雙低菜籽粕混菌固態發酵條件的優化

肖 萌,王遠亮

(湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙，410128)

雙低菜籽粕混菌固態發酵條件的優化

肖 萌,王遠亮

(湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙，410128)

【目的】 利用納豆芽孢桿菌和短乳桿菌對雙低菜籽粕進行混菌固態發酵，優化發酵條件，提高雙低菜籽粕的飼用品質?！痉椒ā?利用納豆芽孢桿菌和乳酸菌對雙低菜籽粕進行固態發酵(先接入納豆芽孢桿菌再接入短乳桿菌)，以發酵產物中的納豆激酶活力常用對數值與三氯乙酸可溶性氮含量構成的綜合評分為評價指標，通過單因素試驗考查接種量、溫度及料(g)水(mL)比對發酵效果的影響。選擇接種量、溫度及料水比為影響因子，根據box-benhnken的中心組合試驗設計原理采用三因素三水平的響應面分析篩選雙低菜籽粕的最優發酵工藝?！窘Y果】 單因素試驗得出最優接種量為每100 g 1.5 mL，最優的發酵溫度為37 ℃，最優的料(g)水(mL)比為1∶1。響應面分析法確定的雙低菜籽粕最佳發酵條件為接種量每100 g 1.5 mL，發酵溫度37 ℃，料(g)水(mL)比1∶1.05，在該條件下發酵96 h后發酵產物的綜合評分為4.57?！窘Y論】 經優化的混菌固態發酵工藝對發酵后菜籽粕品質的綜合提升具有良好效果。

雙低菜籽粕；混菌；固態發酵；納豆激酶；三氯乙酸可溶性氮

菜籽粕(Rapeseed meal，RSM)是我國豐富的植物源蛋白之一，其蛋白質含量高，氨基酸組成合理、含量豐富且符合聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)推薦的氨基酸模式標準，營養價值可媲美大豆蛋白[1-2]。因此菜籽粕應成為良好的蛋白質飼料，但實際情況并非如此，主要原因一是菜籽粕中的蛋白質吸收率較低；二是非雙低(低芥酸、低硫甙)菜籽餅粕中含有較高的毒性物質，大多被作為有機肥料使用[3]。雙低菜籽粕芥酸、硫甙的含量較低，不僅保留了油菜餅粕高蛋白的特點，又有粗纖維含量低且殼薄等優點[4]。然而，作為飼料的雙低菜籽粕與豆粕、魚粉等高品質的蛋白飼料相比，其營養價值仍有較大的不足。研究表明，微生物發酵不僅可有效降解菜籽粕中的抗營養因子[5]，而且微生物所產生的蛋白酶亦可將菜籽蛋白進一步降解為小肽[6-7]。利用微生物發酵法改善雙低菜籽粕的飼用品質已成為現今研究的熱點之一。

納豆芽孢桿菌和乳酸菌均為我國《飼料添加劑品種目錄》允許添加的飼用微生物，其中納豆芽孢桿菌對人和單胃動物的腸道益生功能明顯[8]，而乳酸菌也因其能在發酵過程中大量分泌乳酸，降低氨態氮含量，提高飼料轉化率而被廣泛應用于畜禽日糧中[9]。本試驗擬采用納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)和短乳桿菌M8(LactobacillusbrevisM8)對雙低菜籽粕進行混菌發酵，以發酵后菜籽粕中酸溶蛋白含量和納豆激酶活力為指標，利用單因素試驗、中心組合試驗及響應面分析法對發酵條件進行優化，旨在為微生物發酵法生產高品質菜籽粕飼料提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要原料與試劑 雙低菜籽粕由湖南盈成油脂工業有限公司提供，其硫甙含量為29.9 μmol/g，粗蛋白含量38.9%，水分含量11.8%，將其粉碎過孔徑0.37 mm的篩備用；尿激酶(BR，500 U/mg)、凝血酶(10 U/mg)，購自北京鼎國生物制品有限責任公司；牛血纖維蛋白原(Fibrinogen，Sigma F-8630)，北京拜爾迪生物公司；其他試劑均為市售分析純級試劑。

