超聲協同CDA酶法制備龍蝦殼聚糖*

竇勇，胡佩紅

1(江蘇財經職業技術學院，江蘇淮安，223003)2(淮安正昌飼料有限公司，江蘇淮安，223005)

殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由甲殼素經脫乙?；?，化學名聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的堿性多糖，廣泛用于紡織、醫藥、造紙、化妝品、食品工業和生物技術等領域［1］。一般把N-脫乙酰度55%以上的甲殼素(能溶解于1%的乙酸或1%的HCl中)稱為殼聚糖，低于55%的仍稱為甲殼素;根據脫乙酰度不同，將殼聚糖分為高(85% ～95%)、中(70% ～85%)、低(55%～70%)脫乙酰度3類［2-3］。目前，國內外有關殼聚糖制備報道十分廣泛，其主要制備方法是傳統的高濃度強堿法，近年來不少研究學者采用微波法、超聲波法有機溶劑介質法等方法制備殼聚糖，但這些方法仍然離不開強堿的作用，其反應時間長，能耗高，產品性質不穩定，對環境造成污染極大［4-7］。

我國淡水資源十分豐富，是淡水小龍蝦養殖和加工大國，每年產生的淡水小龍蝦加工廢棄物數以噸計，既污染環境又浪費了資源。顯然，為充分利用蝦殼自然資源，減少環境污染，以淡水小龍蝦加工廢棄物為原料，開發高效、無污染的環境友好型的殼聚糖生產方法勢在必行。本研究旨在以淡水小龍蝦殼為原料，利用超聲波“空化作用”，改善甲殼素脫乙?；?Chitin Deacetylation，簡稱CDA)與甲殼素之間的相互作用，利用CDA酶的高效催化性和專一性，提高脫乙酰反應速度和脫乙酰度，通過響應面法優化制備工藝參數，建立環境友好型的酶法制備高脫乙酰度殼聚糖的最佳工藝，為環境友好型的酶法工業化生產殼聚糖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

淡水小龍蝦，購于淮安市城南農貿市場;Na2·EDTA、NaOH、雙氧水等試劑均購于國藥化學試劑有限公司，均為分析純;CDA粗酶液(采用1.3.3方法測定酶活力為195.34 U/mL，實驗室自制:從淮安市某淡水小龍蝦養殖基地淤泥中篩選出1株高產CDA酶霉菌，經鑒定為構巢曲霉菌，將該菌接種于液體發酵培養基，于30℃、150 r/min搖床培養96 h后，所得發酵液低溫離心后取上清液，即為CDA粗酶液)。

1.2 主要儀器

多功能超聲波清洗機(SCQ-1000C)，上海汗諾儀器有限公司;粉碎機(JYL-305)，山東九陽小家電有限公司;恒溫鼓風干燥箱(DHZG-9070A)，上海一恒科學儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HWS-28)，上海一恒科學儀器有限公司;數顯黏度計(NDJ-8S)，上海方瑞儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲協同CDA制備殼聚糖工藝

蝦殼樣品預處理→超聲輔助EDTA脫鈣脫蛋白→過濾→烘干→雙氧水脫色→水洗至中性→烘干→甲殼素→超聲協同CDA酶法脫乙?！^濾→水洗至中性→烘干→殼聚糖

1.3.2 脫乙酰度、黏度的測定和殼聚糖得率計算［6-7］

脫乙酰度(D.D.)測定參考文獻［6］方法進行，黏度測定參考文獻［7］方法進行。殼聚糖得率計算按公式(1)計算:

1.3.3 CDA酶活單位定義［8］

［8］，采用分光光度法測定酶活，以每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位(粗酶液酶活單位:U/mL)。

1.3.4 傳統堿法制備淡水小龍蝦殼聚糖

參考文獻［9］“一步法”殼聚糖制備方法，采用1.3.2、1.3.3方法測其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.5 超聲波法制備淡水小龍蝦殼聚糖［7］

稱取5 g左右自制甲殼素粉末，加入盛有80 mL 50%NaOH的燒杯中，并置于超聲波清洗機中，經超聲波(頻率40 kHz，功率400 W)預處理1 h后，在90℃下恒溫攪拌反應10 h，結束后冷卻至室溫，過濾，用水反復沖洗至中性，烘干即為殼聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法測定其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.6 超聲協同CDA酶法制備淡水小龍蝦殼聚糖［10-13］

將自制甲殼素粉碎過40目篩于燒杯中，按料液比1∶20加入蒸餾水，于100℃水浴中加熱預處理1 h后，置于超聲波清洗機中，在一定超聲功率下，經超聲波預處理60 min后，加入CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50℃下恒溫酶解一定時間，期間以0.1 mol/L NaOH調節pH 7.5，以使酶活性最高，酶反應結束后，以100℃水浴下連續滅活15 min終止酶反應，迅速冷卻至室溫，9 000 r/min離心10 min，蒸餾水反復洗滌至中性，沉淀物烘干，即得殼聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法測定其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.7 RSM 優化設計［11，14］

