玉米秸稈酶解液發酵產γ-聚谷氨酸*

李翠平，梁金鐘，趙紅宇

1(黑龍江省高等學校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱，150076)

2(黑龍江康普生物科技有限公司，黑龍江哈爾濱，150025)

γ-聚谷氨酸(γ-poly glutamic acid，γ-PGA)是一種微生物在胞內合成并分泌到胞外的水溶性可生物降解型多功能的生物高分子，為水溶性的酰胺化合物，可以通過芽孢桿菌的變種來生產，由 D-谷氨酸和L-谷氨酸單體以γ-羧基與α-氨基以酰胺鍵的形式縮合而成，分子質量一般在 105～ 106u［1-2］。γ-PGA 具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、黏結性、保濕性和可生物降解等獨特的理化和生物學特性［3］。在食品領域，可作為食品及飲料類的增稠劑，還可以改善飲料的味道;作穩定劑添加在冰淇淋中;紋理強化劑［4-5］;粘合劑;動物飼料的添加劑;抗凍劑或保護劑;減輕苦味劑;作為添加劑使用在淀粉食品(面包或面條)可避免老化、改善食品質地和保持食物的形狀。在保健方面，它有利于骨質疏松癥者對鈣的吸收［6，8］。γ-PGA 作為一種生態友好型的生物制品，愈來愈顯現出廣闊的研究價值和應用前景。

傳統枯草芽孢桿菌發酵生產γ-PGA主要采用蔗糖、葡萄糖和玉米糖化液等為碳源。以葡萄糖為碳源，發酵液中 γ-PGA 產量較高(約 19.0 g/L)［9-10］。以檸檬酸鈉和豆粕浸提液為碳源，γ-PGA的產量達到40.0 g/L。而以玉米糖化液為碳源的基礎，可高產γ-PGA，達68.4 g/L［11］。但利用玉米秸稈酶解液作為碳源進行微生物發酵生產γ-PGA的還未見報道。以可再生的、價格低廉的秸稈為原料，通過特定微生物發酵所得的產物具有極大的潛力，如2，3-丁二醇、燃料乙醇、糠醛和丁醇等［12］。我國年產秸稈7.4億 t［13］，其中玉米秸稈年產量高達 2億 t以上，但目前開發利用率仍很低［14］。而玉米秸稈一般不能直接被微生物發酵，所以在發酵前要將其轉化成可溶性糖。酶法水解玉米秸稈［15］條件溫和，副產物少，成本低廉，環境友好，被廣泛采納。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈，取自哈爾濱郊區;纖維素酶(Celluclast?1.5L，β-葡糖苷酶 Novozymes188)，購于諾維信公司;菌種，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis HCUL-B-115)，由哈爾濱商業大學發酵工程實驗室篩選、誘變、分離并保藏，中國科學院菌種保藏中心鑒定，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌種保藏號:CGMCCNo.2283。

1.2 儀器與設備

SBA-40D生物傳感分析儀(配有 β-D-葡萄糖檢測膜及L-谷氨酸檢測膜)，山東省科學院生物研究所;723可見分光光度計，上海精科有限公司;HNY恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器有限公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;SW-CJ-FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司;BS 224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;S-3400掃描電子顯微鏡，HITACHI公司;ES-2030型冷凍干燥，HITACHI公司;E-1010型離子濺射鍍膜儀，HITACHI公司。

1.3 培養基

斜面培養基:牛肉膏3.00 g/L、蛋白胨10.00 g/L、NaCl 5.00 g/L、瓊脂20.00 g/L，pH 7.2 ～7.4。

種子培養基:牛肉膏3.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、蛋白胨10.00 g/L、NaCl 5.00 g/L，pH 7.2 ～7.4。

發酵培養基:玉米秸稈酶解液、玉米糖化液，CaCl20.42 g/L、蛋白胨5.00 g/L、谷氨酸鈉60.00 g/L、NaCl 12.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.25 g/L、KH2PO44.00 g/L、MnSO40.08 g/L。

