稀堿法預處理橡子殼制備生物乙醇*

楊靜，蔣劍春，張寧，苗春存，衛民，趙劍

(中國林業科學研究院林產化學工業研究所;生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇南京，210042)

利用農林廢棄物作為原料生產乙醇，實現生物質資源的高值化利用，有利于改善生態環境，符合循環經濟發展的要求。橡子是殼斗科麻櫟屬和常綠櫧栲類野生植物橡樹的果實，有8個屬900余個種，分布于溫帶、亞熱帶和熱帶，我國占6個屬301個種［1］，每年可產60～70萬t橡子［2］。橡子仁既可作為動物飼料、工業原料，也可用來加工保健食品，以橡實淀粉為原料生產生物燃料酒精也是一條較好的利用途徑，成為目前研究的熱點［3］。由此產生的橡子殼產量大、來源廣、價格低，尚未得到很好的利用。

天然纖維素類物質含有木質素、纖維素和半纖維素，纖維素的有效水解受木質素的空間障礙和纖維素本身高結晶度和聚合度的阻礙，因此，欲水解纖維素必須對原料進行預處理。常用的預處理的方法主要有物理法、化學法、生物法和聯合預處理法等［4］。堿法預處理可以破壞木質素和半纖維素之間的化學鍵，具有較強的脫木質素能力，較酸法而言較為溫和，處理過程中糖的損失較少，最終預處理效果較好［5］。稀堿處理后，纖維質材料膨脹，內部表面積增大，聚合度降低，結晶度下降，從而提高水解效率［6］。本研究以林業廢棄物橡子殼為原料，考察稀堿法預處理對其酶水解效果的影響，期望得到低成本、高利用率且易于工業化的纖維素糖化工藝，為橡實資源的規?；_發以及在液體燃料生產中的應用提供有價值的參考。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

橡子采自安徽滁州，風干后脫殼，將橡子殼于105℃烘干，用粉碎機粉碎過篩得0.25～0.3 mm的橡子殼粉備用。

1.2 預處理

采用濃度分別為0.75%、1.0%和2%(w/v)的NaOH處理橡子殼，固液比1∶10(g∶mL)，分別在60℃水浴鍋和高壓蒸汽滅菌鍋中121℃(0.15 MPa)處理30、60和90 min。處理結束后，用蒸餾水將原料洗至中性，過濾，所得部分固體預處理原料于-20℃保存待酶水解，取部分烘干進行成分分析并計算固體回收率(yrec)。

1.3 成分分析

纖維素、半纖維素和木質素分析參照NREL［8］法測定，灰分的測定根據GB12086-1989進行。木質素絕對降解率的計算公式如下:

式中:yabs-木質素絕對降解率，%;yrec-原料固體回收率，%;Mor-未處理原料中木質素干重，g;Mpret-預處理后原料中木質素干重，g。

1.4 酶水解

稱取一定量的樣品，加入0.1 mol/L，pH 4.8的檸檬酸緩沖液，固液比為5%(w/v)，于50℃水浴中預熱20 min，每克原料加入20 FPU纖維素酶(阿拉丁，上海，酶活為 19.6 FPU/g)、20 CBU β-葡萄糖苷酶(Sigma-Aldrich，美國，酶活為9.3 CBU/mg)和1.5 FXU木聚糖酶，于50℃，150 r/min水解72 h。結束后，立即用冰塊終止酶水解，過濾，進行高效液相色譜分析。

1.5 發酵

所用菌種為嗜單寧管囊酵母(Pachysolen tannophilus)1770，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

斜面培養基:麥芽浸膏3 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母浸膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂20 g/L。121℃滅菌20 min。

種子培養基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，121℃滅菌30 min。

發酵培養基:橡子殼水解液，酵母浸膏2 g/L，(NH4)2SO410 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO42 g/L，初始pH 5.0，121℃滅菌20 min。

