乳酸菌苯乳酸的合成及其代謝調控機制研究進展*

蘆夏霏，劉畢琴，柳陳堅，李曉然，羅義勇

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明，650500)

乳酸菌(LAB)是一類可發酵碳水化合物，并產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌，是傳統發酵食品的主要菌群，長期定居于人類腸道中并且益于人體健康，被公認為食品級安全的微生物。苯乳酸(PLA)是近年來發現的一種具有廣譜抑菌性的新型生物防腐劑，不僅能有效抑制革蘭氏陰性和陽性細菌的生長，對真菌同樣具有抑制作用［1］。目前，市場上的食品防腐劑種類繁多，按來源可分為化學防腐劑和天然防腐劑兩大類。天然防腐劑具有較高的安全性，是防腐劑未來的發展趨勢。PLA作為一種新型的生物防腐劑可由LAB發酵產生，由于LAB是公認的食品級安全微生物，所以來源于LAB的PLA對人和動物細胞無毒害［2-3］，可以視為食品級安全的天然防腐劑。一般來說，PLA的產量主要取決于微生物的遺傳特性，研究LAB高產PLA的分子機制以及通過代謝工程或基因工程手段改造實驗菌株是獲得大量PLA的前體條件。因此，本文綜述了LAB PLA的代謝途徑及其調控機制，旨在為PLA的高水平生產以及工業化利用提供理論支撐。

1 LAB PLA生物合成的核心途徑

在生物合成途徑發現以前，PLA多以化學合成為主。由于化學合成法存在副產物多、排放污染物多、設備要求高和合成技術復雜等缺點［1］，所以近年來，PLA的生物合成途徑，特別是來源于LAB的生物合成途徑受到了越來越多的關注。

Lavermicocca等［4］從酸面團中分離到植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)21B和20B，其代謝產物具有抑菌性。進一步研究證實，PLA是賦予該抑菌性的主要原因，這是關于LAB產生PLA的首次報道。隨后，越來越多能產生PLA的LAB菌株相繼被研究人員發現［5-6］。李興峰等［7］研究了 Lb.sp.SK007 利用苯丙氨酸(Phe)合成PLA的過程，發現LAB首先通過轉氨反應將Phe轉化成苯丙酮酸(PPA)，然后PPA經還原反應生成PLA。以Lb.plantarum LY-78為研究對象，李士龍等［7］也證實了“Phe→PPA→PLA”途徑是LAB PLA生物合成核心途徑的重要組成部分。此外，越來越多的研究發現，α-酮戊二酸也是LAB PLA生物合成核心途徑的一部分。同樣以Lb.sp.SK007為實驗材料，李興峰等［8］對影響PLA合成途徑中轉氨反應的因素進行研究，確定氨基受體α-酮戊二酸是轉氨反應的主要影響因素，只有Phe和α-酮戊二酸共同作用才可完成轉氨反應。相似的發現存在于 Pudik和 Lolkema［9］的研究中，即 α-酮戊二酸是LAB PLA合成的關鍵因素，較高濃度的α-酮戊二酸有助于PLA的生成。所以，LAB PLA生物合成的核心途徑是指LAB發酵Phe和α-酮戊二酸生成PLA的過程(圖1 A)。

2 LAB PLA生物合成的相關途徑

LAB PLA主要由Phe的代謝生成，除此之外還有一些其他的合成相關途徑(圖1 B)。劉鳳麗和江波［10］在關于Lb.sp.SK007生物合成PLA的研究中，發現PPA在脫羧酶的作用下可以生成苯乙醛，苯乙醛在脫氫酶的作用下也可以生成PLA。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫，對已知全基因組序列的Lb.plantarum WCFS1、JDM1和ST-III［11］進行PLA相關的代謝途徑分析，發現酪氨酸經脫羧酶作用生成酪胺，酪胺可以在單胺氧化酶的作用下生成苯乙醛(圖1B)，所以酪氨酸代謝可能通過苯乙醛這個節點對PLA代謝有一定影響。Gummalla和 Broadbent［12］為了確定 Lactobacillus代謝 Phe 對干酪風味的影響，利用色譜技術分析了Phe的代謝產物，結果發現PLA、苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸是Phe的主要代謝產物。苯乙醛和苯乙酸有共同的代謝產物苯乙醇，所以“苯乙酸→苯乙醛→苯乙醇”是LAB PLA生物合成的相關途徑之一。此外，基于α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途徑不可或缺的部分［8-9］以及α-酮戊二酸是三羧酸循環(TCA)中的重要物質之一的背景知識，可以推測TCA途徑對PLA的合成會產生一定的影響，所以TCA應該也是PLA生物合成的相關途徑之一(圖1 B)。