1.4 實驗方法

1.4.1 玉米秸稈的預處理

將玉米秸稈自然風干，切成2～5 cm的小段，然后利用粉碎機將玉米秸稈小段粉碎成40目左右的粉末，備用。

蒸煮預處理:稱取15 g玉米秸稈粉末置于500 mL耐壓試劑瓶中，并以1 g秸稈粉末加入10 mL溶液的比例，向瓶中分別加入 1.0%H2SO4、10.0%NH3OH、水，混勻。將瓶口密封，置于高壓鍋內121℃，蒸煮 2 h。蒸煮完成后，高壓鍋溫度降至90℃，迅速降壓，取出后冷卻至室溫，用自來水沖洗處理至pH=6.5～7.0(約洗5～6次)，然后于 80℃烘干至恒重。

1.4.2 玉米糖化液的制備

取300 g市售玉米粉，加水1 000 mL，加入無水CaCl2(添加量為100 mg/kg)煮沸，調節pH至6.7～7.0，再加入 α-耐高溫淀粉酶(添加量為 10 U/g原料)，迅速降溫至 80～85℃，保溫 15～20 min，繼續降溫至58～60℃，調節pH 4.5，加糖化酶(添加量為120 U/g原料)，60℃保溫 4 h后，再加熱煮沸 10 min，過濾除渣，測定糖化液糖度為17%，生物傳感儀測得葡萄糖含量為190 g/L。低溫保存備用。

1.4.3 玉米秸稈酶解

取適量經過預處理的玉米秸稈置于250 mL三角瓶中，加入纖維素酶和β-葡糖苷酶，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8，0.05 mol/L)調節固液比。放置在恒溫培養箱(50℃)中酶解，酶解結束后迅速滅酶(沸水浴10 min)，于4 000 r/min下離心10 min，上清液即為纖維素酶水解液，將酶解液適當稀釋，測定其中糖的含量。

1.4.4 培養方法

將斜面上的菌種轉接到種子培養基中，37℃，150 r/min搖床培養18 h，將活化后的種子培養液按2%的接種量接種至發酵培養基中，37℃，150 r/min搖床培養72 h。

1.4.5 γ-PGA的測定

發酵液在6 000 r/min的轉速下離心15 min。取上清液10 mL，加入25 mL的無水乙醇，劇烈搖晃得到團狀凝聚物，將其轉入恒重的稱量瓶中，置于電熱恒溫鼓風干燥箱中100℃下烘至恒重，得到塊狀樣品，并稱重。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖含量測定

待測酶解液稀釋100倍后用SBA-40D生物傳感分析儀測定葡萄糖含量(g/L)。

1.5.2 還原糖含量測定

用 3，5-二硝基水楊酸法(DNS 法)［16］測定。

用間苯三酚-冰醋酸法測定［17］。

1.5.4 電鏡掃描分析

分別將處理前后的秸稈以及酶解后的秸稈進行烘干、粉碎，用掃描電鏡進行分析(掃描電壓為 5 kV，放大1 000倍)，觀察玉米秸稈內部纖維素束的微觀結構變化。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈處理前后電鏡掃描分析

