低氧脅迫下大豆芽菜富集γ-氨基丁酸培養液組分優化*

王淑芳，楊潤強，宋玉，顧振新

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京，210095)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種4碳非蛋白質氨基酸，具有降血壓、調節心率、緩解壓力等生理功能［1］。當植物在熱擊、冷擊、鹽、機械刺激和低氧等脅迫條件下，谷氨酸脫羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)被強烈激活，從而導致GABA積累［2］。研究表明，植物來源的GAD是1種鈣調素(CaM)結合蛋白，其活性受Ca2+/CaM調控［3］。植物受到鹽脅迫時，細胞液中Ca2+濃度升高［4］，促使CaM轉錄水平提高，激活一系列生理反應。磷酸吡哆醛(PLP)作為GAD的輔基對其活性的發揮起重要作用［5］。從米胚中分離純化得到的GAD脫除輔基后，活性完全喪失，但在含有PLP的體系中，活性可以恢復到90%以上［6］。通常認為，鹽脅迫促進GABA的積累源于GAD活性的激活［7］。但近年來的研究表明，鹽脅迫條件下，植物體內游離態多胺(PAs)含量升高，多胺氧化酶(PAO)、DAO活性也隨之升高。

逆境條件下，植物籽粒的萌發和生長受到抑制、呼吸改變、蛋白酶、淀粉酶活性提高，同時合成GABA抵御脅迫。Yin等［8］報道，NaCl脅迫下發芽大豆中GABA大量富集;VB6作為PLP的結構類似物可激活發芽糙米中 GAD活力，從而富集 GABA［9］;Ca不僅與CaM形成Ca2+/CaM參與GAD活力的激活，而且可提高DAO活力［10］。因此，在大豆籽粒低氧脅迫下發芽時，采用同時含有NaCl、VB6和CaCl2的培養液，將對GABA的富集具有顯著作用。本研究優化了培養液組成，在優化的組分下，研究大豆發芽過程中主要生理生化指標和GABA含量的動態變化，以及GABA合成關鍵酶的變化情況，旨在探明大豆芽菜GABA富集的同時，明確其他主要營養成分變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大豆(云鶴YH-NJ)，2013年產自中國吉林省，購自江蘇省農業科學院，置 -20℃冰箱貯存，備用。GABA標準品(純度≥99%)美國Sigma公司;乙腈，上海陸都化學試劑廠;β-巰基乙醇，國藥集團化學試劑有限公司;EDTA，國藥集團化學試劑有限公司;磷酸吡哆醛，Sigma公司;丙三醇，國藥集團化學試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮，國藥集團化學試劑有限公司;過氧化物酶，上海國源生物技術有限公司;腐胺，美國Sigma公司。

1.3 主要儀器設備

Orion818型 pH測試儀，美國 Orion Research，Inc.;755B型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;液相色譜儀 Agilent 1200，安捷倫公司;TDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠;PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠。

1.4 大豆芽菜培養

取30 g大豆籽粒，用1%的NaClO水溶液浸泡消毒15 min，去離子水沖洗至pH中性，于30℃黑暗條件下浸泡6 h后置于24℃、相對濕度85%的發芽機中，以水為培養液發芽4 d，得大豆芽菜。

1.5 實驗設計

將芽菜置于帶蓋的培養瓶(φ 5 cm×18.5 cm)中，加入10 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)，通入空氣(0.9 L/min)，培養2 d。選取 NaCl(A)、VB6(B)和CaCl2(C)作為研究對象，采用3因素3水平實驗設計，評價各因素之間的交互作用，實驗因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Coded values of variables used in Box-Behnken design

