PD0325901和CHIR99021促進牛體細胞克隆胚胎體外發育的研究

吳新穎，桑元坤，王勇勝，張 涌，華 松

(1 西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100；2 南開大學 醫學院，天津 300071；3 農業部動物生物技術重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

PD0325901和CHIR99021促進牛體細胞克隆胚胎體外發育的研究

吳新穎1,2，桑元坤1,3，王勇勝1,3，張 涌1,3，華 松1,3

(1 西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100；2 南開大學 醫學院，天津 300071；3 農業部動物生物技術重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 選取MAP2K和GSK3的抑制劑PD0325901、CHIR99021(簡稱2i)對牛體細胞核移植(SCNT)胚胎進行處理，研究這2種小分子物質對胚胎發育及其多能性基因(OCT4、SOX2、KLF4、DPPA3、CDX2、GATA4、NANOG)表達的影響?！痉椒ā?以牛皮膚成纖維細胞為供體，牛MⅡ期卵母細胞為受體，構建牛SCNT胚胎，采用添加2i(PD0325901 0.4 μmol/L，CHIR99021 3 μmol/L)的胚胎培養液體外培養SCNT胚胎72 h，以mSOF+DMSO培養液處理的SCNT胚胎及體外受精(IVF)胚胎為對照，統計核移植胚胎體外發育率，并對胚胎多能性相關基因的表達進行實時定量PCR檢測?！窘Y果】 與對照相比，2i處理能使SCNT胚胎囊胚率和囊胚細胞總數顯著增加，凋亡細胞率顯著下降，多能性相關基因NANOG和SOX2表達量上調，而細胞分化相關基因GATA4的表達量下調，其他基因表達量變化不顯著，從而使SCNT胚胎的發育狀態更接近于IVF胚胎?！窘Y論】 2i共處理72 h可優化SCNT胚胎發育狀態。

小分子信號通路抑制劑；體細胞克??；胚胎發育；牛

體細胞克隆(Somatic cell clone)技術，又稱體細胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)技術，近年來被廣泛應用于動物生產、醫學研究和瀕危動物保護等領域，越來越多的哺乳動物被成功克隆，如豬[1]、騾[2]、牛[3]、羊[4]、狼[5]、兔[6]、貓[7]、駱駝[8]等，這充分印證了體細胞克隆技術在理論和實踐方面都具有巨大的潛力。但克隆胚胎發育率以及克隆動物出生率都普遍較低，克隆胎兒也極易出現各種表型異常，這嚴重制約著體細胞克隆技術的進一步發展和應用。研究表明，體細胞核移植胚胎在早期系統分化過程中，由于供核細胞重編程不完全或者重編程錯誤[9]，使得不能正確啟動供核細胞基因組而導致發育阻滯，導致克隆胚胎在體外無法形成完全意義上的囊胚，嚴重制約著克隆技術的推廣和應用。

克隆胚胎的體外培養體系是影響胚胎發育力的重要因素。目前牛體細胞核移植胚胎通用的培養液是改良的輸卵管合成培養液(Meliorate synthetic oviductal fluid，mSOF)[10]。mSOF最早用于牛胚胎的體外培養，胚胎在其中發育效率可以與體內發育相媲美，故而被廣泛用于牛SCNT胚胎的體外培養[11-13]。Rieger等[14]嘗試將表皮細胞生長因子(EGF)添加入胚胎體外培養液后，發現優化培養液可促進胚胎體外發育，掀起了培養液優化的熱潮。

