黃秋葵花體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究*

朱艷芳，楊杰，劉東華，張愛民，薛建平，滕井通，盛瑋

1(淮北師范大學生命科學學院，安徽淮北，235000)

2(資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北，235000)

3(昆山東海農業發展有限公司，江蘇昆山，215301)

黃秋葵［Abelmoschus esculentus(L.)Moench］為錦葵科秋葵屬1年生草本植物，又名秋葵、咖啡黃葵、補腎草等，原產于非洲熱帶地區，現在我國大陸南北方各地均有黃秋葵的種植?？晒┦秤玫狞S秋葵嫩果，富含蛋白質、黃酮、多糖、不飽和脂肪酸、維生素等多種生物活性物質［1-2］，具有抗疲勞、提高機體免疫力、抗癌、健胃保肝、減少肺損傷、利尿、增強血管擴張力、保護心臟等多種保健功能［3-5］，是一種有巨大發展潛力的營養保健蔬菜［6-8］。

食物中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量與人類健康關系密切，其中人體攝入的硝酸鹽約70% ～80% 來自于蔬菜，1% 來自水果［9］。硝酸鹽自身對人體危害不大，但它在人或動物體內易被還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽又能與次級胺合成N-亞硝胺，尤其在胃液中更易合成。亞硝胺是目前所知的最強的化學致癌物質之一，能引起人和動物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤［10-11］。所以，多采用在模擬人體胃液條件下，通過研究天然植物成分清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的能力，來確定該植物的抗癌能力及食用價值。

目前種植黃秋葵主要出售嫩果，其種子及花沒有被充分利用，而種子和花中富含蛋白質、多不飽和脂肪酸、多糖、黃酮［12-13］等活性物質。因此，本文在體外模擬人體胃液環境下，對黃秋葵花清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵花，由昆山市東海農業發展有限公司提供，60℃烘箱烘干，粉碎后過20目篩備用。

二甲胺水溶液(33%)，為化學純;NaCl、濃 HCl、NaNO2、α-萘胺、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、Na2CO3、95%乙醇、VC，均為國藥生產的分析純;胃蛋白酶(3 500 u/mg)，購于Sigma公司。

模擬胃液A:稱取2.0 g NaCl加蒸餾水溶解，加入7 mL濃HCl，用蒸餾水定容至1 000 mL;模擬胃液B:在模擬胃液A的基礎上加入胃蛋白酶3.2 g，用蒸餾水定容至刻度。

NaNO2標準溶液:將NaNO2于硅膠干燥器中干操24 h后，稱取0.400 0 g加水溶解，定容至1 000 mL，即得濃度為400 μg/mL的NaNO2儲備液。取儲備液12.5 mL定容至1L，即得濃度為5 μg/mL的NaNO2溶液，取儲備液17.25 mL定容至100 mL，即得濃度為1 mmol/L的NaNO2溶液。

JA2003電子天平，上海良平儀器儀表有限公司;W21-420型三用電熱恒溫水浴鍋，天津市秦斯特儀器有限公司;UV-4802型紫外可見分光光度計，尤尼科上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃秋葵花提取液的制備

準確稱取10.00 g黃秋葵花，加200 mL 60%乙醇，60℃ 水浴浸提2 h后，過濾，收集濾液，再重復3次，將濾液定容至1 000 mL，并配成含有1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL黃秋葵花的提取液，備用。

1.2.2 黃秋葵花提取液對亞硝鈉的清除率的測定［14-16］

取12只25 mL容量瓶，均加入模擬胃液10.0 mL，37℃ 水浴 10 min，分別加入 0、1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL黃秋葵花提取液1.0 mL，再加入5 μg/mL的NaNO2溶液2.0 mL，置于37℃的水浴鍋中溫浴，10、30、60 min后取出，迅速加入0.4% 對氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置5 min后，各加1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，再靜置15 min，加水至刻度混勻。在538 nm處測定吸光度A1，同時做以蒸餾水替代NaNO2的空白對照實驗并測吸光度A01，以蒸餾水替代黃秋葵花提取液的空白對照實驗測定吸光度A02。