1.1.2 菌 種 納豆芽孢桿菌和短乳桿菌M8，均由湖南農業大學食品科技學院食品微生物資源研究室保存。

1.1.3 培養基 營養肉湯培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18 g，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL；MRS培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母提取物4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，四水合硫酸錳0.05 g，瓊脂15 g，pH 6.2～6.8，蒸餾水1 000 mL；種子培養基為上述營養肉湯培養基及MRS培養基去除瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株制備 將保存于冰箱中的納豆芽孢桿菌和短乳桿菌M8斜面菌種接種于新鮮斜面培養基上，37 ℃恒溫培養24 h后將斜面菌種分別接入液體培養基中擴大培養，納豆芽孢桿菌接種于營養肉湯培養基中，37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養16 h；短乳桿菌接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養18 h。

1.2.2 發酵種子液的制備 將擴大培養好的2種菌液以體積分數0.5%的接種量分別接種到各菌的發酵種子培養液中培養, 當細菌密度達到108CFU/mL時即可作為發酵種子液。

1.2.3 雙低菜籽粕的混菌固態發酵培養 取雙低菜籽粕，按一定料水比裝入三角瓶中，攪拌均勻后塞緊棉塞并裹牛皮紙封口，121 ℃條件下滅菌20 min，出鍋后冷卻打散；在無菌操作下先接入納豆芽孢桿菌恒溫發酵48 h，再接入短乳桿菌M8發酵至96 h，發酵過程中需定時翻料。待發酵完畢后首先取出干質量5 g的樣品，立即測其納豆激酶酶活，余下的發酵雙低菜籽粕經冷凍干燥后粉碎, 過孔徑0.25 mm的篩，取篩后干質量2 g的樣品測其三氯乙酸可溶性氮含量。

1.3 發酵工藝優化評價指標的測定方法

1.3.1 發酵工藝優化評價指標的確定 發酵菜籽粕中小分子肽含量反映了納豆芽孢桿菌和短乳桿菌在菜籽粕中的協同生長情況，而納豆激酶酶活則更直接地反映了納豆芽孢桿菌在菜籽粕中生長的情況，故本研究選取三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)含量與納豆激酶酶活為指標考察發酵雙低菜籽粕的飼用品質。三氯乙酸是一種強脫水變性劑，當其濃度達到1.0 mol/L時,大多數大分子蛋白質和多肽會變性沉淀，故TCA-NSI含量能在一定程度上反映蛋白質降解過程中小分子肽的含量。在發酵過程中，由于納豆激酶的酶活力與TCA-NSI含量因納豆芽孢桿菌和短乳桿菌的交互作用而呈現動態的變化，故以提升動物對營養物質的吸收利用為主要目的，同時考慮發酵后菜籽粕對動物的保健功能，采用綜合評分來確定較好的發酵工藝。雙低菜籽粕固態發酵綜合評分=TCA-NSI含量×70%+納豆激酶酶活的常用對數值×30%。

1.3.2 TCA-NSI含量的測定 參照文獻[10]的方法操作。

1.3.3 納豆激酶活力 (1)尿激酶標準曲線的制作。參照Astrup等[11]的方法并做適當改進進行試驗。尿激酶用PBS(pH 7.8)緩沖液配制成1 000 U/mL標準品溶液，稀釋成100，200，300，400和500 U/mL的濃度梯度，然后取各梯度的尿激酶標準溶液10 μL點樣于瓊脂糖-纖維蛋白平板[12]上，37 ℃孵育18 h后測量透明纖溶圈2條垂直直徑并計算其面積。以尿激酶活力的常用對數為橫坐標(X)，以透明纖溶圈面積的常用對數值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。每組數據均平行測定3次。