MAPK激酶(MAPKK,亦稱MAP2K、MEK)，是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶, MAPK)鏈級聯過程中至關重要的因子，在基因表達調控和細胞周期調控中具有重要的作用[15]，并且在果蠅的胚胎發生中起著重要的調控作用[16-18]。糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)參與細胞結構和細胞內信號傳導、細胞分裂增殖、凋亡，尤其參與決定胚胎發育過程中細胞的命運[19]。PD0325901是選擇性的、ATP非競爭性的MAP2K抑制劑，選擇性結合和抑制MAP2K，對于抑制干細胞分化和維持其多能性具有重要的作用，可顯著提高ES/iPS細胞傳代效率[20-22]；CHIR99021是高選擇性的GSK3抑制劑，與PD0325901聯合使用可抑制小鼠ES細胞的分化[23]。資料表明，2i即MAP2K抑制劑PD0325901和GSK3抑制劑CHIR99021共同作用，該方法被應用于干細胞培養和誘導傳代中[24]。Daina Harris等聯合利用這2種抑制劑處理體外受精(invitrofertilization，IVF)胚胎，顯著改善了內細胞團的基因表達模式，并且得到高質量的多能干細胞[25]。

本研究從胚胎培養的技術與手段出發，通過檢測體外培養SCNT胚胎發育力和質量，評價PD0325901、CHIR99021對牛SCNT胚胎體外發育的影響，探究胚胎發育中信號通路抑制劑的作用，以期為優化體細胞核移植技術和提高體細胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

TCM199、DMEM和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司(USA)；其余試劑除特別說明外，均購自Sigma公司(USA)。離心管、細胞凍存管、細胞培養皿，購自Corning公司(USA)。

1.2 核移植供體細胞及牛卵母細胞的準備

核移植胚胎中供體細胞為牛皮膚成纖維細胞，來源于1月齡荷斯坦奶牛胎兒。用剪刀剪1塊荷斯坦奶牛胎兒耳部皮膚組織，放入含青霉素(300 IU/mL)、鏈霉素(300 μg/mL)的無菌PBS中運回實驗室，用滅菌剪刀剪成碎塊(1～2 mm3)，PBS洗滌3次，均勻放置在培養皿中，然后將培養皿倒置于38.5 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，待組織塊貼附于培養皿表面之后，加入微量DMEM+體積分數10% FBS培養液浸沒組織塊，24 h后添加約3 mL培養液繼續培養，以后每3 d全量換液1次。有細胞單層形成時去掉組織塊，當細胞長至80%～90%匯合時傳代并部分凍存，以3～5代細胞作為供體細胞。供體細胞在接觸抑制后用質量分數0.25%胰蛋白酶消化，離心棄上清液，沉淀用5 μg/mL的細胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)重懸混勻，備用。

牛卵巢采集于西安市某屠宰場，置于20～30 ℃ 生理鹽水中8 h內送回實驗室。剔除卵巢表面附著的結締組織后，生理鹽水洗滌3遍，采用帶12號針頭的一次性注射器(10 mL)抽吸卵巢表面直徑為2～8 mm卵泡的卵泡液備用。將抽取的卵泡液在體視顯微鏡下收集有卵丘細胞包裹的、胞質均勻的卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complexes，COCs)，放入卵母細胞成熟(Oocyte maturation，OM)培養液中，于38.5 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下進行成熟培養。

1.3 牛體細胞核移植胚胎的構建

將牛卵母細胞體外成熟培養24 h后移入含質量分數0.2%透明質酸酶且無Ca2+、Mg2+的PBS液中處理4 min，同時用移液器反復吹吸脫去卵丘細胞。于實體顯微鏡下挑選形態規則、胞質均一的MⅡ期卵母細胞，將其放入含有7.5 μg/mL CB和體積分數10% FBS的PBS中孵育15 min，再放入100 μL微滴中進行顯微操作。用去核管吸除卵母細胞的第一極體及其附近的部分卵胞質，用Hoechst3334染色確保去核完全后，吸取單個供體細胞注入透明帶下。核質復合體在電融合液中平衡3 min后用微電極法進行融合[26]。電融合參數為：電壓28 V，脈沖時長20 μs，2次脈沖，間隔10 μs。將融合后的細胞置于含5 mol/L離子霉素(Ionomycin)的mSOF中激活4 min，然后用含有2 mmol/L 6-DMAP的mSOF激活4 h。激活后的核移植胚胎用mSOF洗3遍，轉移到預熱的被石蠟油覆蓋的培養液中，于38.5 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下培養。

