混合菌固態發酵豆粕制備大豆活性肽*

李慧娟，孫云鵬，丁鵬程，2，丁瑞，吳光坤，李泉

1(山東科技大學化學與環境工程學院，山東青島，266590)2(山東大學生命科學學院，山東濟南，250100)

豆粕是大豆榨油后的副產物，其蛋白質含量高達40%～50%，是目前畜牧養殖業中常用的飼料。但因豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、大豆抗原蛋白(致敏因子)等多種抗營養因子，對動物的生長發育和健康造成不良影響［1］。通過蛋白酶的作用可減弱食物蛋白的抗原影響，水解產生的小肽不僅具有抗氧化和抑制血管緊張素轉化酶活性，產生的游離氨基酸還可改善產物的風味［2-4］。在工業生產中常用酶法和發酵法處理豆粕，使其大分子蛋白降解成小分子肽(大豆肽)，由此可以破壞豆粕中的大多數抗營養因子，提高豆粕的消化、吸收和利用率［2，5-6］。酶法酶解豆粕制備大豆肽，因酶價格較高而使生產成本增加，且存在著產物得率不高的問題;而微生物發酵處理豆粕，一方面微生物在發酵過程中分泌的蛋白酶可降解豆粕形成小分子肽，有效降解其中的抗營養因子，另一方面微生物在發酵過程中產生的一些次級代謝產物還能有效改善大豆肽的風味［7-8］。固體發酵具有低能耗、節水、發酵產物穩定性較高、對無菌條件要求低、易加工等特點，有助于工業化生產［9］。關于混合菌固態發酵豆粕的工藝優化和大豆肽生理活性等方面的報道很多［1，7-8］，而結合生產實際對混合菌固體發酵工藝及發酵產物生理活性進行系統研究的報道較少，加強此方面的研究對降低大豆肽生產成本，提高大豆肽得率和產品品質，具有重要意義。

本文以實驗室篩選的產蛋白酶菌株(枯草芽孢桿菌)和植物乳桿菌對大豆豆粕進行混合菌固態發酵，以小肽含量和揮發性鹽基氮含量為檢測指標，系統研究了菌種配比、料水比、接種量、發酵溫度和發酵時間等單因素對固態發酵豆粕的影響，確定最佳的固態發酵工藝;并對發酵得到的大豆肽進行抗氧化和氨基酸成分分析。本研究將有助于豆粕的高值化開發及應用。

1 材料與方法

1.1 材料、主要化學試劑及培養基

1.1.1 實驗材料

豆粕:市場購買，粗蛋白質含量43.54%(實測)。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis J3)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum JNX):本實驗室保存。

1.1.2 主要化學試劑及培養基

ABTS ［2，2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)］:2，2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)

枯草芽孢桿菌(B.subtilis J3)的種子培養基(w/v):蛋白胨1%，牛肉浸粉0.3%，NaCl 0.5%。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis J3)的發酵培養基(w/v):玉米芯 0.5%，大豆豆粕 3.4%，K2HPO40.34%，(NH4)2SO40.2%，CaCO30.2%，pH 8.0。

植物乳桿菌(L.plantarum JNX)的種子培養基(w/v):蛋白胨 1%，牛肉浸粉 1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖 2%，乙酸鈉 0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，K2HPO40.2%，吐溫 -80 0.1%，pH 7.0。

植物乳桿菌(L.plantarum JNX)發酵培養基:蔗糖4%，蛋白胨1%，酵母提取物1%，乙酸鈉0.5%，Tween-80 0.15%，pH 5.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態發酵工藝流程

