益生菌發酵糙米飲料的制作工藝及其營養價值研究

陳海旭，趙麗芹，贠婷婷，劉珊，李怡然，楊志清，綦文濤

1(國家糧食局科學研究院，北京，100037)2(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特，010018)

糙米是指除了外殼之外都保留的全谷粒，具有完整生命力，含有豐富的膳食纖維和礦物質［1］。但由于糙米在脫去殼后仍然保留有部分外層組織，故口感較為粗糙，質地緊密，蒸煮費時，口感不如精白米好，所以并不受大眾喜愛。糙米中約64%的營養元素都積聚于種皮和胚芽中［2-3］。但由于人們過度追求大米的“精”與“白”，使得大米在精加工過程中除去種皮，導致大量營養的損失，同時也造成了食物營養資源的極大浪費［4-6］。

本文針對全谷物飲料研究的空白，利用益生菌發酵，通過實驗篩選適宜發酵的菌種及菌種組合，將糙米經過糊化、發酵等工藝制作成發酵糙米飲料。以期為開發既保留糙米中的營養物質，又改善了適口性和滋氣味的健康飲品，同時也為全谷物食品更廣泛的研究與推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

糙米:國家糧食局科學研究院提供;嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、雙歧桿菌、德式乳桿菌、釀酒酵母:國家糧食局科學研究院菌種保藏室保存;干酪乳桿菌:分離于自然發酵的糙米漿。

將實驗菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養基中，37℃培養48 h，連續活化3代后，以2%的接種量接種于脫脂牛奶中，37℃培養48 h進行菌種馴化，離心，清洗后轉移到MRS培養基中待用。

1.2 儀器設備

Foss 2300 Kjeltec全自動蛋白儀、Foss soxtec2050脂肪檢測儀、Foss Fibertec 2010粗纖維測定儀，丹麥FOSS公司;Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent公司;L-8800氨基酸自動分析儀，日立公司;Parr 6300 calorimeter能量儀，美國PARR公司;Horizontal Basis超凈臺，Thermo Scientific;LVDVC型黏度計，美國Brookfield公司;雷磁pHS-25 pH檢測計，上海精密科學儀器有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學研究院生物研究所;DHP-9272電熱恒溫培養箱，上?？萍荚囼炘O備有限公司。

1.3 發酵糙米飲料工藝流程

1.4 檢測方法

1.4.1 乳酸含量測定

使用SBA-40C型乳酸-葡萄糖生物傳感分析儀根據葡萄糖氧化酶固定化膜和氧電極組成的葡萄糖酶電極進行測定，使用乳酸-葡萄糖標準品進行標定后，進樣20 μL，將讀數乘以稀釋倍數即得乳酸含量。

1.4.2 pH值的測定

使用雷磁pHS-25 pH檢測計，經pH標準緩沖液標定后測定，結果取小數點后2位。

1.4.3 水溶性小肽含量的測定［7］

采用液相色譜法測定發酵產品中小肽含量:

(1)色譜條件

色譜柱:TSKgel G2000SWXL 300 mm×7.8 mm凝膠排阻柱;流動相:V(水)∶V(三氟乙酸)=1 000∶1;檢測波長UV215 nm;流速1.0 mL/min;進樣體積10 μL。

(2)樣品制備

吸取各組發酵后產品的上清液5 mL，12 000 r/min離心 60 s，吸取 1 mL離心后的上清液，過0.45 μm的水系膜后，濾液放入樣品瓶中上機待測。

1.4.4 氨基酸含量的測定［8］

采用日立L-8800氨基酸自動分析儀分析發酵產品中小肽含量變化情況，具體包括以下步驟:

(1)實驗試劑的配制

按照儀器要求配制標準分析用 B1、B2、B3、B4、B5洗脫溶液、茚三酮試劑和茚三酮緩沖溶液。泵1(洗脫溶液)流速:0.40 mL/min;泵2流速:0.35 mL/min;分析柱溫度:57℃;反應器溫度:135℃;進樣體積:20 μL。洗脫溶液、茚三酮試劑和茚三酮緩沖溶液配制方法如下:

