豬骨免疫活性肽的分離純化

曾珍，李誠，付剛，楊勇，何利，陳姝娟

(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)

我國的豬骨資源豐富，但是對豬骨的深加工利用只有1%左右［1］。豬骨中含有豐富的蛋白質，從中獲得生物活性肽越來越受到研究者的關注。例如，有研究人員研究了具有降血脂作用的豬骨膠原肽［2］和提高機體抗氧化能力的豬骨肽［3］。然而利用豬骨制備免疫活性肽還未見報道。免疫調節活性肽在生物體內主要是通過抑制和刺激某些免疫反應來達到預防和控制疾病的目的［4］，如增強免疫細胞功能［5］、增強抗體合成和細胞因子的調節［6］。近年來的研究進一步挖掘出了免疫活性肽巨大的潛力，不少研究者將其運用到保健醫療領域。如有研究者分離出具有抗腫瘤功效的免疫活性肽［7］;某些免疫活性肽能夠刺激胰島素釋放，具有治療糖尿病的潛力［8］;某些具有免疫調節活性的肽同時還具有抗炎作用［9］;甚至有研究指出，免疫活性肽因其副作用小，可以成為抗生素的安全替代品［10］。免疫活性肽的來源也很廣泛，可從食物的蛋白質里制備出來，如羊胎盤［11］、玉米［12］、小球藻［13］、鱈魚［14］等等。

酶解液是一種混合液，不同分子質量的肽組分其生物活性也不同。超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一，采用超濾可以將不同分子質量的肽組分分離開來以獲得生物活性最高的肽段。凝膠層析和離子交換層析是被廣泛用于分離生物活性肽的2種分離純化技術，前者是按被分離物質分子質量的大小不同進行分離，而后者是利用多肽在同一pH值條件下所帶凈電荷的不同從而導致了多肽與離子交換樹脂的親和能力不同這一特點進行分離［15］。不少研究者采用凝膠層析及離子交換層析相結合的方式對多肽進行分離。如趙元暉等人采用先凝膠柱層析而后離子交換層析的方法對海地瓜水解產物進行分離純化，得到了一種新的強活性的ACE抑制肽［16］;劉小紅等人采用先離子交換層析而后凝膠層析的方法對豬骨降血壓肽進行分離純化［17］。

本文選擇豬骨Alcalase堿性蛋白酶酶解液作為潛在的免疫調節肽資源，運用超濾研究不同分子質量肽段的免疫活性，然后采用先凝膠過濾層析而后進行離子交換層析的方式進行分離，以探索出分離純化豬骨免疫活性肽的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬骨(豬后腿股骨頭)市售;昆明種小鼠5周齡，體重18 g，雌性，由四川農業大學獸醫院提供。

Alcalase堿性蛋白酶(11.5×104U/g)，丹麥NOVO公司;SP-Sephadex C-25，Pharmacia公司;Sephadex G-25，Pharmacia公司;其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

BR4i型多功能冷凍離心機，法國THERMO JOUAN公司;iMark酶聯免疫檢測儀，美國伯樂公司;311型CO2培養箱，美國Thermo Scientific公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司;PHS-3C酸度計，方舟科技公司;POWERDRY PL3000凍干機，Thermo;DYCZ-24D垂直式電泳儀，北京市六一儀表廠;超濾離心管(膜截留分子質量10 ku、5 ku、3 ku、2 ku)，Sartorius。

1.3 方法

1.3.1 分離純化豬骨免疫活性肽的工藝流程

制備酶解液→超濾→凝膠過濾層析→離子交換層析

1.3.2 分離純化豬骨免疫活性肽的操作要點

1.3.2.1 酶解液的制備

參照曾珍的方法［18］制備酶解液:將新鮮豬骨宰碎、蒸煮、干燥之后制成豬骨粉，采用Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨粉，酶解完成后離心過濾取上清液。