用種子培養基分別活化枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，按1%接種量接種到相應的發酵培養基中，將在30℃170 r/min振蕩培養20 h后的菌液接種到固體發酵培養基中，從菌種配比(1∶1，1∶2，2∶1)、料水比(1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1，1∶1.2)、接種量(3%，6%，9%，12%)、發酵溫度(25，30，35，40℃)和發酵時間(12，24，36，48，60 h)等5個因素進行發酵工藝優化，其中在菌種配比、料水比、接種量單因素優化時，發酵溫度為30℃、發酵時間為24 h。發酵完成后測定發酵產物中的小肽含量和揮發性鹽基氮含量。

1.2.1.1 小肽含量的測定

發酵產物中酸溶蛋白的含氮量測定:稱取發酵產物10 g，加入15% 三氯乙酸溶液60 mL溶解并定容至100 mL。10 000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，放入凱斯燒瓶中，采用凱氏定氮法測定含氮量，具體操作和計算參照 GBT 6432-1994［10］的測定方法。豆粕中含氮量的測定:稱取豆粕0.5 g加入到干燥的凱斯燒瓶中進行如上所述操作。

1.2.1.2 揮發性鹽基氮含量的測定

稱取10 g發酵產物置于含100 mL蒸餾水的燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌30 min后，倒入離心管中，10 000 r/min離心20 min，取10 mL上清液采用半微量定氮法測定揮發性鹽基氮的含量，具體操作和計算參照 GB/T 5009.44-2003［11］。

1.2.2 發酵產物中大豆活性肽的抗氧化活性測定

稱取10 g發酵產物于含100 mL蒸餾水的燒杯中，經磁力攪拌器攪拌30 min后，倒入離心管中，10 000 r/min離心20 min后取上清，適量稀釋成為待測液(大豆活性肽)，利用ABTS法［12］測定大豆肽的抗氧化活性，將大豆肽樣品換成蒸餾水作為對照，計算多肽的抗氧化活性?？寡趸钚杂孟蕘肀硎?。

式中，A0:ABTS+工作液的吸光度;A:待測液與ABTS+工作溶液反應時的吸光度。

1.2.3 發酵產物的SDS-PAGE電泳

取發酵后的豆粕用蒸餾水溶解、浸提、離心取上清液，具體操作同1.2.2，上清液用于SDS-PAGE電泳(15%的分離膠，5%的濃縮膠，電泳的電壓200 V)。以未發酵的豆粕提取液為對照。

1.2.4 發酵產物的氨基酸組成成分分析

分別稱取未接菌的豆粕和接菌的豆粕在30℃培養箱中固體發酵48 h后的產物10 g溶于100 mL蒸餾水中，于磁力攪拌器上攪拌30 min后，離心取上清液。取1 mL上清液用6 mol/L HCl 110℃水解24 h后，調pH至2.2，利用L8900型氨基酸自動分析儀檢測氨基酸組成成分及含量分析。

2 結果與討論

2.1 混合菌固體發酵豆粕的條件優化

2.1.1 菌種配比對發酵產物的影響

圖1 植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌配比對發酵產物中小肽含量與揮發性鹽基氮含量的影響Fig.1 Effect the ratio of L.plantarum JNX and B.subtilis J3 on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比選為1∶1，混合菌的接種量為6%，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌菌種設置不同配比進行固體發酵。圖1表明，在植物乳酸桿菌接種量一定的情況下，增加枯草芽孢桿菌的接種量 (菌株配比從1∶1至1∶2)，發酵產物的小肽含量明顯增加，從6.38%增加到10.13%;但發酵產物的揮發性鹽基氮含量亦從65.91 mg/100 g增加至84.74 mg/100 g。揮發性鹽基氮含量反映了發酵豆粕的氨基酸損失和腐敗程度，在發酵生產中應控制其含量在盡可能低的范圍內［1］，而在增加菌種配比中植物乳桿菌的比例(2∶1)情況下接種，發酵產物小肽含量為7.32%，高于1∶1菌株配比下發酵產物的小肽含量;同時揮發性鹽基氮含量降低至56.51 mg/100 g。因此選擇植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為 2∶1。