茚三酮試劑:稱取39 g茚三酮，溶于979 mL乙二醇甲醚中，過0.45 μm有機系微孔濾膜。

茚三酮緩沖液:稱取無水醋酸鈉204 g，冰醋酸123 mL，乙二醇甲醚401 mL，加超純水溶解后，定容至1 L，過0.45 μm有機系微孔濾膜。

洗脫溶液試劑B1 B2 B3 B4 B5超純水/mL 700 700 700 700 700檸檬酸三鈉/g 6.19 7.74 13.31 26.67 -NaCl/g 5.66 7.07 3.74 54.35 -檸檬酸/g 19.80 22.00 12.80 6.10 -無水乙醇/mL 135.0 25.0 9.0 - 100.0 NaOH/g - - - - 8.00定容/L 1 1 1 1 1

(2)標準品的配制

取AAS-18氨基酸標準品(Sigma)1 mL，用0.1 mol/L的 HCl溶液稀釋至 25 mL，移取此稀釋液1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，濾液入樣品瓶中上機待測。

(3)樣品的制備

稱取蛋白質含量為7.5～25 mg的試樣加6 mol/L HCl 15 mL，吹氮氣封口后于110℃恒溫箱中酸解22 h后，吸取200 μL酸解液加入樣品瓶中，氮氣吹干，然后加入200 μL去離子水用氮氣吹干，重復此步驟3遍后，加入1.5 mL檸檬酸鈉緩沖液并過0.45 μm濾膜后上機待測。

1.4.5 粗蛋白含量的測定

使用Foss 2300 Kjeltec凱式定氮儀，根據GB/T 14489.2-2008的標準，準確量取3 mL發酵后的樣品，加入15 mL濃H2SO4及2片消化片，420℃消化至液體變為透明藍色后冷卻至室溫上機測定。

1.4.6 粗脂肪含量的測定

使用 Foss soxtec2050脂肪檢測儀，根據 GB/T 5512-2008的標準，準確稱取5 g左右的烘干后的發酵樣品，加入20 mL丙酮，上機設置循環溫度后，進行測定。

1.4.7 能量的測定

使用Parr 6300 calorimeter能量儀，稱取1.00 g左右的樣品，放入儀器特制的燃燒盒中，使用壓片器將樣品壓實，放入引線后上機進行測定。

1.4.8 碳水化合物的測定

碳水化合物/%=［100%-(蛋白質含量+脂肪含量+水分含量+灰分含量+膳食纖維含量)］×100

1.4.9 膳食纖維的測定

根據GB/T 5009.88-2008的方法進行檢測。

1.4.10 活菌數的測定

按照確定的工藝參數制備飲料，對發酵后的最終產品做活菌計數，采用 MRS瓊脂培養基，37℃培養24～48 h，每組發酵產品平行測定3次，計算活菌數目的平均值，結果以CFU/mL計。

1.5 操作要點

清洗:將糙米去雜后，放入濃度為1%的NaClO2溶液中浸泡5 min后用蒸餾水沖洗干凈，對糙米進行初步的清洗消毒。

粉碎:將糙米用粉碎機粉碎至過30目篩。

糊化:按料液比1∶10的比例105℃糊化20 min。

均質:使用高壓均質機在30 MPa的壓力均質一次。

灌裝、滅菌:將料液分裝入500 mL的Schott瓶中，121℃滅菌 15 min。

接種:在微生物潔凈工作臺內，將冷卻分裝后的料液按照一定比例接入預處理過的種子液。

發酵:在恒溫培養箱內，37℃發酵12 h。

調配:在微生物潔凈工作臺內，向產品中加入一定比例的蜂蜜。

1.6 數據處理

本文最終數據均來自于3次發酵實驗的樣品平行測定3次，所得實驗數據采用Excel軟件進行處理，用平均值±標準差 的形式表示，并通過單向方差和t檢驗進行顯著性統計分析，其中P＜0.05認為數據之間具有顯著性差異(*);P＜0.01認為數據之間差異極顯著(＊＊)，n為實驗次數。