亞硝酸鹽清除率/%=［(A02+A01-A1)/A02］×100

1.2.3 黃秋葵花提取液對亞硝胺合成阻斷率的測定［14-15］

在12只25 mL容量瓶中各加入模擬胃液10.0 mL，分別加入 0、1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL 黃秋葵花的提取液1.0 mL，各加入1 mmol/L二甲胺溶液1.0mL，1 mmol/L的NaNO2溶液1.0 mL，用蒸餾水定容至刻度。于37℃水浴鍋中反應1 h。取出后，移液管吸取1.0 mL上述溶液至直徑7 cm的培養皿中，加入0.5%Na2CO3溶液0.5 mL，紫外燈照射15 min。取出后迅速加入1%對氨基苯磺酸1.5 mL，0.1% α-萘胺1.5 mL，蒸餾水0.5 mL，搖勻后靜置15 min。在525 nm處測定吸光度A1，同時做以蒸餾水替代亞硝酸鈉的空白對照實驗測定吸光度A01，以蒸餾水替代黃秋葵花提取液的空白對照實驗測定吸光度A02。

亞硝胺合成阻斷率/%=［(A02+A01-A1)/A02］×100

1.2.4 數據分析

所有試驗均重復3次，實驗數據使用Minitab15軟件處理，進行一般線性模型分析與擬合線圖分析。

2 結果與分析

2.1 黃秋葵花提取液對亞硝酸鹽的清除

2.1.1 黃秋葵花濃度對亞硝酸鹽清除率的影響

在模擬胃液A和B的2種反應體系中，分別加入不同濃度黃秋葵花的提取液，對NaNO2的清除效果如圖1。由圖1可知，黃秋葵花對亞硝酸鈉的清除率呈現規律性變化，即隨著黃秋葵花濃度的升高而增強，且在模擬胃液B中的清除效果優于模擬胃液A。當黃秋葵花為10 mg/mL的提取液，反應60 min時，在模擬胃液A和B兩種體系中，對亞硝酸鈉的清除率分別為98.26% 和99.36%，說明黃秋葵花提取液能有效清除亞硝酸鹽。

圖1 不同濃度黃秋葵花在A、B兩種胃液中對亞硝酸鹽的清除率Fig.1 The eliminating rate of nitrite by different concentration of Okra flower in two kinds of simulated human gastric juice

2.1.2 反應時間對亞硝酸鹽清除率的影響

在模擬胃液A和B的反應體系中加入黃秋葵花提取液，不同反應時間黃秋葵花提取液對亞硝酸鈉的清除效果如圖2。由圖2可知，黃秋葵花提取液對亞硝酸鹽的清除率隨著反應時間的延長而升高，且在模擬胃液B中的清除效果優于模擬胃液A。

2.1.3 黃秋葵花提取液清除亞硝酸鹽結果分析

由表1可知，亞硝酸鹽的清除率與黃秋葵花濃度及反應時間具有線性關系，清除率隨著濃度的升高及反應時間的延長而增強;亞硝酸鹽的清除率與不同模擬人體胃液也具有線性關系，且差異極顯著。根據回歸分析，見表2，R2表示清除率變異的77.7% 由反應濃度導致的，4.0% 由反應時間導致的，0.4% 由不同的模擬胃液導致的。

圖2 反應時間對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.2 Effects of reaction time on eliminating rate of nitrite

表1 亞硝酸鹽清除率方差分析Table 1 Analysis of variance for the rate of eliminating nitrite

表2 亞硝酸鹽清除率回歸分析Table 2 Regression analysis for the rate of eliminating nitrite

2.2 黃秋葵花提取液對亞硝胺合成的阻斷分析

在體外模擬胃液A和B的2種反應體系中，不同濃度黃秋葵花的提取液對亞硝胺合成的阻斷效果如圖3所示。由圖3可知，隨著黃秋葵花濃度的升高對亞硝胺合成的阻斷率也升高。當黃秋葵花濃度為10 mg/mL時，在模擬胃液A和B反應體系中對亞硝胺合成的阻斷率分別為70.29%和78.13%，說明黃秋葵花提取液能有效地阻斷亞硝胺的合成。由表3可知，亞硝胺合成的阻斷率與黃秋葵花的濃度有線性關系，阻斷率隨著濃度的升高而增強;亞硝胺合成的阻斷率與不同模擬人體胃液也具有線性關系，且差異極顯著。由回歸分析可知(見表4)，R2表示阻斷率變異的92.9% 由黃秋葵花濃度導致，1.1% 由不同模擬人體胃液所導致。

圖3 不同濃度黃秋葵花對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig.3 Effects of extract from different concentrations of Okra flower on blocking rate of nitrosamine

表3 亞硝胺合成阻斷率方差分析Table 3 Analysis of variance for the rate of blocking nitrosamine synthesis

表4 亞硝胺合成阻斷率的回歸分析Table 4 Regression analysis for the rate of blocking nitrosamine synthesis