采用Design Expert 8.0.5軟件，根據Box-Behnken設計原理，以脫乙酰度Y為響應值，從預試驗結果中選取加酶量、酶解時間、超聲功率3個對D.D值影響較大因素設計試驗，以期獲得高D.D.的最佳條件，因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平編碼表Table 1 Box-Behnken design factors and levels code table

2 結果與分析

2.1 模型建立及其顯著性檢驗

RSM分析試驗設計與結果見表2，利用Design Expert 8.0.5軟件對表2數據進行回歸擬合，得到脫乙酰度(Y)對此3因素編碼值的二次多項回歸模型為:Y=-319.632+0.717 5X1-0.772 5X2-0.467 5X3+0.98X1X2-0.44X1X3-0.885X2X3-5.718X12-2.248X22-2.998X32。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

該模型方差分析與回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3，模型P＜0.000 1，差異極顯著;失擬項P=0.100 2＞0.05，差異不顯著，說明該模型對實際試驗擬合度好，試驗誤差小。方差分析結果顯示，決定系數R2=0.991 4校正系數，信噪比(Adeq Precision)=25.22遠大于4，表明模型預測值與實際值擬合良好，可信度均很高，能夠很好用于超聲協同CDA酶法制備殼聚糖的D.D.的分析和預測。表3數據可見，一次項中X1、X2偏回歸系數差異高度顯著，說明超聲功率、加酶量對本法制備的殼聚糖D.D.有高度顯著的影響，X3偏回歸系數差異顯著，說明酶解時間對殼聚糖D.D.影響顯著。交互項中除X1X2影響高度顯著，X2X3影響顯著，而X1X3交互作用不明顯，說明超聲功率和加酶量交互作用對D.D.影響最大，加酶量與酶解時間交互作用對D.D.影響顯著，而超聲功率與酶解時間交互作用對其影響很小。由F值可以看出，以上3因素對殼聚糖D.D.的影響順序為:加酶量＞超聲功率＞酶解時間。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 ANOVA results of regression equation

2.2 RSM分析

利用Design Expert 8.0.5軟件作響應曲面及等高曲線，考察所擬合的響應面形狀，分析超聲波功率、加酶量、酶解時間3因素之間交互作用對殼聚糖D.D.的影響，其響應曲面及等高曲線如圖1～圖3所示。

2.2.1 超聲波功率與加酶量交互關系

由圖1可以看出，當酶解時間一定時，隨著超聲功率的增大，D.D.先升高后降低，變化幅度很大，說明在一定范圍內提高超聲功率有利于甲殼素脫乙?；?，而超聲功率過大，可能造成空化氣泡在負相位受壓過大而直接破裂，減小甚至失去超聲“空化作用”［15］，從而不利于甲殼素的脫乙?；?。而加酶量對其影響較小，等高線呈橢圓形，說明超聲波功率與加酶量交互作用明顯。

圖1 超聲波功率與加酶量交互作用的響應面與等高曲線圖Fig.1 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzyme dosage

2.2.2 超聲波功率與酶解時間交互關系

從圖2可以看出，當加酶量一定時，隨著超過功率的增大，殼聚糖D.D.均呈現先上升后下降的趨勢，在適宜的超聲功率下，促進了甲殼素顆粒粉碎，增加其與CDA酶活性中心的結合幾率，充分發揮了酶的高效催化活性，D.D.達到最大值;而高功率超聲會產生瞬態空化作用，空化泡崩潰的瞬間，釋放出高溫高壓，導致大量自由基的形成，高能量的自由基可能直接攻擊CDA酶分子發生結構變化，使CDA活力下降，D.D.也隨之降低［16］;而當加酶量一定時，D.D.隨酶解時間的延長呈現平穩略有下降趨勢，原因可能是因酶解時間過長，產生大量的乙酸，降低了CDA酶的活性，從而影響了D.D.。此外，右側等高線呈近圓形，說明等高線呈橢圓形交互作用不明顯。

圖2 超聲波功率與酶解時間交互作用的響應面與等高曲線圖Fig.2 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzymolysis time

2.2.3 加酶量與酶解時間交互關系

圖3顯示，當超聲功率不變時，隨著酶解時間和加酶量的增加，響應面曲線變化幅度不明顯。說明，當超聲功率不適宜時，隨加酶量和酶解時間的變化，酶法脫乙?；Ч幻黠@。等高線呈橢圓形，說明等高線呈橢圓形交互作用明顯，當超聲功率適宜時，能充分發揮超聲與CDA酶的協同作用。

圖3 加酶量與酶解時間交互作用的響應面與等高曲線圖Fig.3 Response surface and high profile of the interaction between enzyme dosage and enzymolysis time

2.3 RSM優化結果與驗證試驗

根據回歸模型，通過Design Expert 8.0.5軟件分析得出，超聲協同CDA酶制備殼聚糖的最佳條件優化結果為:超聲功率475.91 W，加酶量9.45%，酶解時間3.5 h;預期的D.D.為90.98%。為了驗證Box-Behnken試驗設計的預測結果可靠性，根據響應面優化結果及預試驗的最佳條件，結合實際操作，采用超聲功率476 W、超聲處理時間60 min、加酶量9.45%、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，進行3組平行試驗制備殼聚糖，所得殼聚糖D.D.的平均值為91.09%，這與響應面預測評分90.98%十分接近，說明該模型預測結果與實際結果相符度、可信度高，具有實用價值。