2 結果與討論

2.1 發酵菌種的選擇

圖1為6種不同益生菌菌株的初步糙米發酵結果。由圖1可以看出，不同菌種發酵后產品中的乳酸含量有一定差異。其中干酪乳桿菌、唾液乳桿菌和雙歧桿菌發酵后產品的乳酸含量均在15 mmol/L以上，其次為嗜酸乳桿菌，含量為13.83 mmol/L，而德式乳桿菌和釀酒酵母的乳酸含量較低，分別為9 mmol/L和7.5 mmol/L。在相同發酵條件下，德式乳桿菌和釀酒酵母的產乳酸能力明顯低于其他4株菌種。同時由此圖可以看出，發酵可以顯著降低產品的pH值。6株菌種發酵后的pH值都比對照組(pH 6.5)低，其中德式乳桿菌和釀酒酵母的pH值為6株菌中最高的，分別為5.87和5.48，而嗜酸乳桿菌和唾液乳桿菌的發酵最終酸度是6株菌中最低的，分別為4.67和4.68，說明這2種菌對酸度具有更高的耐受性，能夠更好地利用糙米中的營養物質在低pH環境下產生代謝產物。而干酪乳桿菌和雙歧桿菌的pH值分別為5.04和4.94。市售的發酵飲品中，無論是發酵乳制品還是發酵米酒等制品，其發酵的最終pH值大約都在3.9～4.2之間［9］，因此，單一菌種發酵后產品的乳酸含量較低，pH值較高，且無法達到豐富濃郁的口感。鑒于干酪乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌和雙歧桿菌的發酵效果要明顯好于德式乳桿菌和釀酒酵母，本文接下來研究將選用這4株菌種進行混合復配發酵試驗，以篩選出發酵效果最好的菌種組合。

2.2 最佳發酵菌種組合的選擇

圖1 單一菌株發酵后的乳酸含量及pH值Fig.1 The content of lactic acid and pH after single strain fermentation

復配菌種發酵后的乳酸含量及pH值如圖2所示。由圖2可見，在乳酸產量和pH值變化方面混菌發酵效果明顯較單菌發酵好，且3種菌混合發酵組合的平均乳酸含量顯著高于雙菌混合發酵結果，乳酸最高的組合B+SS+SQQ組，其含量高達42.6 mmol/L，高濃度的乳酸含量賦予了產品濃郁的發酵風味。與此同時，雙菌發酵的pH值較3種菌發酵的pH值偏高，在相同培養時間內pH值降低速率更慢。而發酵12 h后的3種菌復配發酵產品的pH值已經顯著降低，并達到與市售發酵制品(pH=3.92)相當的pH值，充分說明3種菌復配的發酵效果的要好于雙菌復配發酵。因此，本文進一步深入分析了復配發酵糙米飲料的營養價值和工藝參數。

圖2 復配菌株發酵后乳酸、pH值含量圖Fig.2 The content of lactic acid and pH of mixing strain fermentation

2.3 復配菌種發酵后的氨基酸及小肽含量變化分析

本文采用歸一化法進一步分析了復配菌種發酵后的糙米飲品中水溶性肽的含量情況，由圖3可以看出，發酵后的各組在分子質量1 800～10 000Da的水溶性多肽的峰面積明顯大于未發酵的對照組，可以說明發酵后糙米食品中的多肽和小分子蛋白質含量有所增多。

表1顯示了各發酵菌種組合在此分子質量區間的面積相比于未發酵的對照組的增長率平均達到400%左右，即為對照組的4倍左右，其中組合B+SS+SQQ組的增長率最高，達到了對照組的4.3倍。而分子質量在600～1 800Da區間內的小肽的峰面積中，發酵組也高于對照組，且增加率更是平均高達961%之多。充分說明發酵過程對水溶性肽類物質的增加起到了重要的作用。

表1 不同菌種組合發酵前后水溶性肽類物質面積增長率Table 1 The growth area rate of water-soluble peptides after mixing strain fermentation

圖3 不同菌種復配發酵后的水溶性肽變化圖Fig.3 The graph of water soluble peptide after fermentation by mixing strain

表2為4組3種菌混合復配發酵后的糙米飲料中的總氨基酸及主要氨基酸含量的變化情況。由表2可見，在總氨基酸含量上，組合干酪乳桿菌+嗜酸乳桿菌+雙歧桿菌的總氨基酸量(1 179 mg/100g)較對照組氨基酸總量(930 mg/100 g)增長了26.74%，為4個菌種組合中總氨基酸含量增加最多的一組，該組合發酵后的產品中，使用酸水解法可以檢測出的7種人體必需氨基酸全部高于未發酵對照組，平均增加率為39.97%，而參與蛋白質合成的人體必需氨基酸——蛋氨酸的增加率更是高達73%。由于人體內不能合成必需氨基酸而只能通過食物獲取，因此必需氨基酸的增加有利于提高其在人體中的吸收率，促進人體的健康發展。在該發酵組合的產品中，除胱氨酸和甘氨酸外，發酵后產品中的非必需氨基酸含量全部高于未發酵對照組，平均增加率為25.64%。

表2 復配菌株發酵前后產品氨基酸含量 mg/100gTable 2 The amino acid content on mixing strain fermentation mg/100g