(2)納豆激酶粗酶液活力的測定。取2 g發酵后的雙低菜籽粕，加12 mL PBS液(pH 7.8)混合均勻，4 ℃浸提4 h，4 ℃下5 000 r/min離心15 min，重復2次，上清液即為納豆激酶粗酶液。取10 μL粗酶液點樣在纖維蛋白平板上，置于37 ℃恒溫箱內孵育18 h后取出，測定纖維蛋白平板上的透明纖溶圈的垂直直徑并計算其面積，利用標準曲線求得納豆激酶粗酶液活力。

1.4 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件優化的單因素試驗

1.4.1 接種量的確定 在雙低菜籽粕中，按照1∶0.8的料(g)水(mL)比(下文簡稱料水比)加水攪拌均勻，經高壓滅菌后制成雙低菜籽粕培養基。分別吸取納豆芽孢桿菌種子液0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL接種到100 g雙低菜籽粕培養基上，發酵48 h后再接入與納豆芽孢桿菌種子液體積相同的短乳桿菌M8種子液發酵至96 h，發酵完畢后測定納豆激酶活力和TCA-NSI含量,并考察其綜合評分。

1.4.2 發酵溫度的確定 取1.4.1節制備的雙低菜籽粕培養基，按照100 g培養基接種1.0 mL納豆芽孢桿菌種子液的比例接菌，發酵48 h后再接入與納豆芽孢桿菌種子液體積相同的短乳桿菌M8種子液發酵至96 h，發酵溫度分別設定為28，31，34，37和40 ℃，發酵完畢測定納豆激酶活力和TCA-NSI含量,并考察其綜合評分。

1.4.3 料水比的確定 按照料水比分別為1∶0.6，1∶0.8，1∶1，1∶1.2和1∶1.4的比例向雙低菜籽粕內加水并攪拌均勻，高壓滅菌后制成雙低菜籽粕培養基。取不同料水比雙低菜籽粕培養基，按照100 g培養基接種1.0 mL納豆芽孢桿菌種子液的比例接菌，發酵48 h后再接入與納豆芽孢桿菌種子液體積相同的短乳桿菌M8種子液發酵至96 h，發酵溫度37 ℃。發酵完畢測定納豆激酶活力和TCA-NSI含量，并考察其綜合評分。

1.5 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件的響應面法優化

選取料水比、發酵溫度、接種量3個因素作為試驗因子，以發酵后雙低菜籽粕的綜合評分為響應值，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的Box-behnken(BBD)中心組合試驗設計原理設計3因素3水平的響應面分析試驗，篩選雙低菜籽粕最佳混菌固態發酵條件，并進行驗證試驗。試驗因素及水平見表1。

表1 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件優化的試驗設計因素水平及編碼Table 1 Design of experiment factors and codes of experiment on double-low rapeseed meal by mixed solid culturing

1.6 數據分析方法

運用Excel以及PASW Statistics Base 18 軟件對試驗數據進行統計分析，每組試驗做3次重復。

2 結果與分析

2.1 尿激酶標準曲線的制作

以尿激酶活力單位的常用對數值為橫軸(X)，透明圈面積的常用對數值為縱軸(Y)，繪制標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，尿激酶標準曲線為：Y=1.01X+1.998 5，R2=0.999 5，說明曲線可信度較高，可以用于納豆激酶酶活的測定。

2.2 雙低菜籽粕混菌固態發酵單因素試驗結果

2.2.1 接種量對發酵菜籽粕的影響 適宜的接種量可以縮短菌種生長的延長期，使得納豆激酶提前合成和分泌；接種量過大會導致培養基的營養物質過快消耗且副代謝產物可能會影響酶系的合成與大分子蛋白的降解。由圖2可知，隨著接種量的增加，納豆激酶活力、TCA-NSI含量及綜合評分均增大，當接種量為每100 g 1.5 mL時，3個指標均達到最高值，隨著接種量的繼續增加，納豆激酶活力、TCA-NSI含量和綜合評分呈現下降的趨勢。因此接種量以每100 g 1.5 mL為宜。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 Calibration curve of urokinase