1.4 牛IVF胚胎的制備及體外培養

將荷斯坦牛細管凍精(購自上海光明荷斯坦牧業公司)置于38 ℃ 水浴中快速解凍，用吸管將0.5 mL精液置于裝有5 mL精子獲能液(BO)的試管底部，傾斜45°置于CO2培養箱中上浮精子45 min，收集試管中上清液體，1 000 r/min離心10 min后棄上清液，保留離心管底部約200 μL精液。將成熟培養24 h的卵母細胞用移液器反復吹吸，收集留有2～3層卵丘細胞的卵母細胞，在BO液中洗滌3次，移入預先于CO2培養箱中孵育2 h的BO液微滴中。將適量獲能后的精子也加入微滴內，置于培養箱中完成受精過程。將受精24 h的胚胎用質量分數0.2%的透明質酸酶處理，去除顆粒細胞后移至mSOF中進行后續培養。體外受精胚胎用mSOF洗3遍，轉移到預熱的被石蠟油覆蓋的mSOF中，于 38.5 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下培養。

1.5 2i對牛SCNT胚胎的影響

1.5.1 對牛SCNT胚胎體外發育率的影響 將SCNT胚胎分成2組，分別為mSOF+DMSO組(對照組)和mSOF+2i組。mSOF+2i組：將SCNT胚胎置于400 μL覆蓋石蠟油的mSOF+2i培養液(2i用DMSO配成10 mmol/L的濃縮液，PD0325901工作濃度為0.4 μmol/L，CHIR99021工作濃度為3 μmol/L)的凹皿中，38.5 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下培養72 h后，轉移到無抑制劑的mSOF培養液中繼續培養。mSOF+DMSO組：SCNT胚胎用mSOF+DMSO培養。每個凹皿中放入30～50枚胚胎，隨后觀察并記錄卵裂率、8-細胞及囊胚率，試驗重復11次。

1.5.2 對牛SCNT囊胚細胞數的影響 取IVF囊胚及mSOF+2i和mSOF+DMSO培養液中培養第7天的囊胚，用免疫染色固定液(Beyotime,China)進行固定，以滋養層特異性蛋白Cdx2為靶蛋白，對胚胎進行免疫熒光染色：囊胚室溫固定30 min，用體積分數0.1% Triton X-100透化處理20 min，用含有質量分數0.2% PVA的PBS緩沖液洗滌3遍；將胚胎放入含有鼠抗牛Cdx2(1∶200稀釋)的一抗稀釋液中處理4 h，用PBS緩沖液洗滌3遍；黑暗環境中放入Alexa Fluor 555標記驢抗鼠IgG(H+L)的二抗稀釋液中孵育2 h，PBS緩沖液中洗滌3遍后放入DAPI染色液中孵育5 min，PBS緩沖液中洗滌3遍；壓片，鏡檢。與Cdx2的單克隆抗體特異性結合的二抗顯紅色，指示滋養層細胞；DAPI在細胞核顯藍色，指示胚胎全部細胞。計數滋養層細胞數和胚胎細胞總數，內細胞團細胞數即胚胎細胞總數減滋養層細胞數，計算內細胞團和滋養層細胞數所占比率。試驗重復5次。

1.5.3 對牛SCNT囊胚凋亡的影響 用TUNEL法(DeadEndTMFluorometric TUNEL System,Promega)檢測兩組囊胚細胞凋亡情況：取IVF囊胚及mSOF+2i和mSOF+DMSO培養液中培養第7天的囊胚，用免疫染色固定液(Beyotime,China)固定；用體積分數0.1% Triton X-100透化處理30 min，用含有質量分數0.2% PVA的PBS緩沖液洗滌3遍；放入平衡緩沖液(E Buffer)中平衡10 min；放入熒光標記的末端轉移酶dUTP孵育緩沖液中，37 ℃ 避光孵育1 h；PBS緩沖液中洗滌3遍后放入2×SSC中15 min以終止反應；PBS緩沖液中洗滌3遍，放入DAPI中染核10 min；封片，鏡檢。與dUTP結合的細胞顯綠色，指示凋亡細胞；DAPI在細胞核顯藍色，指示胚胎全部細胞。計數凋亡細胞和胚胎細胞總數，統計凋亡細胞比率。試驗重復3次。