3 LAB PLA的分解代謝途徑

LAB PLA產量的多少除了跟生物合成途徑相關外，分解代謝同樣具有重要影響。目前，關于LAB PLA分解代謝途徑的研究較少，且缺乏系統性的研究。李遠頌等［1］發現，PLA除了可以代謝為非蛋白氨基酸施德定(一種很有效的胃蛋白酶抑制劑)外，還可以直接轉化為1-溴-2，3苯甲烷，再轉化為2-苯基雙氫苯并吡喃，最后轉化為四氫噻唑二酮衍生物(圖1 C)。另外，利用物理化學和色譜等分析方法，Wegst和Tittmann［13］在添加 Phe的無機鹽培養基中分離和鑒定出了一種新的代謝產物——二氫化二醇，說明Lactobacillus可以將PLA轉化為二氫化二醇(圖1 C)。此外，利用生物信息學方法對KEGG數據庫分析［14］得出苯乳酸還可以轉化為苯乳酸CoA，而苯乳酸CoA還可以進一步降解為苯基甘氨酸和苯基谷氨酸2種物質(圖1 C)。

圖1 LAB PLA的代謝相關途徑Figure 1 Metabolism related way of LAB PLA

4 LAB PLA代謝的調控研究

環境因素會對PLA的產生造成影響，在相同環境因素下，有些微生物產PLA的能力很強，而主要的合成途徑基因在DNA水平沒變化，這可能與PLA合成過程中存在著各種各樣的調控相關。

4.1 影響PLA代謝過程的因素

4.1.1 溫度和pH值

為了探究溫度對LAB產PLA的影響，李興峰等［8］測定了Lb.sp.SK007在不同溫度下的生長量和PLA產量。結果發現，30℃是Lb.sp.SK007最適生長溫度，PLA產量也最高。25℃菌體生長緩慢，37℃和43℃時菌體生長和PLA合成均受到抑制。相似的實驗結果存在于李遠頌等［1］的研究中，即30℃是LAB菌體生長和PLA合成的最佳溫度。

每種微生物都有適合其生長和代謝物產量的最適pH。李興峰等［15］發現培養基初始 pH在6.0～6.5時，Lb.sp.SK007的PLA產量最佳。王立梅［16］等在研究pH及底物濃度對副干酪乳桿菌(Lb.paracasei)產PLA的影響時，發現相似的實驗結果，即發酵液pH在6.5時PLA產量最高。

4.1.2 培養方式

培養方式是影響發酵轉化的另外一個重要因素。李興峰等［8，15］分別選取靜置發酵和振蕩培養2種方式對Lb.sp.SK007產PLA水平進行研究，發現在實驗室搖瓶條件下，振蕩培養對菌體生長和PLA合成均不利，并且隨著轉速的增加，副產物也隨之增加，說明在振蕩培養條件下，可能是由于底物對氧氣不穩定，部分PPA經脫羧反應產生了苯甲醛;而靜置發酵更適合菌體生長［15］。由此可見，在發酵過程中應該選擇靜置培養，這樣才會避免副產物的產生，為PLA的分離純化減輕壓力，使PLA的產量達到較高水平。

4.2 調控LAB PLA產生的關鍵因素

4.2.1 苯丙酮酸(PPA)和α-酮戊二酸的濃度

李興峰和江波［8］研究了Lb.sp.SK007 PPA的代謝途徑及其對PLA合成的影響，發現在30℃靜止培養情況下，隨著PPA濃度的增加，PLA的產量逐漸增加，達到18.3 mmol/L的頂峰后，PLA的產量逐漸下降，說明PPA的濃度在一定范圍內對PLA的合成具有促進作用。α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途徑的一部分(圖1 A)，所以α-酮戊二酸濃度對PLA的合成有重要影響。Pudik和Lolkema［9］發現增加α-酮戊二酸濃度能顯著提高PLA產量，Phe首先需要與 α-酮戊二酸結合后，才可被氨基轉移酶(ATase)作用;而α-酮戊二酸與Phe的結合需要轉運子CitP的作用。此外，α-酮戊二酸是TCA中的重要代謝終產物之一，所以CitP和TCA對LAB PLA產量應該具有間接調控作用。