不同條件預處理的玉米秸稈電子掃描電鏡圖像見圖1-a。粉碎與未粉碎的玉米秸稈結構差別明顯，未粉碎的玉米秸稈呈纖維素狀，表面光滑，細胞排列整齊，結構完整。細胞壁(其主要成分為纖維素)包裹著細胞內容物，纖維素結構之間連接緊密，其致密的表面結構是阻礙纖維素酶作用于纖維素，進而阻礙水解的主要原因。而粉碎后的秸稈呈現出明顯的斷層，纖維組織被破壞;由圖1-b、c、d可見，不同預處理條件的玉米秸稈其復雜的纖維素結構均發生了變化。原有的纖維平行排列結構被破壞，細胞壁撕裂變為絮狀纖維，細胞間距拉大，輪廓模糊，細胞內容物游離出來。雖然呈束狀結構，但是結構表面有許多不規則的溝壑和坑洞，整個束狀結構變得松散，不完整，這些結構變化增加了纖維素酶與纖維素的接觸面積，有利于酶解反應的進行;由圖左右兩圖對比可見:秸稈預處理后束狀結構表面都有許多的孔洞，但是整體束狀結構仍然很完整，沒有較大的破壞，這說明纖維結構破壞不充分，而經酶解處理后的玉米秸稈，秸稈表面出現許多大的坑洞，變得十分疏松，幾乎看不到原來的束狀結構，這是因為經過酶解處理后玉米秸稈復雜致密的結構被破壞，內部變得疏松多孔，很明顯酶解的都較充分。

圖1 不同處理條件下秸稈電子掃描電鏡圖像Fig.1 Electron microscope images of corn straw under different treatment conditions

水、酸、堿3種預處理方法對比，酸堿預處理明顯提高了酶對玉米秸稈的接觸面積，使得酶解反應進行的很充分，秸稈束狀結構大部分被破壞，說明經過預處理的玉米秸稈更適于能源的生物轉化。

2.2 玉米秸稈酶解單因素實驗

2.2.1 酶用量對糖濃度的影響

玉米秸稈在 pH 5.0、反應時間 72 h、溫度為50 ℃、底物比例為 1∶15、酶用量分別為 20、25、30、35、40 FPIU/g條件下酶解，然后離心，稀釋酶解液，測定出糖濃度。結果見圖2。

四十多歲，就疾病纏身，這種遭遇，大抵是悲催的。以至于我長時間處在一種憂慮與焦躁的狀態當中。戒酒是必須的。有幾次，在瀘州和畢節，都是產好酒的地方，卻不敢再喝一口。因此，我特別懷念自己還可以喝酒時候的某種癲狂狀態。其實，酒解決和帶入的是人生的混沌境界，這種混沌是激越和亢奮的，也是歡樂與豐富的，就像去掉了肉身，進入到了純粹的靈魂仙境一般。

圖2 酶加入量對還原糖濃度的影響Fig.2 Effect of the amount of enzyme on reducing sugar yield

由圖2可以看出，當酶加入量為30 FPIU/g時，玉米秸稈酶解后含糖量最高;當酶加入量低于30 FPIU/g時，隨著酶加入量的不斷升高，還原糖含量隨之升高;當高于30 FPIU/g時，隨著酶加入量的升高，還原糖含量呈現下降趨勢。這說明，酶與底物配比最佳量，在最適反應底物量時，酶活力最大，還原糖含量達到最高。

2.2.2 底物比例對糖濃度的影響

玉米秸稈在 pH 5.0、反應時間 72 h、溫度為50℃、酶用量分別為25 FPIU/g、底物比例分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 條件下進行酶解反應，然后進行離心，稀釋酶解液，測定出糖濃度。結果見圖3。

圖3 底物比例對還原糖濃度的影響Fig.3 Effect of the substrate concentration on reducing sugar yield

從圖3可以看出，當底物比例為1∶15時，還原糖含量較高，隨著底物比例的增加，還原糖含量也增加，這是由于在酶用量一定的情況下，與底物接觸的越充分，酶解越徹底，從而使更多的糖能夠釋放出來。底物比例對酶解反應非常重要，如果加緩沖液較少，酶則不能夠充分與底物接觸，從而降低酶解液含糖量;若加酶量太多，則增加了生產成本，綜合考慮，底物比例選擇1∶15。