1.6 生長動力學曲線

大豆經預處理后，置于優化后的培養液中脅迫培養2 d。每隔12 h取樣，樣品用蒸餾水清洗并用吸水紙吸干表面水分，液氮速凍后待測。以預處理方式培養為對照。

1.7 測定指標與方法

芽長:采用游標卡尺測量，每30株大豆芽菜作為一個樣本。

呼吸速率:采用小籃子法測定［11］。

可溶性蛋白含量:采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準［11］。

游離氨基酸:采用茚三酮溶液顯色法測定，以亮氨酸為標準［11］。

GABA含量:參照 Bai等［12］的方法測定。

GAD活性:參照張磊［13］的方法測定。

DAO活性:參照Yang等［14］的方法測定。

1.8 數據處理與統計分析

試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。應用SPSS 16.0作差異顯著性分析。Box-Behnken試驗結果采用設計專家8.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 培養液組分優化

對濃度 NaCl(mmol/L)(A)、VB6(μmol/L)(B)和CaCl2(mmol/L)(C)進行了3因素3水平響應面分析試驗，試驗設計與結果見表2。

采用Design Expert軟件對表中數據進行二次多元回歸擬合，得到GABA含量對編碼自變量A、B和C的二次多項回歸方程:

Y=0.941 09+0.003 890 83A+0.0405 64B+0.148 08C+0.000 267 5AB+0.001 197 92AC+0.000 487 5 BC-0.000 330 444A2-0.000 439 056B2-0.018 478C2

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Table 2 Design and response of the Box-Behnken

對上述回歸模型進行方差分析(表3)。結果表明，模型是顯著的(P＜0.001)，回歸模型的決定系數為0.958，說明該模型能夠解釋95.8%的變異。因此，可用此模型對GABA含量進行分析和預測。對回歸模型進行方差分析，F值為17.82，回歸模型極其顯著(P＜0.005)。模型的失擬性檢驗不顯著(P＞0.05)，說明二次模型相關性良好。模型的信噪比(adeq precision)為11.668，其值遠大于4。所有的統計分析特征值表明，模型具有實踐指導意義。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of Variance with regression model

根據回歸分析所得二次方程，在試驗設定范圍內，分析任意兩變量之間的交互作用，同時固定其他變量的取值，可得等高線圖。圖1-A表示CaCl2濃度為6.0 mmol/L時，NaCl和 VB6濃度對大豆芽菜GABA含量的影響。NaCl的一次項(P＜0.005)和二次項(P＜0.005)極其顯著影響GABA含量，NaCl和VB6的交互作用顯著。NaCl濃度一定時，GABA含量隨VB6濃度增加先升高后降低。VB6濃度較低(40～70 mmol/L)時，圖1-A中等高線分布較密，表明此時NaCl濃度對GABA含量的影響較大。當NaCl濃度42.49 mmol/L，VB6濃度 62.60 μmol/L 時，GABA含量達到最高值。

圖1 NaCl、VB6及 CaCl2的交互作用對GABA含量的影響Fig.1 Contour plots showing the effect of interaction between NaCl，VB6and CaCl2on GABA content

圖1-B表示，VB6濃度在70 μmol/L條件下，NaCl和CaCl2濃度對GABA含量的影響。CaCl2的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.05)顯著的影響大豆芽菜中GABA的含量，但NaCl和CaCl2濃度的交互作用不顯著(P=0.064 0)。在一定的NaCl濃度下，GABA含量隨著CaCl2濃度的增加呈現先增高后降低的趨勢，濃度為6.21 mmol/L時達到最高值。同樣，在一定CaCl2濃度下，GABA含量隨著NaCl濃度的增加呈現先增加后降低的趨勢，濃度為42.49 mmol/L達最大值。

CaCl2和VB6對大豆芽菜GABA含量的交互作用不顯著(圖1-C)。與VB6相比，CaCl2濃度對GABA含量的影響較大。當CaCl2濃度一定時，GABA含量隨VB6濃度增加呈逐漸升高的趨勢。CaCl2濃度為6.21 mmol/L、VB6濃度為 62.20 μmol/L 時，GABA 含量達到峰值。由此可見，培養液添加適當濃度的CaCl2和VB6可提高大豆芽菜中GABA含量。