2.1.2 料水比對發酵產物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，混合菌(植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶1)的接種量為6%，設置不同的料水比進行固態發酵?？刂屏纤仁枪虘B發酵過程中重要環節之一，過高的含水量影響氧的傳遞，限制好氧菌的生長;過低的含水量，抑制菌體的生長，影響酶的活性［9］。由圖2可以看出，隨著料水比的增加，小肽含量和揮發性鹽基氮含量的總體變化趨勢均為先增加后減少，在料水比為1∶0.6時，小肽含量達到最大值(10.48%)，揮發性鹽基氮含量也最低(52.43 mg/100 g)。因此確定最佳料水比為 1∶0.6。

圖2 料水比對發酵產物中小肽含量與揮發性鹽基氮含量的影響Fig.2 Effect the ratio of material to water on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.1.3 接種量對發酵產物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比為1∶0.6，設置不同的接種量進行固態發酵，結果見圖3。

圖3 接種量對發酵產物中小肽含量與揮發性鹽基氮含量的影響Fig.3 Effect inoculum size on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

由圖3可知，隨著接種量的增加，小肽含量和揮發性鹽基氮含量均增加，接種量12%時，小肽含量雖高達12.75%，但揮發性鹽基氮含量也高達98.37 mg/100 g，遠超過生產中對揮發性鹽基氮含量的最低要求?；旌暇慕臃N量高，所產蛋白酶含量和活力高，使豆粕中更多的蛋白質降解為小肽，增加了小肽的含量;但是，菌體在固體發酵過程中產生的代謝副產物也相應增加，揮發性鹽基氮含量的增高將嚴重影響發酵豆粕的品質，合格植物肽蛋白飼料中揮發性鹽基氮含量應控制在50 mg/100 g以下［1］。接種量6%的發酵產物中揮發性鹽基氮含量最低，僅為50.77 mg/100 g;小肽含量為 10.02%，僅比最高值(12.75%)下降了2.73%。綜合考慮確定最適接種量為6%。

2.1.4 發酵溫度對發酵產物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比為1∶0.6，混合菌接種量為6%，分別置于不同溫度下固體發酵24 h。溫度不僅影響微生物的生長而且影響酶的活性，因固態發酵傳熱性差，故選擇合適的發酵溫度而使發酵反應進行下去變得尤為重要。由圖4可以看出，小肽含量和揮發性鹽基氮含量的總體變化趨勢是隨著溫度的升高而增加。發酵溫度為40℃時，發酵產物中小肽含量達到最高，為11.17%，而揮發性鹽基氮含量也高達92.03 mg/100 g。揮發性鹽基氮過高不僅使發酵的豆粕產生氨臭味、適口性變差，嚴重的會導致動物中毒［1］。當溫度為30℃時，揮發性鹽基氮含量僅為57.12 mg/100 g，且小肽含量略低于最高值，為9.57%。綜合考慮確定最適發酵溫度為30℃。

圖4 發酵溫度對發酵產物中小肽含量與揮發性鹽基氮含量的影響Fig.4 Effect fermentation temperature on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.1.5 發酵時間對發酵產物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比1∶0.6，混合菌接種量6%，于30℃培養箱中固體發酵不同時間。由圖5可以看出，隨著發酵時間的延長，菌群大量生長，蛋白酶活性增高，小肽的產量逐漸上升，但隨著發酵時間的延長，發酵副產物增多，揮發性鹽基氮含量也增加，降低了發酵產物的品質。發酵24 h時，揮發性鹽基氮含量最低，為50.70 mg/100 g;相對應的小肽含量為10.64%，略低于發酵48 h的小肽含量(12.76%)。實驗中也發現發酵48 h后，豆粕有些稀濕粘連，不利于產品的后續加工，也不利于菌體的生長。綜合考慮確定最適發酵周期為24 h。