將斜面培養基上的酵母菌接種到種子培養基，48 h后作為菌種以8%的接種量(v/v)接種于發酵培養液中。于32℃，轉速120 r/min，發酵72 h，每12 h取樣，利用HPLC測定葡萄糖濃度和乙醇濃度。色譜條件為:色譜柱Aminex HPX-87H ion Exclusion Column(300 mm×7.8 mm)，美國伯樂;流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min;柱溫55℃，示差折光檢測器溫度35℃;進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 成分分析

對橡子殼進行成分分析并與其他木質素原料進行對比，結果見表1。橡子殼中纖維素的含量達到56.8%，和高粱桿的組成類似，低于麥草和其他硬/軟木［8］。木質素的含量較高，遠高于高粱桿、麥草等木質纖維素原料，但是較 Yal??n［8］等和 Ye?im［9］等報道的榛子殼含量低。橡子殼纖維素含量居中，高于高粱桿和榛子殼，在文獻報道的麥草的纖維素含量范圍內，可以加以利用。

表1 橡子殼化學組成以及與其他木質纖維素原料的對比(干重)Table 1 Chemical composition comparison among oak shell and other lignocellulosic biomass(dry weight)

2.2 固體回收率

在處理過程中，預處理液分別呈現紅褐色到黑色，隨著處理條件加劇顏色越深(C1:0.75%NaOH/30 min/60℃;C2:1%NaOH/60 min/60℃;C3:0.75%NaOH/30 min/121℃;C4:2%NaOH/30 min/121℃;C5:2%NaOH/60 min/121℃)。經過堿處理后，橡子殼的固體回收率在48.06%(w/w)(2%NaOH/90 min/121℃)到82.09%(0.75%NaOH/30 min/60℃)之間(圖1)。堿濃度、處理時間和溫度都對固體回收率有影響。其中溫度的影響最大，處理時間次之，影響最小的是堿濃度。在1%NaOH/60 min/121℃的相同處理條件下，對不同原料的固體回收率進行比較發現，橡子殼為68.9%(本研究)，高粱桿為48%［16］，玉米秸稈為43.8%［17］，棉花稈為59%［18］，大麥和黑小麥秸稈分別為68.5%和71.5%［19］，說明不同原料對相同條件下堿處理的效果不同。

圖1 不同預處理條件下橡子殼的固體回收率Fig.1 Solid recovery rates of Oak shell at different conditions

2.3 木質素去除率

木質素是構成植物細胞壁的主要成分之一，通過與纖維素和半纖維素相連接從而限制纖維素酶到達纖維素。降低生物質原料的木質素含量有助于纖維中的無定形區及結晶區表面大量溶出，提高酶對纖維素的可及性。

木質素的去除率從一定程度上反映了稀堿預處理的效果。通過測定預處理原料中的酸不溶木質素隨溫度、堿液濃度以及處理時間的脫除程度來定量分析堿法處理橡子殼的效果。結果見圖2。溫度升高大大提高了橡子殼堿法預處理的木素去除率，即121℃(0.15 MPa)比60℃時效果要好。在121℃時，去除率為10.24%(0.75%NaOH/30 min)到39.34%(2%NaOH/60 min)。而在 60℃ 時，為 5.08%(0.75%NaOH/30 min)到23.35%(2%NaOH/90 min)。Mcintosh等［16］報道，在60℃和121 ℃時，隨著處理時間的增加，高粱稈的木素去除率均增加。但是，在本研究中，處理時間的增加并不總是能提高去除率。相反，最大去除率出現在60 min/121℃處，在此條件下，延長處理時間(90 min)并沒有提高去除率。結合圖1，可能的原因是，處理時間延長，碳水化合物降解更多，導致木質素的比例增加。根據固體回收率和降解前后木質素含量計算得出木質素絕對降解率，2%NaOH/60 min/121℃時為 61.82%，2%NaOH/90 min/121℃時為63.12%，后者的去除率相對較高。

圖2 不同預處理條件對橡子殼中木質素去除率的影響Fig.2 The effect of different conditions on deligninfication of shell