1.5.4 對牛SCNT胚胎基因表達的影響 選取多能性相關基因CDX2、DPPA3、GATA4、KLF4、NANOG、OCT4、SOX2作為研究對象，以看家基因GAPDH作為內參，采用 RT-PCR進行基因表達檢測。定量PCR引物由Takara公司設計并合成，引物序列見表1。

取IVF囊胚及mSOF+2i和mSOF+DMSO中培養第7天囊胚各3個，每組隨機取囊胚3個，用SuperScript Ⅲ CellsDirect cDNA Synthesis System (Invitrogen,USA) 獲得胚胎cDNA，以此作為模板用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(Takara，Japan)進行熒光定量RT-PCR分析。反應結束后，運用2-ΔΔcT方法計算目的基因的相對表達量[27]。試驗重復3次。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of RT-PCR primers

1.6 統計與分析

卵裂率、囊胚率及凋亡率等均使用SPSS 19.0(SPSS,Inc.,IL,USA)進行單因素ANOVA檢驗分析，當P<0.05時即認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 2i對牛SCNT胚胎體外發育率的影響

由表2可知，與mSOF+DMSO組(對照組)相比，mSOF+2i組胚胎卵裂率和8-細胞胚率略有上升但差異不顯著，而累加效果囊胚率顯著上升；從8-細胞胚胎發育至囊胚的比率看，mSOF+2i組(52.27%(115/220))相對于mSOF+DMSO組(40.45%(89/220))顯著上升(P<0.05)。說明在胚胎發育前72 h，2i處理可提高體細胞克隆胚胎體外發育的囊胚率，促進和優化克隆胚胎的體外發育能力。

表2 2i對牛SCNT胚胎體外發育的影響(n=11)Table 2 Effect of 2i on bovine in vitro SCNT embryos (n=11)

注：*同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note：Different small letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 2i對牛SCNT囊胚細胞數的影響

從圖1可以明顯地看出，mSOF+2i組囊胚細胞總數較mSOF+DMSO組增加，而滋養層細胞減少。由表3可知，mSOF+2i組囊胚細胞總數較mSOF+DMSO組顯著增加，內細胞團(ICM)比率顯著增大，滋養層細胞比率顯著減小，更加接近IVF胚胎。說明在胚胎發育前72 h，2i處理可提升早期囊胚中內細胞團比率，優化胚胎發育狀態。

圖1 牛SCNT囊胚和IVF囊胚的免疫熒光染色結果(×400)A.mSOF+DMSO組(對照組)牛SCNT囊胚全部細胞DAPI染色;a.mSOF+DMSO組(對照組)牛SCNT囊胚滋養層細胞特異性染色；B.mSOF+2i組牛SCNT囊胚全部細胞DAPI染色;b.mSOF+2i組牛SCNT囊胚滋養層細胞特異性染色；C.牛IVF囊胚全部細胞DAPI染色;c.牛IVF囊胚滋養層細胞特異性染色Fig.1 Immunofluorescence staining results of bovine SCNT blastocysts and IVF blastocysts(×400)A.DAPI-stained bovine SCNT blastocysts cultured in mSOF+DMSO (control);a.TE of bovine SCNT blastocysts cultured in mSOF+DMSO (control);B.DAPI-stained bovine SCNT blastocysts cultured in mSOF+2i;b.TE of bovine SCNT blastocysts cultured in mSOF+2i;C.DAPI-stained bovine IVF blastocysts;c.TE of bovine IVF blastocysts