2.2 培養液組分驗證試驗

對大豆芽菜GABA含量的二次多項數學模型解逆矩陣后得出，在低氧聯合鹽脅迫培養條件下，當培養液組分中NaCl濃度42.49 mmol/L、VB6濃度62.60 μmol/L、CaCl2濃度6.21 mmol/L時，大豆芽菜中GABA富集量的預測值為2.75 mg/g DW，實測值為2.77 mg/g DW，高于隨機選擇組。相關性分析表明，實測值與預測值接近，表明實驗所擬合的模型可用來預測培養液組分和試驗響應值之間的關系(表4)。

表4 驗證試驗設計和結果Table 4 Arrangement and result of validation trials

2.3 大豆發芽生長動力學曲線

如圖2-A所示，大豆芽長隨發芽時間延長而逐漸增長，脅迫條件下，大豆芽長增長緩慢，發芽132 h時，芽長僅為對照組的70%左右。這表明脅迫條件下大豆芽的生長受到了抑制。發芽96 h內，大豆呼吸速率隨發芽時間延長而增大，發芽96 h后，脅迫條件下大豆芽菜呼吸速率低于對照?？梢?，低氧脅迫，不利于大豆芽菜的呼吸作用(圖2-B)。由圖2-C可見，大豆發芽過程中可溶性蛋白含量逐漸降低，非脅迫組發芽144 h時可溶性蛋白含量比發芽0 h減少57.08 mg/g。而脅迫條件下大豆芽菜中可溶性蛋白含量迅速降低，發芽144 h時，可溶性蛋白含量比發芽0 h減少167.08 mg/g，僅為對照組的45.45%。這表明脅迫處理條件下大豆芽菜中更多的可溶性蛋白被分解利用。大豆芽菜游離氨基酸含量呈上升趨勢。脅迫培養144 h時，游離氨基酸含量比對照高94%，是發芽0 h的12.57倍?？梢?，低氧脅迫處理可促使大豆芽菜生成更多的游離氨基酸(圖2-D)。

圖2 大豆發芽期間主要生理生化變化Fig.2 The main physiological and biochemical changes of soybean during germination

隨發芽時間延長，大豆芽菜GAD活性逐漸增大。發芽0～96 h，大豆芽菜GAD活性緩慢增長，96～144 h大豆芽菜GAD活性增加迅速，發芽144 h時，活性達到最大值。低氧脅迫條件下GAD活性達到最大值時比非脅迫處理高14.66 U/g DW，這說明低氧脅迫對大豆芽菜中GAD活性有激活作用(圖2-E)。脅迫條件下，大豆DAO活性隨培養時間延長呈先升高后降低的趨勢(圖2-F)。培養72 h時，大豆DAO活性達到最大值。發芽96～144 h，脅迫組DAO活性高于對照組，脅迫處理120 h時，DAO活性是對照組的1.7倍。由此表明，逆境脅迫提高了大豆DAO活性。由圖2-G可知，大豆發芽0 ～144 h，GABA含量逐漸升高。發芽96 h時，脅迫處理大豆GABA含量急劇增加，脅迫處理144 h時，GABA含量為2.73 mg/g，顯著高于非脅迫處理?？梢?，脅迫培養有利于大豆芽菜中GABA積累。

由表5可見，低氧脅迫下，大豆芽長與游離氨基酸、GAD活性、GABA含量呈正相關，與呼吸強度、可溶性蛋白、DAO活性呈負相關。由此可見，大豆脅迫培養96～144 h過程中，大豆芽長逐漸增長，但呼吸強度減弱，DAO活力下降?？扇苄缘鞍着c游離氨基酸相關性在0.01水平上顯著，這說明可溶性蛋白與游離氨基酸兩者之間關系密切，在生命代謝過程中大分子蛋白被蛋白酶水解為小分子的游離氨基酸，供給代謝活動需要。GABA含量與可溶性蛋白、游離氨基酸相關性顯著，可見含氮物質在大豆芽菜體內的代謝是隨著可溶性蛋白的分解，游離氨基酸積累，GABA也逐漸積累的過程。