2.4 超聲協同酶法與傳統堿法及單一超聲法制備殼聚糖效果比較

從表4可知，超聲協同CDA酶法制備的殼聚糖D.D.為91.09%，黏度為95 mPa·s，制備時間4.5 h，殼聚糖相對得率為85.87%，可見超聲協同酶法制備殼聚糖的D.D.、黏度、制備時間和相對得率等產品質量參數明顯比傳統熱堿法、單一超聲法效果好。制備時間來看，超聲協同酶法，利用了酶的高效催化活性和超聲波的“空化作用”大大降低了脫乙?；臅r間，提高了D.D.，酶法條件溫和也保證產品性質穩定，其D.D.和黏度明顯高于其他兩種方法，可見采用超聲協同酶法制備淡水小龍蝦殼高效、可行，制備時間短，產品具有高D.D.、高黏度的優點，制備過程中不需添加強酸、強堿，保護了環境，將成為未來殼聚糖工業化生產的方向。

3 結論

本研究在預實驗基礎上，通過響應面法優化了超聲協同酶法制備龍蝦殼聚糖工藝，得到其最佳制備條件為:超聲功率476 W、超聲處理時間60 min、加酶量9.45%、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，在此工藝條件下，殼聚糖的D.D.高達91.09%、黏度95 mPa·s，相對得率81.87%，總制備時間為4.5 h，產品為白色粉末。本研究采用自制CDA粗酶液，在酶的純化及酶學性質及其催化脫乙酰機理方面有待于進一步研究。龍蝦殼聚糖的超聲協同CDA酶制備法具有制備時間短、產品脫乙酰度高、相對得率高的優點，其最大優勢在于一改長期以來無法脫離強堿制備殼聚糖的現狀，甲殼素提取所使用的 EDTA回收率可達100%，整個制備過程沒有使用強酸、強堿等環境污染試劑，是一種環境友好型的制備方法，必將廣泛運用。

表4 不同方法制備殼聚糖效果比較Table 4 Comparison of preparing chitosan effect with different methods

參考文獻

［1］ Nidhi Pareek，Vivekanand V，Singh R P.Advances in Enzyme Biotechnology［M］.India:Springer，2013:125-136.

［2］ 李軍立，張波，馬力.殼聚糖的超聲波降解及最佳工藝研究［J］.西華大學學報(自然科學版)，2011，30(5):100-103.

［3］ 宋巍，陳元維，史國齊，等.不同脫乙酰度殼聚糖的制備及結構性能的研究［J］.功能材料，2007，38(10):1 705-1 708.

［4］ Assaa^d Sila，Najwa Mlaik，Nadhem Sayari Rafik Balt，et al.Chitin and chitosan extracted from shrimp waste using fish proteases aided process:Efficiency of chitosan in the treatment of unhairing effluents［J］.J Polym Environ，2014，22:78-87.

［5］ 朱利平，黃惠莉.真菌甲殼素脫乙酰酶(CDA)研究進展［J］.食品工業科技，2010，31(11):394-400.

［6］ 季錦林，湯立新，錢清華.間歇法提取蝦甲殼素和制備殼聚糖的工藝優化［J］.食品科技，2013，38(4):200-209.

［7］ 莫祺紅，盧潔，黃佩芳，等.超聲波預處理脫乙?；苽錃ぞ厶堑难芯浚跩］.食品科技，2009，34(8):200-209.

［8］ 萬芳芳.高產甲殼素脫乙酰酶菌株的篩選及發酵研究［D］.長沙:中南林業科技大學，2012.

［9］ 周安娜，張國棟，張文藝.“一步法”殼聚糖制備新工藝［J］.食品工業科技，2003，24(1):73-75.

［10］ Win N N，Stevens W F.Shrimp chitin as substrate for fungal chitin deacetylase［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57(3):334-341.

［11］ 劉振春，韓宇，孫慧娟，等.超聲波輔助酶法制備綠豆ACE抑制肽的工藝研究［J］.西北農林科技大學學報(自然科學版)，2014，42(8):1-8.

［12］ 許慶陵，曾慶祝.蝦殼甲殼素及殼聚糖提取工藝的研究［J］.中國食品添加劑，2013(6):104-109.

［13］ Márcia Barreto Cardoso，Roberta Signini，Sérgio Paulo Campana-Filho.On the sonication of chitin:effects on its structure and morphology and influence on its deacetylation［J］.Polymer Bulletin，2001，47(2):183-190.

［14］ 李俠，馬艷梅，孫慧娟，等.超聲波一雙酶法協同提取玉米須黃酮工藝的優化［J］.西北農林科技大學學報(自然科學版)，2014，42(4):416-419.

［15］ 徐力克，鄧慧萍，史俊.超聲波降解有機物機理及其應用研究［J］.環境科學與技術，2010，33(12):416-419.

［16］ 呂鵬，莊重，凌建亞，等.超聲對酶的影響［J］.生物技術通訊，2004，15(5):534-536.