5°海紅果酒發酵工藝的優化*

楊輝，黨翠紅

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

海紅果(Malus micromalus Makino)，學名西府海棠，薔薇科蘋果屬，又名海紅子，是我國晉、陜、蒙三省交界地帶特有的一種地方果樹資源，營養價值豐富，富含蛋白質、VC、16種氨基酸、多種礦質元素，其中賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等人體必需氨基酸含量是紅星蘋果的2.2倍，有“果中鈣王”之美譽，磷含量居水果之首，Fe、Zn等金屬元素含量也高于其他常見水果［1］。此外，海紅果中富含的黃酮、多酚類化合物更是賦予其降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化等保健功效［2-4］。

本研究針對海紅果含糖量高的特點將其直接發酵生產低度果酒(乙醇體積分數為1% ～7%［5］)，不僅能發揮發酵酒特有的保健作用，而且能充分利用海紅果資源，發揮其保健功效，同時，低度果酒的研制避免了高酒精度對人體的不良影響，擴大了消費人群［6-9］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮海紅果汁:由陜西府谷縣聚金邦農產品開發公司提供。

活性干酵母:VL1、VL2由陜西府谷縣聚金邦農產品開發公司提供;RV100、RV171購于安琪酵母股份有限公司;丹寶利購于廣東丹寶利酵母有限公司。皂土、白砂糖(食品級)、H2SO3(6%，分析純)、檸檬酸(分析純)、Na2CO3(分析純)、CaCO3(分析純)，市售。

1.2 儀器與設備

振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;pH計，成都市方舟科技開發公司;手持糖度計，成都光學儀器廠;磁力攪拌器，江蘇省金壇市正基儀器有限公司;高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 指標測定

理化指標的測定參考GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》?？偺?費林試劑法;酒精度:密度瓶法;總酸:電位滴定法;揮發酸(以乙酸計):滴定法;游離SO2:氧化法;干浸出物:密度瓶法。

感官指標:參照GB/T15038-2006制定甜型海紅果酒評分標準，由20名專業人員組成的感官評定小組進行評定，取其感官評定分數的平均值作為評定結果，感官評分標準見表1。

1.3.2 工藝流程及要點

1.3.2.1 工藝流程

表1 甜型海紅果酒感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of sweet Malus micromalus Makino wine

1.3.2.2 操作要點

前處理:根據糖度每降低17 g/L，乙醇體積分數升高1%計算，要生產5°的甜型海紅果酒(糖度≥50 g/L)，稀釋后海紅果汁的初始糖度必須≥135 g/L。將調整成分后的海紅果汁進行巴氏殺菌處理(68℃、30 min)，冷卻后向海紅果汁加入60 mg/L的SO2以抑制雜菌及野生酵母生長。

活性干酵母的活化:稱取所需量的活性干酵母，加入20 mL左右的待發酵海紅果汁，在37℃水浴中活化30 min，再加入少量待發酵海紅果汁降溫，直至溫度下降到與待發酵海紅果汁溫差在5℃以內即可攪拌接種。

終止發酵:接種酵母后定時測定發酵酒液的總糖含量，當監測到總糖含量減少量為85 g/L(乙醇體積分數為5%左右)時，測定發酵酒液的酒精度并立刻終止發酵，終止發酵采用冷凍離心分離酵母后加入60 mg/L的SO2的方法，離心的條件為4 000 r/min，10 min。

海紅果原酒的澄清:稱取10 g皂土，緩緩加入100 mL 50℃左右的蒸餾水中，浸泡24 h，再攪拌成均勻的漿體，制備成5%的皂土溶液，再將其在水浴中加熱至80℃，冷卻備用。皂土溶液的添加量為1%。

1.3.3 酵母篩選

調整海紅果汁可溶性固形物含量為20°Brix(費林法測得總糖含量為159.18 g/L)，此時，總酸含量為12.57 g/L，以0.02%的接種量分別接種 VL1、VL2、RV100、RV171、丹寶利活性干酵母，在自然 pH條件下進行發酵，控制發酵溫度20℃，終止發酵后經過后處理制得5°海紅果酒，綜合比較各種酵母的起酵時間，最終成品酒的總酸含量、揮發酸含量以及感官評定分數，選出最適宜釀造5°海紅果酒的酵母。