通過乳酸、pH值、氨基酸含量、水溶性肽含量的綜合比較和分析，發現嗜酸乳桿菌+干酪乳桿菌+雙歧桿菌組合發酵后的氨基酸、水溶性小肽含量高于其他3個菌種組合，符合當代人對食物的選擇標準:既味美價廉又低脂、高纖維、高營養，故最終選擇該組合為發酵糙米飲料的復配菌種組合。因此，本文進一步對該菌株復配組合發酵糙米的工藝進行了優化研究。

2.4 發酵糙米飲料制作工藝參數的確定

2.4.1 料水比的確定

料水比不同，發酵后產品的黏度有顯著差異，如圖4所示。其中，料水比50∶1 000組的黏度過低，靜置30 min后產品上下分層嚴重，難以形成穩定的懸浮體系;料水比為100∶1 000的發酵產品的黏度為24.87 mPa·s，與市售谷物飲料黏度(20.88 mPa·s)相比略高，其發酵后無明顯分層，有較強的流動性。料水比150∶1 000組的黏度為34.29 mPa·s，明顯高于市售對照組，發酵后產品無明顯分層，但流動性要低于100∶1 000組。而料水比200∶1 000組的產品基本無流動性，其黏度更是高達98.05 mPa·s，流動性較差，不適宜用此比例制作飲料。從節約原材料的成本角度考慮，選擇料水比為100∶1 000進行發酵產品的開發更合適。

圖4 料水比對產品黏度的影響Fig.4 Effect of viscosity in different water mixture fermented products

2.4.2 發酵時間的確定

發酵時間的長短會直接影響產品的乳酸含量和風味，發酵時間短，產酸量不足，發酵氣息不足，達不到合適的感官體驗;發酵時間長，產酸過多且容易產生刺激性酸味，pH值過低，而且發酵周期長，會使發酵成本增加。由圖5可以看出，發酵時間的長短對產品的乳酸含量和pH值具有一定影響。隨著時間的延長，產品內富集的乳酸含量逐漸增多，發酵24 h左右，產品的乳酸含量為26.75 mmol/L，此時乳酸增加最快，增幅達到52%。同時，pH值在此時間段內下降最快，由4.45下降至4.18。該時間段的產品已具有濃郁的發酵氣息，滋味偏酸，呈淺乳白色。當發酵至36h時，乳酸含量為52.17 mmol/L，pH值為3.99，此時產品的發酵氣味偏酸，口感較酸，且帶有一定的澀味。由此可見，單純追求發酵時間并不一定能夠提升產品的發酵口感。

圖5 發酵時間對產品的影響Fig.5 Effect of lactic acid and pH after different fermented time

2.4.3 接種量的確定

隨著接種量的增大，產品的乳酸含量呈現逐步上升的趨勢，而pH值呈現下降的趨勢。這主要是由于，隨著接種量的增加，起始發酵液中的乳酸菌活菌數隨之增加，產酸能力強，乳酸含量上升較快，pH值下降也較快，而隨著接種量繼續增大，產酸過多，pH值過低，反而抑制了菌體的活性，導致乳酸的增長速度放緩，另一方面也許是由于菌種數目過多，相互競爭加大，對營養物質的競爭導致菌體生長活性降低。例如圖6中，接種量為5%的乳酸含量較4%的接種量的乳酸含量增加了18 mmol/L，pH值降低了0.3，而接種量6%的乳酸含量較接種量5%的乳酸含量僅增長了4.2 mmol/L，pH值僅降低了0.05，基本無變化。這一結果與潘廷跳等［10］在制作攪拌型燕麥酸奶中的結果相似。他們發現在一定的范圍內，隨著乳酸菌接種量的增大，感官評定的分數就越高，而達到頂峰之后，分數又減小。他認為接種量過低時，在一定的時間內乳酸菌的繁殖生長能力有限，不能充分發酵而導致發酵不完全;而接種量過高時，在較短一段時間內產生較多的乳酸，導致酸度過大。所以5%左右的接種量最為適合發酵糙米飲料。

2.5 正交分析

根據單因素試驗結果，以料水比、發酵時間、接種量，選取發酵后產品的乳酸含量作為評價指標，采用L9(34)正交設計對工藝條件進行優化。因素水平見表3，結果見表4。

圖6 接種量對發酵產品的影響Fig.6 Effect of lactic acid and pH on different inoculation

表3 發酵糙米飲料工藝正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment on fermentation of brown rice beverage

表4 發酵糙米飲料工藝正交試驗結果Table 4 The result of orthogonal experiment on fermentation factors of brown rice beverage