1.3.2.2 超濾

將豬骨酶解液通過10 ku的超濾離心管進行超濾離心，將分子質量低于10 ku的酶解液通過5 ku的超濾離心管進行超濾離心，接著將分子質量低于5 ku的酶解液用3 ku的超濾離心管進行超濾離心，然后將分子質量低于3 ku的酶解液用2 ku的超濾離心管進行超濾離心。經過一系列的超濾離心一共得到5個組分，分別為分子質量＞10 ku(記為組分1)、10 ku＞分子質量＞5 ku(記為組分2)、5 ku＞分子質量＞3 ku(記為組分3)、3 ku＞分子質量＞2 ku(記為組分4)、分子質量＜2 ku(記為組分5)，收集這5個組分進行冷凍干燥，將5個組分配成肽濃度為5 mg/mL的樣品，分別測定各樣品對小鼠脾淋巴細胞的增殖率，收集小鼠脾淋巴細胞增殖率最高的組分，備用。

1.3.2.3 凝膠過濾層析

sephadex G-25(細)層析柱(Ф1.6×60)，上樣量為2.5 mL，洗脫液為超純水，進樣流速和洗脫流速為1 mL/min，用自動部分收集器收集每管2 mL，用紫外檢測器測其在214 nm下的OD值，將分離開的組分配制成不同濃度測定其對小鼠脾淋巴細胞增殖率。

1.3.2.4 透析

在4℃的條件下，將樣品放入透析袋使用磁力攪拌器進行透析，每3h更換1次超純水，共更換4次。

1.3.2.5 離子交換層析

填料為 SP-sephadex C-25，上樣量為1 mg/mL，緩沖液為:pH=4.0、0.02 mol/L醋酸鈉緩沖液，0～1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，進樣流速和洗脫流速為1.0 mL/min，用自動部分收集器收集，每管2 mL，用紫外檢測器測其在214 nm下的OD值，將分離開的組分配制成不同濃度，測定其對小鼠脾淋巴細胞的增殖率。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 小鼠脾淋巴細胞增殖率檢測方法

(1)無菌小鼠脾淋巴細胞制備:小鼠禁食12 h，摘眼球放血后脫頸處死，浸泡在75%的乙醇中3～5 min，于超凈工作臺上無菌打開腹腔，取出小鼠脾臟置于含有無菌Hanks液的平皿中，去除外周結締組織，并用無菌Hanks液清洗脾臟，去除血液。用無菌注射器芯擠壓研磨，制成細胞懸液。用Hanks液洗3次，然后1 500 r/min離心8 min，棄去上清液。然后將細胞懸浮于2 mL的RPMI 1640完全培養液中。調整細胞濃度為 2.0 ×106個/mL［19-20］。

(2)MTT法測定脾淋巴細胞增殖。設實驗組和對照組。在96孔板中每孔加入已制備好的小鼠脾細胞懸液100 μL。對照組中加入RPMI 1640完全培養液 100 μL，實驗組加入 100 μL 酶解液，置于 37℃下5%CO2培養箱中培養68h，再加入 MTT 50 μL，4 h 培養結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。室溫下放置15 min后，用酶聯免疫檢測儀，以570 nm波長測定光密度值［21］。

1.3.3.2 肽濃度的測定

分光光度法(GB 5009.5-2010)。

2 結果與分析

2.1 豬骨蛋白酶解產物超濾的分離結果

超濾分離各組分對脾淋巴細胞的增殖率見表1。由表1可以看出，超濾以后的酶解液對小鼠脾淋巴細胞增殖作用大小為組分5＞組分4＞組分3＞組分2＞組分1。研究結果表明，組分5即分子質量低于2 ku的組分脾淋巴細胞增殖率最高，因此將組分5繼續進行分離純化。

表1 超濾組分的脾細胞增殖率Table 1 The proliferation rate on spleen cell of ultrafiltration components

2.2 sephadex G-25凝膠過濾結果

分子質量低于2 ku的組分經過凝膠層析分離結果如圖1所示，由圖1可以看出酶解液被分離成4個組分A1～A4。4個組分對脾淋巴細胞的增殖活性影響如圖2所示。由圖2可以看到，隨著分離組分作用劑量的增加，脾細胞增殖率顯著增加，且呈現一定的劑量關系，其中A2組分增殖活性最強，且劑量關系最明顯，當濃度在100 μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為109.83%。因此，將峰A2繼續分離。