1.3.4 影響海紅果酒發酵效果的單因素試驗

1.3.4.1 發酵溫度對發酵效果的影響

調整海紅果汁可溶性固形物含量為20°Brix(費林法測得總糖含量為158.28 g/L)，此時，總酸含量為12.07 g/L，在果汁自然pH條件下以0.02%的接種量接種5度海紅果酒最適酵母進行發酵，控制發酵溫度為 12、16、20、24、28℃，監測發酵酒液的總糖含量變化，終止發酵及后處理后，探討發酵溫度對5°海紅果酒發酵效果的影響。

1.3.4.2 酵母接種量對發酵效果的影響

將海紅果汁可溶性固形物含量調整為20°Brix(費林法測得總糖含量為157.17 g/L)，此時，總酸含量為12.62 g/L，在果汁自然pH條件下分別以0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的接種量接種酵母，控制發酵溫度20℃，終止發酵及后處理后，探討酵母接種量對果酒發酵的影響。

1.3.4.3 初始糖度對發酵效果的影響

用海紅果濃縮汁、白砂糖將海紅果汁可溶性固形物含量分別調整為 18、20、22、24、26°Brix(費林法測得總糖含量分別為 141.12、163.72、187.85、205.92、231.55 g/L)，此時，總酸含量為12.02 g/L，在果汁自然pH條件下以0.02%的接種量接種5度海紅果酒最適酵母，控制發酵溫度20℃，終止發酵及后處理后，探討初始糖度對發酵效果的影響。

1.3.4.4 初始pH對發酵效果的影響

將海紅果汁可溶性固形物含量調整為20°Brix(費林法測得總糖含量為154.79 g/L)，用檸檬酸、Na2CO3將果汁的初始pH分別調整為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，并用檸檬酸、CaCO3調整初始pH至3.5作為對照，此時，總酸含量分別為36.47、15.19、10.62、8.94、6.58、11.27 g/L，均以 0.02%的接種量接種 5度海紅果酒最適酵母，控制發酵溫度20℃，終止發酵及后處理后，探討初始pH對5度海紅果酒發酵效果的影響。

1.3.5 響應面法優化5度海紅果酒發酵工藝

在單因素試驗的基礎上，選取發酵溫度(A)、酵母接種量(B)、初始糖度(C)、初始pH(D)為響應面優化的考察因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，由于將乙醇體積分數統一控制在5%，故以成品酒的感官評定分數為響應值，設計4因素3水平的響應面分析試驗，試驗因素及水平表見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 結果與分析

2.1 酵母種類對發酵效果的影響

由于海紅果汁的初始pH較低，為2.9左右，低pH會抑制酵母菌的生長，因此表3顯示5種酵母的起酵時間均較長。相對而言，VL1最短，其次為VL2;5種酵母從開始發酵產酒到總糖含量下降85 g/L(乙醇體積分數5%)所需的時間均為3～4d，因此，酵母的起酵時間決定了整個發酵周期的長短。不同的酵母由于產生的揮發性化合物種類、含量不同而給酒帶來不同的感官特征［10］。由于海紅果果實中含酸較高，制成的海紅果酒口感偏酸，因此在發酵過程中盡量選擇產酸較少的酵母種類，由表3可以看出最后制得的成品酒的總酸、揮發酸含量最低的是VL2，其次為安琪RV171，而且VL2和安琪RV171釀造的5°海紅果酒感官評定分數也相對較高，分別為84.31和86.75，綜合考慮起酵時間、成品酒的總酸含量、揮發酸含量及感官評定分數，確定VL2為最適合釀造5°海紅果酒的酵母。

表3 酵母種類對5°海紅果酒發酵的影響Table 3 Effect of yeast type on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2 影響海紅果酒發酵效果的單因素試驗結果

2.2.1 發酵溫度對發酵效果的影響

由表4可知發酵溫度越高，酵母的起酵時間越短，這是由于在一定溫度范圍內，發酵溫度越高，酵母的生長速率和酶活力越高［11］。但是發酵溫度過高果酒的口感粗糙，而且酵母會產生其他代謝副產物如甲醇等，發酵溫度過低時，酵母菌受溫度脅迫而發酵緩慢，引起揮發酸升高，綜合比較成品酒的總酸、揮發酸含量和感官評定分數，發酵溫度為20℃時，總酸、揮發酸含量較低，感官評定分數最高，因此初步確定20℃為較適宜的發酵溫度。