表5 低氧脅迫下大豆發芽期間生理生化指標和GABA含量的相關性Table 5 Correlations between physiological，biochemical parameters and GABA content in soybeans during germination under hypoxia

3 討論

PLP是GAD的輔酶，VB6與PLP結構相似，起到與PLP相同的功能。張磊［13］研究米糠中GABA富集時，添加0.40 mmol/L VB6后GABA含量達到最大值，添加量大于或小于0.40 mmol/L，GABA富集量均顯著下降。發芽蠶豆在VB6添加濃度為60 μmol/L時，GABA含量最大［15］。本實驗采用響應面實驗法得到VB6濃度62.60 μmol/L時，GABA富集量最大。

通常認為，鹽脅迫促進GABA的積累源于GAD活性的激活［7］。但近年來的研究表明，鹽脅迫條件下，植物體內游離態多胺含量升高，PAO、DAO活性也隨之升高。李巖［9］研究表明，低氧脅迫下鹽提高發芽蠶豆GAD和DAO活性，促進GABA富集，其中PAs降解對GABA富集的貢獻率在37.6%～45.0%。植物細胞內Ca2+對GAD活性的調節主要是通過鈣調素來完成的，但GAD提取后其活性是否受Ca2+影響，取決于分離得到的GAD是否結合有CaM。植物受到環境脅迫時均會引起胞質Ca2+濃度的增加［16］，增加的Ca2+刺激了GAD活性，促進了GABA的積累。本研究發現，外源添加NaCl和Ca2+對大豆芽菜富集GABA有積極作用，但是，Ca2+調控大豆體內代謝機理有待從分子水平加以深入研究。

Koca等［17］報道，鹽脅迫時發芽芝麻的芽長和根長受到不同程度的抑制。也有報道表明，GABA的合成能夠調節植物的生長和發育［18］。在莖伸長研究中，機械刺激引起的生長抑制現象可被Ca2+鰲合劑和CaM拮抗劑所阻斷。機械刺激能夠短時增加胞內Ca2+和 GABA 水平［19］，同時莖的伸長受到抑制［20］。GABA處理可刺激向日葵幼苗產生乙烯，促進ACC合成酶的轉錄［21］。用外源性GABA處理大豆可顯著提高葉片中腐胺、亞精胺和精胺的含量［22］。以上結果表明，GABA對植物生長的調節作用是通過調控乙烯和多胺的合成及含量實現的［23］。推測環境脅迫可以升高胞內 Ca2+和 H+水平，激活 GAD、DAO，引起GABA積累，然后GABA與其受體結合從而調控植物的生長發育。本研究得出大豆在脅迫發芽過程中，芽長生長受到抑制，呼吸速率降低，這與前人研究結果相近。

植物體內蛋白質等含氮化合物的變化反映了環境脅迫下植物代謝過程中蛋白質損傷程度。植物體內催化生化反應的酶是可溶性蛋白，逆境條件下往往導致酶活性提高，蛋白質等生物大分子物質發生降解，可溶性蛋白含量下降［24］，游離氨基酸含量的增加，為合成GABA提供充足的底物。同時，與脯氨酸、甜菜堿、蔗糖、多胺等相似，GABA可作為滲透調節物質起到抵御逆境脅迫作用［21］。從而，大豆芽菜在低氧聯合NaCl脅迫下GABA大量富集。除了物質基礎，GABA形成關鍵酶活性在脅迫條件下同樣顯著提高，本研究結果顯示，低氧脅迫條件下 GAD和DAO活性顯著高于對照，因此低氧脅迫下關鍵酶活性的提高也是GABA富集的關鍵因素。

4 結論

低氧脅迫下，NaCl、VB6和CaCl2顯著促進大豆芽菜GABA積累;并且NaCl和VB6對GABA富集具有顯著的交互作用。

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