圖2 接種量對雙低菜籽粕納豆激酶活力、TCA-NSI含量和綜合評分的影響
Fig.2 Effect of inoculums volume on common logarithm of nattokinase activity,TCA-NSI content and comprehensive grade of double-low rapeseed meal

2.2.2 發酵溫度對發酵菜籽粕的影響 每種菌都有其最適生長溫度，而每種酶系都有其最適合的反應溫度，若要發揮各菌的優勢發酵溫度很關鍵。由圖3可知，在28～37 ℃，隨著溫度的升高，納豆激酶活力、TCA-NSI含量及綜合評分均增大，37 ℃之后3個指標均下降；溫度對TCA-NSI含量的影響較其對納豆激酶活力的影響大，這是因為TCA-NSI的含量取決于納豆芽孢桿菌和短乳桿菌2種益生菌的綜合作用，而在較高溫度下短乳桿菌的生長會受到影響。故發酵溫度以37 ℃為宜。

2.2.3 料水比對發酵菜籽粕的影響 水是細菌進行生命活動不可缺少的物質，若基質含水量過低，培養基中營養物質便不能得到充分溶解而影響微生物對其的吸收利用。

由圖4可見，在料水比為1∶0.6～1∶1的階段，隨著含水量的增加TCA-NSI含量、納豆激酶活力和綜合評分3個指標均呈遞增趨勢。當料水比超過1∶1后，納豆激酶活力、TCA-NSI含量和綜合評分均下降，這是因為此時基質含水量過高，導致培養基孔隙率降低而造成缺氧，影響微生物的生長代謝，進而影響酶活及蛋白質降解。故料水比確定為1∶1。

圖3 發酵溫度對雙低菜籽粕納豆激酶活力、TCA-NSI含量和綜合評分的影響Fig.3 Effect of temperature on common logarithm of nattokinase activity,TCA-NSI content and comprehensive grade of double-low rapeseed meal

圖4 料(g)水(mL)比對雙低菜籽粕納豆激酶活力、TCA-NSI含量和綜合評分的影響Fig.4 Effect of solid-water ratio on common logarithm of nattokinase activity,TCA-NSI content and comprehensive grade of double-low rapeseed-meal

2.3 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件的響應面優化試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及其分析 雙低菜籽粕發酵綜合評分的響應面試驗結果見表2。采用Design-Expert 8.0.5軟件中的box-behnken(BBD)對試驗結果進行響應面分析，得到回歸模型方差分析表，結果如表3和表4所示。由表3可知，模型的一次項C影響極顯著，交互項AC、BC影響顯著，各二次項影響均極顯著。各因素的貢獻率為C>A>B，即料水比>接種量>發酵溫度。

表2 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件優化試驗的Box-Benhnken響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken central composite design and results of response surface analysis on experiment of double-low rapeseed meal by mixed solid culturing

表3 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件優化試驗的響應面方差分析結果Table 3 Analysis of variance of response surface results on experiment of double-low rapeseed meal by mixed solid culturing

注：**表示統計結果差異顯著(P<0.05)，**表示統計結果差異極顯著(P<0.01)。A.接種量，B.溫度，C.料(g)水(mL)比。

Note:* means significant (P<0.05),** means extremely significant (P<0.01).A.Inoculums volume,B.Temperature,C.Solid-water ratio.