表4 發酵溫度對5°海紅果酒發酵的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2.2 酵母接種量對發酵效果的影響

由表5可以看出，酵母接種量越大，起酵時間越短。接種量過小，酵母自身繁殖代謝慢，易污染雜菌，導致酒質不協調。但是接種量過大時，發酵過于迅速，增大了5°酒終止發酵的難度，且造成了原料的浪費。接種量為0.02%～0.04%時起酵時間相差較小，因此將接種量范圍初步確定在0.02% ～0.04%。而感官評定分數隨著接種量的增大呈現先增大后降低的趨勢，接種量為0.03%時感官評定分數最高，且總酸、揮發酸含量相對較低，因此初步確定活性干酵母的接種量為0.03%。

表5 酵母接種量對5°海紅果酒發酵的影響Table 5 Effect of inoculum size of yeast on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2.3 初始糖度對發酵效果的影響

由表6可以看出初始糖度越高，起酵時間越長，原因在于含糖量過高，形成了發酵酒液的高滲透，降低酵母的活性。隨著糖度的增加，總酸含量降低;揮發酸含量增加，這是由于高糖條件下酵母菌受高滲透壓脅迫發生不完全發酵形成醋酸，因此為了控制較低的揮發酸含量，初始糖度不能過高。隨著糖度的增加，感官評定分數先上升后下降，原因在于最終的成品乙醇體積分數統一在5%左右，即按照糖度與酒精度的換算公式整個發酵過程消耗的總糖量均為85 g/L左右，因此初始糖度越高，最終成品酒的殘糖也相應越高，糖酸比逐漸變大，使酒的口感過甜而偏膩，殘糖低則口感偏酸。另外，由于本研究控制海紅果酒的乙醇體積分數為5%，不能用傳統的添加酒精的方法終止發酵［12］，因此，當發酵酒液乙醇體積分數達到5%時，高殘糖必將增大終止發酵的難度，并且不利于成品酒的保存。因此，綜合考慮起酵時間、口感、保存期限等因素，將海紅果汁的初始糖度確定為20°Brix。

表6 初始糖度對5°海紅果酒發酵的影響Table 6 Effect of initial sugar concentration on 5%(v/v)Malus mrcromalus Makino wine fermentation

2.2.4 初始pH對發酵效果的影響

pH值對酵母菌的生長繁殖和代謝產物的合成都有極大的影響，大多數種類的酵母菌在4.5～6.5的pH范圍內生長代謝良好［11］。由表7可以看出初始pH越高起酵時間越短，且初始pH≥3.5時，酵母的起酵時間均較短，約24h左右。初始pH越高，成品酒總酸含量越低，適當的酸度會賦予酒獨特的酸爽口感，酸度過低，會使酒的口感膩而平淡［13］。且隨著初始pH增大，揮發酸含量先下降后上升，原因在于發酵液pH高于4.0或低于3.1時，都易于促進揮發酸的生成;感官評定分數先上升后下降，用CaCO3調整初始pH為3.5時，成品酒的揮發酸含量最低，但是CaCO3的加入對酒的口感和酒質的負面影響較大，感官評定分數低。在pH值為3.5時，成品酒感官評定分數最高，揮發酸含量較低，總酸含量適中，且與果汁自然pH值2.9相對接近，利于保證海紅果酒的風格。因此初步確定用Na2CO3調整初始pH為3.5，為較適合的條件。

表7 初始pH對5度海紅果酒發酵的影響Table 7 Effect of initial pH on 5%(v/v)Malus mrcromalus Makino wine fermentation

2.3 響應面法優化果酒發酵工藝

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗

在單因素試驗的基礎上根據Box-Behnken中心組合設計原理進行響應面試驗，試驗結果見表8。

表8 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 8 Experimental design and results of Box-Behnken central composite design

通過Design Expert7.0軟件對試驗響應值進行二元回歸擬合分析，確立回歸方程模型為:Y=86.42+0.69A-0.39B-0.017C+0.23D-0.25AB-0.075AC-0.075BD-0.075CD-1.14A2-1.07B2-0.43C2-0.056D2?；貧w模型的方差分析見表9。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Analsis of variance for the regression model