2.2.3 酶解時間對糖濃度的影響

玉米秸稈在溫度50℃、酶用量25 FPIU/g、酶解pH 5.0、反應時間 60、72、84、96、108 h 的條件下酶解，然后離心，得到酶解液，結果見圖4。

圖4 酶解時間對還原糖濃度的影響Fig.4 Effect of the time on reducing sugar yield

從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，玉米秸稈酶解液中還原糖含量升高。在最初的酶解階段，還原糖含量提高得較為明顯，隨后作用效果就減弱，酶解時間是使纖維素降解的關鍵，適合的時間應該根據還原糖含量來確定。酶解時間長有利于糖量升高，但酶解時間超過84 h后出糖量增加緩慢，從工作效率、設備利用以及能耗等經濟角度來衡量，最適的酶解時間為84 h。

2.3 玉米秸稈酶解正交試驗結果

玉米秸稈經不同的預處理方法處理后進行酶解，酸、堿、水預處理，相對堿效果要好。以氨處理原料進行酶解條件優化，選擇酶濃度(A)、底物比例(B)、酶解時間(C)3個因素，每個因素3個水平，采用L9(34)進行正交試驗，以還原糖含量為評價指標，對玉米秸稈酶解條件進行優化。確定正交試驗的因素和水平見表1-表3。

表1 玉米秸稈酶解糖化正交試驗的因素水平表Table 1 Maize straw enzyme saccharification factors and levels for orthogonal array design

表2 10.0%NH3OH處理原料正交試驗設計及結果Table 2 10.0%NH3OH treatment orthogonal array design and results

表3 10.0%NH3OH處理原料正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

表2表明，影響10.0%NH3OH預處理玉米秸稈酶解的各因素主次順序為A＞B＞C;表3表明，A因素(即酶量)對玉米秸稈酶解有顯著影響(P＜0.05)，而B、C因素影響較小(P＞0.05)，因此優選出最佳工藝條件為A3B1C2，即加酶量為35 FPIU/g，底物比為1∶15，酶解時間為84 h。與水，1.0%H2SO4預處理方法相比，酶解液含糖量提高較大，可以作為發酵γ-PGA原料處理的最優處理方法，氨還可以通過回收循環利用，整個過程能耗較低，是一種較有發展前途和應用前景的預處理技術。

2.4 預處理與未處理原料對酶解效果的影響

玉米秸稈處理前和處理后的酶解效果差別較大，見圖5。酸氨處理打破了玉米秸稈3種組分的致密結構，解除了木質素對半纖維素和纖維素的包裹，盡可能地降低了纖維素的結晶度［18，20］，增加了微生物與酶的可及性，提高利用率。蒸汽爆破法與酸堿連用，在高壓狀態下，保持一定時間內蒸發掉纖維細胞內的水分，使半纖維素水解，然后瞬間釋壓，使物料爆破。稀酸處理則可以有效溶解木質素和半纖維素，同時破壞纖維素的結晶結構，使原料疏松。氨處理可以脫除原料中大部分木質素，條件溫和，而且可以除去纖維素原料中對發酵不利的乙?；?，但是會損失半纖維素。

圖5 玉米秸稈酶解隨底物比例還原糖產量變化Fig 5 Maize straw enzyme reducing reducing sugar yield changes over substrate ratio

由圖5可知，經過酸處理的玉米秸稈還原糖產量為33.99 g/L，經氨處理的為68.78 g/L，而未經處理的為9.26 g/L。處理后比處理前的還原糖含量有明顯的提高。

2.5 不同預處理方法所得玉米秸稈酶解液對γ-PGA的影響

以玉米秸稈酶解液為碳源，調節pH為5左右，接種量2%，于37℃發酵。原料預處理方式有4種，分別為水預處理、1.0%H2SO4、10.0%NH3OH預處理、未經預處理。發酵效果以γ-PGA含量、殘糖量、殘谷氨酸量為指標，結果如圖6所示。

圖6 玉米秸稈酶解液發酵產γ-PGAFig.6 Maize straw enzymolysis liquid fermentation to produce γ-PGA