表3 2i對牛SCNT囊胚細胞數的影響Table 3 Effect of 2i on cell number of bovine SCNT blastocysts

2.3 2i對牛SCNT囊胚細胞凋亡的影響

從圖2可以看出，mSOF+2i組囊胚細胞凋亡數量較mSOF+DMSO組降低。

圖2 牛SCNT囊胚和IVF囊胚的凋亡染色結果(×400)

囊胚細胞凋亡比率統計結果見表4。由表4可知，mSOF+2i組囊胚細胞凋亡比率較mSOF+DMSO組顯著降低。說明在胚胎發育前72 h，2i處理可降低囊胚凋亡率，而且凋亡細胞比率更加接近IVF胚胎，可見2i處理可優化胚胎發育狀態，提升克隆胚胎后續發育力。

表4 2i對牛SCNT囊胚細胞凋亡的影響Table 4 Effects of 2i on apoptosis rate of bovine SCNT blastocyst

2.4 2i對牛SCNT胚胎基因表達的影響

圖3為囊胚細胞中多能性相關基因OCT4、SOX2、KLF4、DPPA3、CDX2、GATA4、NANOG的相對表達水平。由圖3可以看出，與mSOF+DMSO組相比，mSOF+2i組囊胚NANOG和SOX2的表達量顯著上升，GATA4表達量顯著下降，而OCT4、KLF4、DPPA3和CDX2表達量變化不顯著。

由圖3還可以看出，除NANOG外，mSOF+2i組囊胚其他多能性基因的表達量多介于IVF胚胎與mSOF+DMSO組囊胚之間，說明2i處理能在某種程度上使囊胚細胞內基因表達量更趨向于IVF胚胎?？梢娫谂咛グl育前72 h，2i處理影響了體細胞克隆胚胎的基因表達，優化了胚胎發育狀態，進而提升了胚胎后續發育能力。

圖3 2i對牛SCNT囊胚多能性相關基因相對表達水平的影響圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

近年來克隆技術的應用和發展都取得了不小的進步，但克隆胚胎的發育以及克隆動物的生產情況仍舊不理想。主要表現在克隆胚胎囊胚率低、孵化胚胎著床率低、胎兒流產率高以及新生兒成活率低，而且存在巨胎癥(LOS)、內臟和胎盤發育過度或畸形等表型異常[28]。目前普遍認為，在體細胞克隆胚胎早期系統分化過程中，由于供核細胞重編程不完全或者重編程錯誤，使之不能正確啟動重構胚胎合子基因組，因而導致發育阻滯?？寺∨咛サ捏w外培養體系是影響胚胎發育力的重要因素之一。為提高哺乳動物體外培養獲得的囊胚率，必須克服胚胎發育阻滯的問題。牛體細胞克隆胚胎體外培養主要阻滯于8-細胞時期，因其在8-細胞時期開始啟動合子基因組，胚胎發育從母源單一調控向合子調控過渡[29]，對體外培養體系也相應地要求有所變化。

本試驗向胚胎基礎培養液中添加MAP2K和GSK3雙通路小分子抑制劑PD0325901、CHIR99021處理72 h，結果發現，與對照組相比，體外培養的克隆胚胎卵裂率和8-細胞胚率都沒有顯著變化，囊胚率卻顯著上升，尤其從8-細胞胚胎發育至囊胚的比率顯著上升。2i處理組囊胚細胞總數顯著增加，內細胞團(ICM)所占比率增加，囊胚細胞凋亡比率降低。說明在胚胎發育的前72 h， 2i處理可有效提高核移植重構胚胎后續發育啟動合子基因組的效率。此外，2i處理可提升早期囊胚中內細胞團比率，而且降低囊胚細胞凋亡率，有利于胚胎進一步發育，優化胚胎后續發育能力，為附植后發育奠定了良好的基礎。