根據方程系數的估計，可知各因素對響應值影響的主次順序為A(發酵溫度)＞B(酵母接種量)＞D(初始pH)＞C(初始糖度)。

2.3.2 優化工藝條件的確定

根據所建立的數學模型進行參數的最優化分析，得出5°海紅果酒發酵的最優條件為發酵溫度20.67℃、酵母接種量0.027%、初始糖度19.86°Brix、初始pH 3.7?？紤]實際操作性，將發酵工藝參數修正為:發酵溫度21℃、酵母接種量0.027%、初始糖度20°Brix、初始 pH 3.7。

2.3.3 驗證性試驗

在優化條件下，成品酒的感官評定分數預測值為86.30。為檢驗試驗結果的可靠性，采用上述優化條件進行3組平行驗證性實驗，其實驗結果為86.15、86.20、86.15，平均值為 86.17，因此，采用響應面法優化5度海紅果酒發酵工藝參數準確可靠，具有一定的實用價值。

2.3.4 產品感官指標與理化指標

感官指標:5°海紅果酒色澤呈淺紅棕色，澄清透明，果香濃郁，口感醇厚協調，具有典型的甜型酒風格。

主要理化指標:乙醇體積分數為4.90% ～5.10%;總酸10～12 g/L(以酒石酸計);總糖68.3～71.7 g/L;游離SO2＜50 mg/L;干浸出物39.6 g/L。

微生物指標:符合GB2758-2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》的規定。

3 結論

(1)VL2是釀造5°海紅果酒的最適酵母。

(2)響應面法優化5°海紅果酒最優工藝條件為:發酵溫度21℃、酵母接種量0.027%、初始糖度20°Brix、初始pH 3.7，在此條件下，成品酒的感官評定分數為86.17。所得果酒果香濃郁、酒香協調，是一種營養豐富的低度保健型果酒。

(致謝 感謝榆林市海紅果工程技術研究中心的對本文大力支持。)

［1］ 王永熙，白與年.府谷海紅子［J］.果樹科學，1995(12):153-154.

［2］ 趙亮.海紅果藥用價值的初步研究［D］.太原:山西醫科大學，2006.

［3］ 徐玉霞，王華斌.酶法提取海紅果總黃酮工藝及海紅果黃酮粗提物對HeLa細胞的增殖作用［J］.中國農業大學學報，2013，18(1):119-127.

［4］ 王猛，王敏，李環宇，等.海紅果酚類物質種類及其抗氧化能力的研究［J］.現代食品科技，2013，29(11):2 633-2 637;2 787.

［5］ GB/T15037-2006.葡萄酒［S］.

［6］ 李艷，馬麗，李靜.低醇葡萄酒研究進展［J］.釀酒，2006，33(4):9-11.

［7］ Manuel Q，Virginia R，Ramon G，et al.Selection of Non-Saccharomyces yeast strains for reducing alcohol levels in wine by sugar respiration［J］.International Journal of Food Microbiology，2014(181):85-91.

［8］ Alejandro Ruiz-Rodriguez，Tiziana Fornari，Laura Jaime，et al.Supercritical CO2eatraction applied toward the production of a functional beverage［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2012，61:92-100.

［9］ Noemi Garcia-Martin，Silvia Perez-Magarifio，Miriam Ortega-heras，et al.Sugar reduction in musts with nanofiltration membranes to obtain low alcohol-content wines［J］.Separation and Purification Technology，2010，76(2):158-170.

［10］ SUN Shu Yang，JIANG Wen Guang，ZHAO Yu Ping.E-valuation of different Saccharomyces cerevisiae strains on the profile of volatile compounds and polyphenols in cherry wines［J］.Food Chemistry，2011，127(2):547-555.

［11］ Reddy L V A，Reddy O V S.Effect of fermentation conditions on yeast growth and volatile composition of wine produced from mango(Mangifera indica L.)fruit juice［J］.Food and Bioproducts Processing，2011，89(4):487-491.

［12］ Mariana González-álvarez，Raquel Noguerol-Pato，Carmen González-Barreiro，et al.Sensory description of sweet wines obtained by the winemaking procedures of raisining，botrytisation and fortification［J］.Food Chemistry，2014，145(15):1 021-1 030.

［13］ Mirko Gobbi，Francesca Comitini，Paola Domizio，et al.Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation:a strategy to enhance acidity and improve the overall quality of wine［J］.Food Microbiology，2013，33(2):271-281.