2.3 黃秋葵花提取液與Vc在清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺合成能力方面的比較

Vc具有較強的抗氧化能力，不僅對亞硝酸鹽具有較強的清除能力，而且能有效阻斷亞硝胺的合成［17］。因此以Vc為陽性對照，比較黃秋葵花提取液對亞硝酸鹽的清除及阻斷亞硝胺合成能力，結果見表5。由表5可知，5 mg/mL黃秋葵花的提取液，在胃液A和胃液B中，對亞硝酸鹽的清除率分別為75.79% 和81.02%，與0.1 mg/mL Vc對亞硝酸鹽的清除能力相當;對亞硝胺合成的阻斷率分別為50.60% 和 54.24%，為 0.1 mg/mL Vc阻斷率的55.16%和59.13%。表明在模擬人體胃液條件下，黃秋葵花提取液能有效地清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺的合成，揭示黃秋葵花具有一定的防癌抗癌功能。

表5 黃秋葵花提取液與Vc對亞硝酸鹽的清除率及對亞硝胺合成阻斷率的比較Table 5 The eliminating rate of nitrite and the blocking rates of nitrosamine synthesis with extract from Okra flower and Vc

3 結論

體外黃秋葵花能有效清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，且清除率和阻斷率與黃秋葵花的濃度及作用時間成正相關。其中黃秋葵花的濃度對亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率的相關性較大。在添加了胃蛋白酶的模擬胃液B條件下，黃秋葵花提取液清除亞硝酸鹽與阻斷亞硝胺合成的效果均要好于模擬胃液A。在模擬胃液B中，5 mg/mL黃秋葵花的提取液作用10 min，對亞硝酸鹽的清除率達到81.02%，對亞硝胺合成的阻斷率達到54.24%。

黃秋葵花的提取液能有效地清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，清除體內亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成是預防癌癥的有效途徑。因此，黃秋葵花對防止癌癥病因的產生及心腦血管疾病具有重要的價值。若將黃秋葵花用于花茶的開發利用，不僅可以提高黃秋葵種植的經濟效益，而且將會有更大的社會效益。

［1］ 黃阿根，陳學好，高云中，等.黃秋葵的成分測定與分析［J］.食品科學，2007，28(5):451-455

［2］ 廖海兵.黃秋葵功效成分純化鑒定及其在不同品種間差異研究［D］.杭州:浙江農林大學，2012

［3］ 李建華，陳珊.黃秋葵水提取液抗疲勞的藥效學觀察［J］.中國運動醫學雜志，2004，23(2):196-197

［4］ 王君耀，周峻，湯谷平.黃秋葵抗疲勞作用的研究［J］.中國現代應用藥學雜志，2003，20(4):316-317

［5］ 趙煥煥，賈陸，裴迎新.黃秋葵粗多糖體外抗氧化活性測定［J］.鄭州大學學報:醫學版，2012，47(1):40-43

［6］ 董彩文，梁少華.黃秋葵的功能特性及綜合開發利用［J］.食品研究與開發，2007，28(5):180-182

［7］ 劉娜.黃秋葵的綜合利用及前景［J］.中國食物與營養，2006，(6):27-30

［8］ 單承鶯，馬世宏，張衛明.保健蔬菜黃秋葵的應用價值與前景［J］.中國野生植物資源，2012，31(5):68-71

［9］ 龐榮麗，何為華，方金豹，等.幾種果品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量［J］.果樹學報，2006，23(4):627-630

［10］ Lin J K.Nitrosamines as potential environmental carcinogens in man ［J］.Clinical Biochemistry，1990，2(1):67-71

［11］ Mohamed Mamary，Molham Habori，Zakaria Shoaibi，et al.Nitrosamine formation from different Catha edulis leaves extracts under simulated gastric condition［J］.Food Chemistry，2006，97(4):586-590

［12］ 詹忠根，李煜鍵，張宇.黃秋葵種子主要營養成分測定［J］.營養學報，2012，34(2):191-192

［13］ 胡帥，張騁，李強，等.不同黃秋葵花中總黃酮的提取和含量測定［J］.激光生物學報，2013，22(4):375-378

［14］ 李桂星，胡曉丹，孫愛東，等.模擬胃液條件下蘋果多酚對亞硝酸鹽的清除作用［J］.食品科學，2011，32(11):1-4

［15］ 梁英岳，傅亮，孫穎鶯，等.模擬胃液條件下紅豆多肽清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究［J］.食品與發酵工業，2010，36(4):40-44

［16］ 盛瑋，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究［J］.食品科學，2013，34(17):92-95

［17］ 王樹慶，姜薇薇，房曉，等.抗壞血酸的亞硝酸鹽清除能力的研究［J］.中國調味品，2011，36(11):22-24