哺乳動物囊胚分化為滋養層、內胚層和外胚層，本試驗RT-PCR檢測發現，與對照組相比，2i處理后NANOG、SOX2作為外胚層特異性標記基因[30-31]，其表達量上升，其中NANOG基因的表達量變化最顯著。由于NANOG基因在桑椹胚時期開始表達，于早期囊胚中表達量達到巔峰，NANOG與外胚層早期建立有著緊密的聯系。NANOG的表達大幅升高，更加有利于胚胎的后續發育。2i處理后OCT4、KLF4、DPPA3等非外胚層特異性標記基因[23,32]表達量變化不明顯；內胚層特異性標記基因GATA4表達量顯著下降；滋養層特異性標記基因CDX2[32]表達量變化也不顯著。結果充分說明，2i對牛體細胞克隆胚胎的基因表達和發育有一定影響。

由成纖維生長因子(Fgf)活化的MAPK通路是起始囊胚內細胞團系統分化的關鍵因素[22]，2i阻斷MAPK通路的結果是外胚層擴張。由于哺乳動物只有外胚層能夠分離ES細胞，使得從體外培養胚胎中獲得胚胎干細胞(ES cell)更加容易。本試驗結果表明，2i處理既能提高囊胚發育率，又能提高獲得ES細胞的效率，這為再生醫學提供了新思路。對于克隆動物的生產而言，2i處理胚胎的后續著床和發育能力還有待進一步研究。

4 結 論

在體細胞克隆胚胎基礎培養液(mSOF)中添加PD0325901、CHIR99021對SCNT胚胎進行2i處理，可有效提高克隆胚胎的體外發育囊胚率，同時內細胞團比率增加，囊胚細胞凋亡率降低，多能性相關基因NANOG、SOX2、GATA4表達水平更加接近IVF胚胎，可見2i處理有利于提高?？寺∨咛サ捏w外發育能力和品質。

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Promotion ofinvitrodevelopment of bovine somatic nuclear transfer embryos by PD0325901 and CHIR99021

WU Xin-ying1,2,SANG Yuan-kun1,3,WANG Yong-sheng1,3,ZHANG Yong1,3,HUA Song1,3

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2SchoolofMedicine,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;3KeyLaboratoryofAnimalBiotechnologyoftheMinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The objective was to investigate the effect of MAP2K and GSK3 pathway inhibitors PD0325901 and CHIR99021 on development capacity and expression of pluripotency genes (OCT4,SOX2,KLF4,DPPA3,CDX2,GATA4,andNANOG)invitroof bovine somatic cell nuclear transfer embryos.【Method】 Using bovine skin fibroblasts as donors and MII oocytes as receptors,SCNT embryos were constructed and treated with PD0325901+CHIR99021 (PD0325901 0.4 μmol/L,CHIR99021 3 μmol/L) as tests and mSOF+DMSO as control for 72 hinvitro.In addition,embryos were counted and development rates and embryonic development related genes were analyzed by real-time PCR.【Result】 Compared to untreated control,the 2i treatment increased the blastocyst rate and total blastocyst cell number while decreased apoptosis rate markedly.The expression of pluripotency related genes was upgraded.Expression ofNANOGandSOX2 was significantly increased and that ofGATA4 decreased while the rest genes were not significantly changed.SCNT embryo pluripotent expression related genes were closer to IVF embryo.【Conclusion】 Treatment with 2i can optimize SCNT embryonic development state.

Micromolecular inhibitors;somatic cell clone;embryo development;bovine

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.004

2014-02-25

國家自然科學基金項目(31001008)

吳新穎(1989-)，女，山東昌邑人，碩士，主要從事動物胚胎工程研究。E-mail:wuxinyingwxy@163.com

華 松(1976-)，男，江西九江人，副教授，碩士生導師，主要從事動物胚胎工程與發育生物學研究。 E-mail:hs863@nwsuaf.edu.cn

Q813.7

A

1671-9387(2015)09-0023-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.008.html