圖1 酶解液的凝膠層析sephadex G-25洗脫曲線Fig.1 The gel filtration exchange chromatography of hydrolysates

圖2 凝膠柱層析洗脫組分的脾細胞增殖活性Fig.2 The proliferation rate on spleen cell of gel filtration chromatography components

2.3 SP-sephadex C-25離子交換結果

A2經SP-sephadex C-25離子交換層析柱分離結果如圖3所示。由圖3可以看到，A2被分離成9個組分B1～B9。9個組分對脾淋巴細胞的增殖活性影響如圖4所示。由圖4可以看到，不同濃度的分離組分對脾淋巴細胞均有一定的增殖能力，其中B4組分增殖活性最強，同時B4組分劑量關系最明顯，當濃度在100 μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為114.30%。

3 討論與結論

圖3 A2的離子交換層析SP-sephadex C-25洗脫曲線Fig.3 The ion exchange chromatography of A2

圖4 離子交換層析洗脫組分的脾細胞增殖活性Fig.4 The proliferation rate on spleen cell of A2 ion chromatography components

一般來說，分子質量越低的生物活性肽其生物學活性越強，這是因為短肽的分子質量越低，其肽段長度越短，空間結構越小，越容易進入機體脾淋巴細胞內部，從而實現一系列的生物學功能。He等人將油菜籽蛋白酶解物分離成了不同肽組分:＜1 ku、1～3 ku、3～5 ku、＞5 ku，通過研究不同組分的生物活性發現，＜3 ku的多肽比＞3 ku的多肽降低了表面的疏水力，從而表現出更高的氧自由基清除能力［22］。張宇昊等人對花生酶解液進行超濾，得到了＜1 ku、1～5 ku、＞5 ku的3種不同分子質量范圍的短肽，研究其ACE抑制活性發現，低于1 ku的花生短肽其ACE抑制活性最強，而＞5 ku的花生短肽其ACE抑制活性最差［23］。王炳祥等人研究了分子質量分別為10.139、8.166、7.447、6.761 ku 等4 種山羊胎盤肽的抗氧化活性，結果表明，分子質量為6.761 ku的小肽具有的抗氧化力最強［24］。本實驗中超濾得到的＞10 ku、5～10 ku、3～5 ku、2～3 ku和 ＜2 ku等5組豬骨肽，分子質量低于2 ku的小肽增殖活性最強，與上述研究人員的研究結果一致。目前越來越多的研究人員聯合使用凝膠過濾層析和離子交換層析對生物活性肽進行色譜分離。本研究中采用先凝膠過濾層析后離子交換層析的方式進行分離是考慮到Sephadex G-25具有脫鹽的作用，多肽先脫鹽再經SP-Sephadex C-25的分離，而SP-Sephadex C-25的母體Sephadex具有分子篩效應，使它在分離物質的同時，具有離子交換作用和分子篩效應，從而使分離效果得到了加強。許多研究者也是采用先凝膠過濾層析后離子交換層析的順序進行分離純化多肽。LIU等人采用凝膠過濾色譜、離子交換色譜來分離胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解水母蛋白中的ACE抑制肽［25］。趙元暉等人采用先Sephadex G-25凝膠柱層析而后SP-Sephadex C-25的方法對海地瓜水解產物進行分離純化，得到了一種新的強活性的ACE抑制肽［26］。張曉麗等人采用先Sephadex G-25凝膠柱層析而后SP-Sephadex C-25對土鱉蟲復合多肽進行分離純化，得到具有較強溶栓活性的多肽組分［27］。

豬骨免疫活性肽的分離純化方法為:首先對豬骨蛋白的酶解產物進行超濾分離，然后對分子質量低于2 ku的組分進行凝膠過濾層析分離，最后對凝膠層析分離后得到活性最高的組分進行離子交換層析分離。當最終分離得到的免疫活性肽的質量濃度在100μg/mL時，對小鼠脾細胞增殖率為114.30%。

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