表4 雙低菜籽粕混菌固態發酵條件優化試驗的二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic model on experiment of double-low rapeseed meal by mixed solid culturing

通過多元回歸擬合分析得到綜合評分與各變量(接種量、發酵溫度、料水比)的二次回歸方程模型為:

綜合評分=4.55+0.098A-0.030B+0.314C-0.070AB-0.19AC-0.11BC-0.93A2-0.63B2-0.58C2。

對上述模型方程的方差分析表明，本試驗所選用模型高度顯著(P<0.000 1)。由表4可知，回歸方程因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.994 5，說明此模型能解釋99.45%響應值變化；變異系數(Coefficient variability，CV)較低(2.30%)，說明試驗重復性較好。根據方差分析(表3)可知，失擬項不顯著(P=0.304 5>0.1)，說明方程對試驗結果的擬合度較好，數據中沒有異常點，模型適當，分析結果可靠。

2.3.2 響應曲面優化分析 采用Design Expert 8.0.5軟件對回歸模型進行規范分析，根據回歸方程，接種量、發酵溫度、料水比3個因素交互影響發酵菜籽粕綜合評分的響應曲面和等高線如圖5～7所示。

圖5 接種量與發酵溫度對發酵雙低菜籽粕綜合評分的交互影響

圖6 接種量與料(g)水(mL)比對發酵雙低菜籽粕綜合評分的交互影響

通過二次多項回歸方程所作響應曲面圖及其等高線圖，可以直觀地反映出發酵條件對菜籽粕綜合評分的影響，等高線圖還可揭示出各因素之間交互作用的顯著性。由圖5可以看出，綜合評分隨著接種量的增加先上升后下降，隨發酵溫度的升高，亦先上升后逐漸下降，說明接種量和發酵溫度存在顯著的交互作用。由圖6可以看出，隨著料水比和接種量的增加，綜合評分呈先迅速上升后下降的趨勢，但料水比較高時，綜合評分較接種量的增加下降明顯，二者交互作用形成的曲面為拋物面，說明料水比和接種量之間存在交互作用。由圖7可以看出，當發酵溫度較低時，綜合評分隨著發酵溫度的升高而升高，而發酵溫度超過37 ℃時綜合評分迅速下降；綜合評分隨料水比的增加而升高，在料水比為1.10時有所下降。這說明發酵溫度和料水比對綜合評分有顯著的影響。綜上可以看出，接種量(A)、發酵溫度(B)和料水比(C)存在極值點，通過該組動態圖即可確定各個因素的最佳水平范圍。根據Design-Expert 8.0.5軟件對試驗結果進行最優化分析，確定最佳的發酵條件為：每100 g接種量為1.51 mL，發酵溫度36.85 ℃,料水比為1∶1.05，在此條件下預測發酵雙低菜籽粕的綜合評分為4.59。

圖7 發酵溫度與料(g)水(mL)比對發酵雙低菜籽粕綜合評分的交互影響

2.3.3 模型的驗證試驗 采用模型預測最佳優化條件，考慮到實際生產操作，將最佳工藝條件修正為每100 g接種量1.5 mL、發酵溫度37 ℃、料水比1∶1.05，在該條件下進行雙低菜籽粕的發酵試驗，重復3次，各次的綜合評分分別為4.52，4.61和4.55，平均為4.57，與理論預測值的相對誤差約為0.438%。說明構建的模型對益生菌混合發酵雙低菜籽粕的綜合評分做出了很好的預測。