未經預處理的原料直接酶解，其酶解液(還原糖量為23.60 g/L)發酵效果不好，提取物未成團，呈絮狀物，發黏，黏壁，產物顏色較深。而經過預處理的酶解液(還原糖量分別為28.78 g/L、34.63 g/L、67.5 g/L)發酵效果較好，提取物均成團。3種原料(水處理原料、10.0%NH3OH處理原料、1.0%H2SO4處理原料)單獨對比，10.0%NH3OH處理原料酶解液發酵效果最好，γ-PGA產量為41.00 g/L。

2.6 玉米糖化液與玉米秸稈酶解液混合發酵

2.6.1 混合發酵對γ-PGA的影響

玉米糖化液以10%、20%、30%、40%、50%比例與10.0%NH3OH處理原料玉米秸稈酶解液混合發酵產γ-PGA。玉米秸稈酶解液經過濃縮，脫色處理配制發酵培養基?；旌习l酵培養基起始還原糖含量為70.08 g/L。發酵后以殘糖量、γ-PGA含量為指標分析了對發酵效果的影響(圖7)。

圖7 玉米糖化液與玉米秸稈酶解液混合發酵γ-PGAFig.7 Corn saccharification liquid mixed with corn straw enzymolysis liquid fermentation γ-PGA

結果表明，枯草芽胞桿菌利用混合培養基發酵效果較好，產量較高。在玉米糖化液比例為30%時，發酵效果最好，γ-PGA產量為 80.00 g/L，殘糖量為21.00 g/L。隨著玉米糖化液含量的增加，γ-PGA的產量不是直線上升，反而有所下降。玉米秸稈酶解液與玉米糖化液混合比例為30%作為枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的最優碳源?；旌习l酵γ-PGA產量為80.00 g/L，而單獨以玉米秸稈酶解液發酵γ-PGA產量最高為41.00 g/L，相比，混合發酵產γ-PGA產量提高了95.12%。為合成γ-PGA提供了適宜的糖量，既保證了γ-PGA合成所需的糖量又不會因糖量過高而抑制γ-PGA的合成。

2.6.2 混合發酵產γ-PGA前后葡萄糖、還原糖、木糖含量的變化

一般來說，碳源對于枯草芽孢桿菌合成γ-PGA的產量有很大的影響，是細胞生長最重要的能量和營養來源。本研究采用的玉米秸稈酶解液與玉米糖化液混合作為培養基中的碳源，其中除了葡萄糖，還有木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、乙酸及少量糠醛等物質，優于其他單一的碳源，因為它除了含有菌種生長所必需的碳源外還有其他微量元素和生長因子，從而有利于菌種生長或對聚谷氨酸合成酶的活性有所提高，以葡萄糖、木糖、還原糖為指標衡量發酵前后對糖的利用情況(見圖8)。其中葡萄糖含量22.00 g/L、還原糖含量66.46 g/L、木糖含量9.10 g/L。

圖8 發酵前后葡萄糖、木糖、還原糖含量變化Fig.8 Glucose，xylose，reducing sugar content changes before and after fermentation

由圖8可見，通過對發酵前后糖含量的分析，糖量的變化都較為明顯，葡萄糖利用率可達到100%，還原糖利用率為68.58%，木糖利用率為53.84%?？梢源_定部分木糖被利用，實現了戊糖與己糖同時被微生物利用。木糖一般不能為微生物發酵所利用，只能被部分細菌利用，多存在于廢棄物中。以價廉易得的木質玉米秸稈纖維為原料來生產γ-PGA，其中主要的糖都可以被充分利用，可以大大的拓展了其生產原料的來源，還明顯增加其利用的經濟效益和社會效益。