圖5 發酵時間對發酵產物中小肽含量與揮發性鹽基氮含量的影響Fig.5 Effect fermentation time on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.2 混合菌固態發酵豆粕所制備大豆活性肽的抗氧化活性

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比1∶0.6，接入6%混合菌菌液，30℃培養箱中固態發酵。水浸提法提取大豆活性肽，利用ABTS法［12］測定大豆肽的抗氧化活性。對照組不接菌，其余同實驗組，實驗結果見圖6。

圖6 不同發酵時間下發酵產物中大豆肽的抗氧化活性變化趨勢Fig.6 Time course of antioxidant activity of soybean peptides in fermented products

由圖6可以看出，隨著發酵時間的延長，對照組的ABTS清除自由基能力基本在14.79%～20.17%之間;而在實驗組中不同發酵時間所提取的大豆肽，其清除自由基能力均在40%以上，隨著發酵時間的延長，所提取大豆肽的清除自由基能力提高，這與小肽含量變化規律(圖5)相吻合。固態發酵48 h時，所提取大豆肽的清除自由基能力最高，為65.76%。參與清除自由基的抗氧化肽的分離、純化及其氨基酸組成成分分析有待進一步深入地探討。

2.3 發酵產物的電泳分析

由SDS-PAGE電泳圖(圖7)可以看出，豆粕在枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌混合菌的最適發酵工藝條件下，隨發酵時間延長，大分子質量的豆粕被降解，發酵24 h后，發酵豆粕中所提取的大豆肽分子質量主要在10 kDa以下，這與龐宗文等［8］用毛霉發酵豆粕和ZHU等［13］用枯草芽孢桿菌發酵傳統豆制品的實驗結果相類似。

圖7 發酵產物的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE profile of fermentation products

2.4 發酵產物的氨基酸組成成分分析

將未接菌的(對照組)和接菌的(實驗組)豆粕在30℃培養箱中發酵48 h，其發酵產物經酸水解后測定氨基酸組成成分及其含量，實驗結果表明混合菌發酵后的氨基酸含量均高于未接菌的，其中脯氨酸高出16倍、甲硫氨酸高出14倍;而且甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸等必需氨基酸的含量均高于未發酵的豆粕提取液5倍以上(見表1)。已有的研究表明組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸等氨基酸具有一定的抗氧化活性［6，14］;且甲硫氨酸易從體內流失，需在食物中大量添加［4］。在本實驗中，混合菌發酵后的豆粕提取液中甲硫氨酸、酪氨酸和組氨酸含量明顯高于未接菌的，因此所制備的植物肽適于作為飼料添加劑。

表1 發酵產物的氨基酸組成成分含量分析mg/100mLTable 1 Free-amino acid profiles of unfermented and fermented soybean meal mg/100mL

3 結論

本文以在實際生產中衡量發酵豆粕品質常用的兩個重要參數(小肽含量和揮發性鹽基氮含量)為指標，從菌種配比、料水比、接種量、溫度、發酵周期等5個因素對混合菌固體發酵制備大豆肽的工藝進行優化，確定最佳固體發酵豆粕的工藝為:植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶1、料水比為1∶0.6、接種量為6%、發酵溫度為30℃、發酵周期24 h，此條件下，測得小肽含量為10.64%，與未發酵的對照組(小肽含量:1.82%)相比，小肽含量提高了近10倍;揮發性鹽基氮含量為50.70 mg/100 g，基本符合植物肽蛋白飼料中對揮發性鹽基氮含量的要求?；旌暇腆w發酵豆粕所產小肽的抗氧化能力高達65.76%，該發酵產物制成飼料后具有清除生物體內過量自由基的潛力，可用于預防自由基誘發的疾病。此外，混合菌發酵后的產物中必需氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸)含量高于未接菌的5倍以上，可有效補充動物體內的必需氨基酸。綜合以上結果，該固體發酵的豆粕將來可開發為富含小肽的產品，添加到動物飼料中。

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