3 討 論

自1987年日本生理學教授須見洋行從納豆中發現納豆激酶以來，該酶因特殊的溶栓作用、較高的安全性、在體內作用持續時間長、激活體內的RtPA能持續溫和地提高血液的纖溶活性等特點[13-14]而越來越受到人們的重視。董緒燕等[15]利用枯草芽孢桿菌發酵菜籽粕，在優化發酵條件后不僅產生與納豆激酶功能相當的溶栓酶，還完全降解了菜籽餅粕中的有毒物質；廖杰瓊等[16]以菜籽粕與麩皮為基質固態37 ℃發酵48 h后，納豆激酶活力為基礎發酵培養基的1.73倍。與此同時，利用單一菌株或多菌株對菜籽粕進行混合發酵以改良菜籽粕品質的研究也屢見不鮮，王永紅等[17]通過混菌發酵方式使菜籽粕蛋白水解度達到12.1%；吳逸飛等[18]用響應面結合主成分分析優化菜籽粕發酵工藝后，使得菜籽小分子蛋白得率高達16.51%。有研究證明，利用發酵法提高菜籽粕的小肽含量不僅在畜禽日糧生產中具有至關重要的作用，在當今的醫藥和食品領域中也有重要意義[19]。然而現今國內外的研究中鮮有結合納豆激酶活力和菜籽小分子蛋白含量指標進行發酵雙低菜籽粕營養品質綜合評價的研究。本試驗采用混菌先后接種的發酵方式，以綜合評分為考察指標，探討同時得到高酶活和高小分子蛋白含量的最適條件。

微生物發酵菜籽粕不單可以憑借其低成本、無毒、綠色等特點廣泛用于飼料產業，同時因含有納豆激酶、菜籽小分子蛋白而在新一代溶栓產品或保健食品開發上都有極為誘人的前景。微生物的生長代謝受培養基組成和培養條件的影響，納豆芽孢桿菌為好氧微生物，將其先接入合適含水量的菜籽粕培養基中可以使納豆芽孢桿菌在發酵前期成為優勢菌，產生大量的納豆激酶，同時充分利用基質中的氧，為后期接入短乳桿菌的生長提供了良好的厭氧環境，在兩種益生菌的協同生長代謝下產生的蛋白酶又能將菜籽粕中的大分子蛋白降解為小分子的酸溶性蛋白而使菜籽粕發酵的綜合評分較高。

4 結 論

雙低菜籽粕的最優發酵條件為接種量每100 g 1.5 mL、發酵溫度37 ℃、料水比1∶1.05，在該條件下發酵產物的綜合評分達到4.57，與理論值的相對誤差約為0.438%。

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Fermentation of double-low rapeseed meal by mixed solid culturing

XIAO Meng,WANG Yuan-liang

(CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

【Objective】BacillusnattoandLactobacillusbreviswere used to improve feed quality of double-low rapeseed meal by optimizing fermentation conditions through multi-strains solid fermentation.【Method】 The solid fermentation of double-low rapeseed meal usingBacillusnattoandLactobacillusbreviswas conducted (Bacillusfirst and thenLactobacillusbrevis).Using the comprehensive evaluation index of logarithm of nattokinase and content of trichloroacetic acid soluble nitrogen (TCA-NSI),single-factor tests were conducted to evaluate the effects of inoculums volume,temperature and ratio of solid to liquid.Using inoculums volume,temperature and ratio of solid to liquid as influencing factors,the optimal fermentation process was determined by response surface methodology with 3 factors and 3 levels according to box-behnken experiment design principle.【Result】 Through the single-factor test,the optimal inoculums volume,temperature,an ratio of solid to liquid(g∶mL) were 1.5 mL per 100 g,37 ℃ and 1∶1,respectively.Response surface methodology determined the optimal fermentation parameters were:inoculums volume 1.5 mL per 100 g,temperature 37 ℃,and ratio of solid to liquid (g∶mL) 1∶1.05.The comprehensive grade was 4.57 after 96 h fermentation.【Conclusion】 Optimal multi-strains solid-fermentation process was effective to improve the quality of fermented rapeseed meal.

double-low rapeseed meal;mixed culture;solid-state fermentation;nattokinase;TCA-NSI

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.001

2014-02-28

長沙市科技成果產業化資金專項重點項目(K1207166-21)

肖 萌(1989-)，女，湖南長沙人，碩士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：xiaomeng891004@163.com

王遠亮(1977-)，男，山東臨沂人，教授，碩士生導師，主要從事食品生物技術研究。E-mail：yuanliangw@gmail.com

S816.6

A

1671-9387(2015)09-0001-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.002.html