由表4看出，影響發酵后產品的乳酸含量的因素主次順序為:料水比＞接種量＞發酵時間，按各因素水平應選擇組合A2B3C3作為最佳發酵組合，即接種量5%，料水比為120∶1000，發酵時間為16 h。3號(A1B2C3)、4號組合(A2B1C2)的乳酸含量最高，為了得到最佳發酵組合，將這2個組合與極差分析得到的組合N(A2B3C3)做發酵重復試驗。結果見表7。

表5 發酵糙米飲料最佳工藝參數重復試驗Table 5 Result of repeated test on fermentation factors of brown rice beverage

2.6 發酵產品營養成分的對比

對發酵后的糙米飲料立即進行營養成分及活菌數的測定，通過糙米飲料發酵前后的營養數據對比可以看出，發酵后的產品蛋白質有所提高，脂肪、碳水化合物、能量及膳食纖維含量有所下降，如表6所示。碳水化合物的下降是由于發酵過程中乳酸菌的生長代謝對碳水化合物的利用所導致的，膳食纖維和脂肪含量的下降來源于加工過程中高溫條件對其的破壞。而發酵的糙米飲料與市售飲料對比可以看出，蛋白質含量較谷物飲料略顯不足，但高出乳酸菌飲料。脂肪含量雖然高于乳酸菌飲料但遠遠低于谷物飲料中的脂肪含量。碳水化合物和能量的含量均低于市售飲料，發酵糙米飲料呈現為低能量的狀態。反觀膳食纖維含量，發酵糙米飲料的膳食纖維含量是市售谷物飲料的3.2倍，在每天正常飲食范圍內再多補充300mL發酵糙米飲料大約便可滿足成人膳食纖維的日平均攝入量。同時，發酵糙米飲料與市售乳酸菌飲料相比含有更多的活菌數目，又由3種益生菌復配發酵而成，菌種種類多，活性好，更有助于人體腸道菌群的平衡，保持腸胃年輕。

表6 發酵糙米飲料與市售飲料的營養成分對比Table 6 Comparison of nutrients between fermented brown rice beverage and market sale beverages

3 結論與討論

三菌復配混合發酵較單菌和雙菌混合發酵更利于健康、營養、美味全谷物糙米飲料的開發。單因素和正交試驗表明嗜酸乳桿菌+干酪乳桿菌+雙歧桿菌組合發酵糙米的最佳工藝為:接種量為5%，料水比為120∶1 000，于37℃發酵16 h，所得的發酵產品的風味濃郁清香，有較適宜的酸度，口感醇厚。與市售谷物飲料和乳酸菌飲料進行營養成分分析對比，最佳菌種組合和工藝條件下發酵糙米飲料的蛋白質、膳食纖維含量均高于市售飲料，而脂肪、碳水化合物、能量含量低于市售飲料，產品的營養全面、均衡，適宜現代人對營養的需求，活菌數更是達到1.2×108cfu/mL，是一種具有很好開發潛力的營養全面、風味獨特、健康的全谷物飲品。

［1］ 劉月好，任力民.糙米的營養價值及在食品中的應用［J］.糧食加工，2004，10(2):18-20.

［2］ 陳志剛.糙米的營養成分及其在發芽過程中的變化［J］.南京農業大學學報，2003，26(3):84-87.

［3］ 黃迪芳.糙米萌發工藝及發芽糙米功能飲料的研究［D］.無錫:江南大學，2005.

［4］ 單斌.雙酶法優化復合碎米-糙米乳飲料工藝條件［J］.食品與機械，2011，12(6):69-71.

［5］ 胡秀娟.酶對發芽糙米皮層結構影響的研究［J］.糧食與飼料工業，2012，3(8):30-32.

［6］ 駱超超.幾種益生菌發酵谷物飲料制作工藝研究［J］.東北農業大學學報，2011，42(5):127-129.

［7］ 李冰冰.發芽糙米與稻谷的谷氨酸脫羧酶活力及 γ-氨基丁酸含量比較［J］.食品與發酵工業，2006，32(5):28-30.

［8］ 顧振新.發芽糙米制備工藝研究［J］.食品工業科技，2004，25(1):70-72.

［9］ 吳澎，田紀春，王鳳成.谷物中植酸及其應用的研究進展［J］.中國糧油學報，2009，24(3):137-143.

［10］ 潘廷跳，龐杰，劉福林.攪拌型燕麥酸奶的研制［J］.中國乳品工業，2010(12):16-18.