4 結論

玉米秸稈預處理可改變木質素微結構及超分子結構，使纖維素結晶區破壞，提高反應靈活性，降低酶量，得到含糖量較高的酶解液。實驗結果表明，玉米秸稈的最佳預處理條件為10.0%NH3OH汽爆處理，固液比1∶10，121℃ 高壓水解2 h。NH3OH處理優點較多，NH3OH易揮發，可以進行回收，對環境不易造成污染還可以節省生產成本。酶解最佳條件為當pH為5，酶用量為35 FPIU/g，底物比例為1∶15，時間96 h。通過比較分析玉米秸稈酶解液單獨發酵和與玉米糖化液混合發酵對產γ-PGA的影響，結果表明，混合發酵優于玉米酶解液單獨發酵，確定了最佳比例為3∶7時，發酵效果最好，γ-PGA 產量可達80.00 g/L，與玉米秸稈酶解液單獨發酵相比，混合發酵產γ-PGA產量提高了95.12%。葡萄糖利用率100%，還原糖利用率68.58%，木糖利用率53.84%。

［1］ 劉曉鷗，李睿穎，徐勇虎，等.聚谷氨酸的生物合成及應用前景［J］.食品工程，2009，9(1):24～27.

［2］ 董健，呂穎，方麗等.γ-聚谷氨酸的發酵制備及快速鑒定分析方法研究［J］.中國釀造，2012，5(31):140-150

［3］ Shih IL，Van YT.The production of poly(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various applications［J］.Bioresour Techno，2001，79:207-225

［4］ 施慶珊.γ-聚谷氨酸的微生物合成與應用［J］.精細與專用化學品，2004，12(11):20 ～23.

［5］ 鞠蕾，馬霞，張佳.γ-聚谷氨酸的發酵及保水性能［J］.中國釀造，2011(7):57-61

［6］ 楊樹峰，樓鵬，李振海，等.據谷氨酸發酵液菌體去除工藝研究［J］.食品與發酵科技，2013，49(1):13-16.

［7］ 梁金豐，徐虹，姚俊，等.γ-聚谷氨酸提取的發酵液預處理及分離純化工藝［J］.食品與發酵工業，2009，35(3):6-11.

［8］ 任尚美，馬霞，王海波，等.γ-聚谷氨酸的發酵條件及其初步表征分析［J］.中國釀造，2008(19):45～46.

［9］ 賀楊揚，梁智群.γ-聚谷氨酸發酵液預處理及提取純化工藝［D］.南寧:廣西大學，2013.

［10］ 王浩，劉建軍.γ-聚谷氨酸高產菌株的選育［D］.青島:山東輕工業學院，2012.

［11］ 梁金鐘，王風青.微生物發酵法合成高分子聚合物 γ-PGA的研究［J］.北京工商大學學報(自然科學版)，2011，29(1):1 671-1 513.

［12］ 謝光輝，王曉玉，任蘭天.中國作物秸稈資源評估研究現狀［J］.生物工程學報，2010，26(7):855-863

［13］ 張美云，張 云，徐永建，等.秸稈高值化利用技術的發展現狀與趨勢［J］.中國造紙，2010，29(11):73-76.

［14］ Mizsey P，Racz L.Cleaner production alternatives:biomass utilization options［J］.Journal of Cleaner Production，2010，18(7):767-770.

［15］ 張霞，李紅偉，馬曉建.汽爆玉米秸稈懸浮液及酶解液的流變特性［J］.可再生能源，2013，10(1):3-6.

［16］ 倫曉中，寇巍，趙勇，等.膨化預處理玉米秸稈的還原糖酶解工藝［J］.環境工程學報，2013，7(1):317-322.

［17］ 王君福，吳丁丁，劉倩倩，等.間苯三酚法測定玉米芯水解液中木糖含量［J］.安徽農業科學，2011，39(22):13 542-13 544.

［18］ 劉澤君，張金祿.圓紅冬孢酵母發酵玉米秸稈水解液產油脂的研究［J］.中國油脂，2013，52(2):1 003-7 969.

［19］ 武崇輝，寇巍.酸堿處理純化玉米秸稈纖維素及還原糖酶解實驗研究［J］.中國生物工程雜志，2013，33(11):86-91.

［20］ 田亞紅，常麗新.玉米秸稈、玉米芯發酵生產乙醇的研究［J］.食品研究與開發，2014，35(3):1 005-6 521.