4.2.2 乳酸脫氫酶(LDH)

LDH是LAB轉化PPA生成PLA的一種關鍵酶?；蚪M序列分析發現，Lb.plantarum WCFS1具有3個LDH基因，其中1個為 ldhD，另外2個分別為ldhL1 和 ldhL2［17］。Mehemit等［18］分別研究了糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ldhL1和ldhL2的生物學功能，發現在PLA高產菌株中，ldhL1的表達水平也高，而ldhL2基因缺失菌株的PLA產量基本不受影響。相似的結果也出現在賈江花和江波［7］的實驗中:通過E.coli異源表達和純化，發現重組酶D-LDH對底物PPA的活性最高，其次為L1-LDH，而L2-LDH幾乎沒有活力，說明D-LDH和L1-LDH是負責LAB PLA生物合成的主要LDH。

4.2.3 氨基轉移酶(ATase)

Tokuda等［19］指出，ATase 主要作用 Phe，使 Phe轉化為 PPA。以 Lb.sp.SK007為實驗材料，Liu等［20］研究了Phe生成PLA過程，發現在最初的24 h中，Phe減少非常緩慢，并且PLA緩慢增加，檢測不到中間產物PPA;培養72 h后，PLA濃度達到最高，但Phe仍剩余94%，表明只有6%的Phe發生了轉氨反應，而生成的PPA迅速轉化為PLA。因此，由ATase介導的轉氨反應是Phe生成PLA的限速步驟，對PLA從Phe合成途徑具有重要影響。此外，Phe轉化為PPA效率不高的另外一個原因可能是由于該反應具有可逆性造成的。LI等［21］發現用 PPA取代 Phe作為底物，可以顯著提高Lactobacillus PLA的產量，同時發現在PPA到PLA的轉化過程中有少量Phe出現，說明一些PPA在ATase作用下可以轉化為Phe。Chambellon等［22］從 Lactococcus lactis分離出，2 個氨基轉移酶AraT和BcaT，它們分別負責芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的轉氨作用，并且證明araT和bcaT是codY調節子的一部分，由營養因子調控。

4.3 調控LAB PLA產生的其他因素

據報道，Phe不是十分穩定的，易分解為苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸等代謝產物(圖1 B)，并且苯乙酸還可以轉化為苯乙醇［12，19］。由于Phe經轉氨反應生產PPA的低效性［20］，所以由Phe經PPA生成PLA的反應過程應該不是Phe代謝的主要途徑。PLA除了可以由PPA在LDH作用下直接生成外(圖1 A)，還可以經“PPA→苯乙醛→PLA”途徑間接產生(圖1 B)。代謝學研究還發現，苯乙醛可以還原為苯乙醇(圖1 B)。這樣通過苯乙醇這個點就可以將Phe代謝、PPA代謝和PLA合成聯系起來(圖1)，在這個復雜的代謝網絡中，各種化合物相互聯系又相互抑制，因此LAB PLA的產生應該會受到這些化合物濃度的調控。

5 總結與展望

LAB PLA是近年來發現的一種新型食品級安全防腐劑，具有很廣的抑菌譜。目前，關于LAB PLA的研究以抑菌性和生產條件的優化為主，對于PLA的代謝途徑及其調控機制的研究相對較少，且主要集中在核心合成途徑以及核心合成途徑相關酶類對于PLA代謝的影響等方面。

在前期的研究中，我們從云南傳統發酵豆制品——豆豉中分離鑒定了1株益生效果較好的Lb.plantarum YM-5-2。抑菌性研究發現，Lb.plantarum YM-5-2發酵上清液對大腸桿菌(E.coli)O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等主要食源性病原菌具有很好的抑菌效果［23］。利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析發現，Lb.plantarum YM-5-2發酵上清液中的主要化合物是PLA，且在沒有任何發酵條件優化的條件下，PLA的產量高達147.91 mg/L［23］。目前，我們利用焦磷酸測序策略測定了Lb.plantarum YM-5-2的全基因組序列(結果未顯示)，生物信息學分析發現，該菌種具有合成 PLA的關鍵基因(LDH、ATase等)。探討Lb.plantarum YM-5-2高產PLA的分子機制是我們接下來要解決的問題。本文對LAB PLA的生物合成和分解代謝途徑以及與該途徑相關的調控機制做了一個系統性的歸類和總結，不僅可以加深對PLA的代謝途徑及其調控機制的理解，同時也可為食品級PLA的開發和利用提供理論基礎。

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