在所有的處理條件下，堿液濃度對木質素去除率的影響均較明顯，高濃度堿液有利于木質素的去除。Varga等［17］利用10%NaOH處理玉米秸稈，高壓蒸汽滅菌鍋處理1 h，木質素去除率達到95%，但是，可回收碳水化合物量急劇下降。木質素的脫除效果與原料本身結構有關(如，草類、軟木和硬木)，也受收獲時間、收獲方法、干燥程度和儲存條件的影響［20］。

2.4 酶水解

考察了反應溫度(60℃，121℃/0.15 MPa)、反應時間(30、60和90 min)和堿濃度(0.75%，1%和2%，w/v)對酶水解效果的影響。每克預處理原料的酶用量為20 FPU纖維素酶、20 CBU β-葡萄糖苷酶和1.5 FXU木聚糖酶。酶解結束后利用HPLC測定水解液中的單糖含量，結果見圖3。高溫處理酶水解的效果較好。在121℃時，堿液濃度從0.75%提高到2%，大大增加了單糖得率。最高單糖得率為606.36 mg/g(549 mg葡萄糖、38.2 mg木糖以及19.16 mg阿拉伯糖)出現在2%NaOH/60 min/121℃處。而在同樣條件下將處理時間延長到90 min，糖含量不再增加。其中最主要的原因可能是在劇烈條件下，纖維素的損失率較高。該溫度和堿液濃度對酶水解效果的影響趨勢與Mcintosh等［16］的報道類似。

在60℃時，隨著堿液濃度和處理時間的增加，糖釋放量增加。最大單糖得率為377.4 mg/g出現在2%NaOH/90 min處。當處理時間從30 min增加到60 min時，單糖得率增幅不大，但是延長至90 min時，在2%的堿液濃度下，單糖得率大幅增加，并且該數值高于0.75%/90 min/121℃和1%/90 min/121℃組合下的得率，并與0.75%/30 min/121℃組的得率接近。這說明在較溫和的堿法處理條件下，最優溫度和堿液濃度的數值可能會更低，從而降低能源消耗和成本。

圖3 不同預處理條件對單糖生成量的影響Fig.3 The effect of different pretreatment conditions on monomeric sugar release

2.5 發酵

對采用最優預處理條件處理后的橡子殼(2%NaOH/60 min/121℃)進行酶水解，結束后，收集水解液，液相色譜測定水解液中葡萄糖含量為27.45 g/L，調節pH至5.0接種嗜單寧管囊酵母進行發酵，結果見圖4。發酵48 h后，乙醇含量達到穩定，葡萄糖利用率達到96.7%。60 h后，經測定發酵液中乙醇濃度最大為11.96 g/L，為理論產率的85.4%，獲得了較好的效果。

2.6 物料衡算(圖5)

經2%NaOH，在121℃/15 MPa處理60 min所得的預處理原料的酶水解效果最好。經過預處理，有31%的固體損失，其中包括部分糖。經20 FPU纖維素酶、20 CBUβ-葡萄糖苷酶和1.5 FXU木聚糖酶的酶水解(固液比5%，w/v，50℃水解48 h)，每克未處理原料得到378.8 mg葡萄糖、26.36 mg木糖和13.22 mg阿拉伯糖，經過48 h的嗜單寧管囊酵母發酵，乙醇生成量為165.05 mg，為理論產率的85.4%。

圖4 發酵過程中葡萄糖消耗和乙醇生成圖Fig.4 Glucose consumption and ethanol during fermentation

圖5 橡子殼預處理、酶水解以及發酵物料衡算Fig.5 Mass balance of pretreatment，enzymatic hydrolysis and fermentation for oak shells

3 結論

本文以橡子殼為原料考察了稀堿法預處理對其酶水解和發酵制備乙醇的影響。結果發現，堿法預處理可以獲得高糖回收率并大大增加了酶水解效果。最優處理條件為2%NaOH，121℃(0.15 MPa)處理60 min，在此條件經酶水解的單糖得率達到606.36 mg/g(處理原料)，單糖轉化率達到78.8%。經過嗜單寧管囊酵母發酵，乙醇濃度達到11.96 g/L，為理論產率的85.4%，達到了較好的效果，為橡子殼的回收利用提供了一條新的途徑。

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