的;菌株sy1生長適應期較長，前10 h為適應期，10～18 h為對數增長期，20 h后進入穩定生長期;菌株sy4整個生長曲線較平緩，6～14 h為對數增長期，14 h后進入穩定生長期。從圖5的pH變化情況來看，菌株sy3產酸最快，接種后前8 h急劇產酸，8 h后pH下降趨于平緩;菌株sy1前10 h產酸緩慢，12～18 h產酸迅速，18 h后趨于平緩;菌株sy4整個pH變化曲線最為平緩?？煽闯?，圖4和圖5的變化趨勢相符，反映出3株菌生長情況和產酸量之間具有正相關性，產酸量隨菌株生長情況一致呈現出慢-快-慢的趨勢。

圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of three lactic acid bacteria strains

圖4 乳酸菌生長曲線Fig.4 Growth curves of three lactic acid bacteria strains

圖5 乳酸發酵pH曲線Fig.5 pH curves of three lactic acid bacteria strains

2.3.2 發酵產物分析

采用TLC法對發酵液進行分析，菌株sy1、sy3、sy4發酵液經點樣、展層、顯色，顯示藍紫色背景下，各樣品在乳酸標準品Rf值處均有清晰可見的黃色斑點;同時 HPLC法分析顯示各發酵液在保留時間2.15 min附近均有峰出現，這與相同色譜條件下乳酸標準品保留時間2.148 min相符，如圖6和圖7所示。以上2種色譜分析方法結果一致，從而對發酵產物進行定性。

圖6 HPLC檢測乳酸標準品Fig.6 HPLC detection of standard lactic acid

圖7 HPLC檢測發酵液中乳酸Fig.7 HPLC detection of lactic acid in fermentation broth

搖瓶發酵72 h，經EDTA定鈣法測定，sy1發酵液中乳酸鈣質量濃度為113.34 g/L，sy3發酵液中乳酸鈣質量濃度為130.13 g/L，sy4發酵液中乳酸鈣質量濃度為118.09 g/L。經折算，菌株sy1乳酸產量為66 g/L，菌株sy3乳酸產量為76 g/L，菌株sy4乳酸產量為69 g/L。以上結果同圖5中菌株的pH變化情況一致。

3 結論

本文從傣家傳統酸魚制品中分離篩選出sy1、sy3、sy4 3株乳酸菌，經伯杰氏細菌鑒定手冊有關菌種的鑒定方法結合16S rDNA序列分析，3株菌均鑒定為植物乳桿菌，從鑒定結果初步推斷植物乳桿菌是傣家酸魚發酵的優勢乳酸菌群。

乳酸發酵結果表明，3株菌在24 h培養周期內即能迅速產生乳酸，能在pH低于3.5以下生長。在初始糖濃度為100 g/L的搖瓶發酵中，經72 h發酵，檢測到菌株 sy1、sy3、sy4 乳酸產量分別為 66、76、69 g/L，糖酸轉化率較高，表明所分離菌株具有較好的乳酸發酵性能。雖然與現有生產菌株相比乳酸發酵效率略低，但可作為出發菌株做進一步的乳酸發酵研究，本實驗為乳酸生產提供了新的微生物菌株資源。

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