翹嘴鱖F2家系選育及微衛星親子鑒定

楊 凱 成為為 高銀愛 王青云 羅 峰 夏儒龍 朱思華程穎紅 鄧國喬

(武漢市水產科學研究所, 武漢 430207)

研究簡報

翹嘴鱖F2家系選育及微衛星親子鑒定

楊 凱 成為為 高銀愛 王青云 羅 峰 夏儒龍 朱思華程穎紅 鄧國喬

(武漢市水產科學研究所, 武漢 430207)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)俗稱“桂花”、“季花”, 隸屬于鱸形目(Perciformes), 鱖屬(Siniperca), 是鱖屬魚類中體型最大、生長最快的一種[1]。其肉質堅實細嫩、味道鮮美、營養豐富、無肌間刺, 是一種經濟價值很高的名貴魚類, 在我國淡水養殖業中占有重要的經濟地位[2]。目前,養殖的翹嘴鱖親魚大多從野生資源中捕獲而來, 缺乏定向選育, 加之一些繁育單位不注重親魚的保種和留種工作, 甚至為了生產上的方便, 選擇個體小, 性成熟早的個體作為親本, 致使翹嘴鱖種質質量急劇下降。因此, 良種選育已經成為我國鱖養殖產業健康和可持續發展亟待解決的重要課題之一。

家系選育是獲得優良品種的重要手段之一, 其可以增加物種某一種群體內具有育種價值的基因頻率, 降低育種不需要的基因頻率, 使個體更適用于特定的生產目的和要求[3]。在家系選育過程中, 準確地掌握系譜信息,可以有效地指導親本選留, 從而縮短育種周期, 提高育種效率。然而, 環境因素對遺傳參數有較大的影響, 因此,為了降低環境因素對遺傳參數的準確評估, 需要利用遺傳標記對混養的不同家系進行親子鑒定[4]。傳統的外部物理標記如顏色、電子標記等有明顯的不足之處[5], 相比之下, 微衛星分子標記具有共顯性遺傳、數量多、分布廣泛均勻、多態性豐富及檢測方便等優點, 是進行系譜追蹤有力的工具[6]。諸多研究證明, 微衛星分子標記可以有效地確認混養群體的家系信息[7], 是進行選擇育種研究非常有效的標記手段。

本研究以武漢市水產科學研究所家系選育的 F2翹嘴鱖個體為研究對象, 采用微衛星標記技術對翹嘴鱖混養家系進行親子鑒定, 意在為翹嘴鱖后續家系選擇育種工作的順利開展提供生長速度快且抗病力強的候選親本和分子標記輔助育種技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2010年 5月, 分別從廣東省佛山市南海區石啃魚苗場和武漢市佳恒水產有限公司引進種苗 5000尾, 各選留500尾生長速度快、體型好、健壯個體作為廣東和湖北地區選育基礎群體。2011年5月, 從上述 2個基礎群體中選取生長性狀優良的雌雄個體建立翹嘴鱖 F1家系, 并從中挑選了5個具有生長優勢家系。2013年5月, 以上述5個優良家系為親本, 采用家系內個體巢式交配原則構建了 30個 F2家系, 其中廣東養殖群體家系 7個, 編號為GDF2-1、GDF2-2、GDF2-3、GDF2-4、GDF2-5、GDF2-6、GDF2-7; 湖北養殖群體家系 23個, 編號為 HBF2-1、HBF2-2、HBF2-3、…、HBF2-21、HBF2-22、HBF2-23。建系時, 采用人工單獨受精, 隔離孵化及養殖至5 cm時,從每個家系各挑選1000尾個體進行同塘混養。養殖6個月后, 干塘起捕至網箱中, 挑選體重較大的個體(≥500 g)作為下一代育種材料并進行親子鑒定研究。

1.2 實驗方法

樣本收集及DNA提取 剪取翹嘴鱖24尾親本及F2子代鰭條組織浸泡在95%的乙醇中, 然后置于4℃下保存備用。采用經典的酚氯法提取基因組DNA。

引物來源 15個微衛星引物來源于已發表的文獻[8], 序列及其擴增等信息見表1, 引物由上海生工生物工程技術公司合成。

PCR擴增及分型 PCR反應體系12.5 μL: 含模板DNA 30—50 ng, 10×buffer (含Mg2+)1.25 μL, dNTP 0.4 μL (2.5 mmol/L), 引物0.5 μL(2 μmol/L), Taq酶0.1 μL(5 U/L),添加 ddH2O至終體系。反應條件為: 95℃預變性 5min; 94℃變性35s, 退火35s(溫度見表1), 72℃延伸40s, 35個循環; 72℃后延伸10min。

PCR擴增產物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上230V電泳4h, EB顯色, 凝膠電泳成像。以分子標記物pBR322/ Msp Marker (天根生化有限公司)確定等位基因的大小。

表1 微衛星引物基本信息Tab. 1 The basic information of the primer

親子鑒定分析 使用CERVUS3.0軟件對每一個體的基因型進行親權分析, 計算出各微衛星位點的等位基因頻率、雜合度、多態信息含量、Hardy-Weinberg平衡及無效等位基因頻率, 根據LOD值對每一個體的父母作出鑒定。

生長性狀評估 根據親子鑒定結果, 使用 SPSS 19.0軟件(SPSS公司, 美國)對 F2進行方差分析、顯著性檢測和LSD多重比較, 評估其生長性狀。

2 結果

2.1 F2混合群體家系鑒定

試驗共選育F2代個體486尾, 利用15對微衛星引物對翹嘴鱖486尾混養個體進行PCR擴增, 然后進行基因分型并統計其基因型。根據統計的基因型數據, 應用CERVUS3.0軟件對混養群體進行家系鑒定, 15個微衛星座位在混養家系檢測值見表2。

為了保證鑒定結果準確, 根據LOD值鑒定候選親本時, 只有所有的微衛星座位全部匹配, 并符合親本交配體制才確認為親子關系, 最終確認了 470個混養后裔的父母(表 3), 其真實鑒定率為 96.7%, 低于軟件分析算出的鑒定率(98.8%)(圖1)。鑒定結果表明470尾翹嘴鱖個體分屬于30個家系, 其后裔數目介于3—28。

2.2 生長性狀評估

根據家系鑒定結果, 本研究分別計算了各家系的體質量和標準差(表3)。對優勢個體數達到 15尾以上的 F2各家系平均體質量進行顯著性差異分析及LSD多重比較,數量15以下家系未進行統計分析。結果顯示, GDF2-5體質量顯著最高, 為569.59 g, 數量為17尾; HBF2-23體質量顯著最低, 為521.09 g, 數量也為17尾; 廣東養殖群體家系 GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北養殖群體家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22的體質量顯著高于其他家系(P＜0.05), 數量達到15尾以上, 宜選育為翹嘴鱖下一代家系選育的優勢親本。

3 討論

3.1 F2混合群體家系鑒定

準確的系譜關系對良種選育有著重要的作用, 因此必須選擇合適的標記來掌握正確的系譜信息[9]。本研究使用 15個有效的微衛星標記對雙親已知的 30個家系 486尾個體的混養群體進行家系鑒定。鑒定結果表明在 486尾個體中, 當所有的微衛星座位全部匹配, 并符合親本交配體制時, 有470尾翹嘴鱖個體確認了父母, 其真實鑒定率達96.7%。陳騰等[10]認為在采用微衛星標記進行親子鑒定的生產實踐中, 當個體識別率大于0.8時, 表明該研究所使用的微衛星標記具有較高的應用價值。因此, 本研究中所使用的微衛星標記能有效地應用于翹嘴鱖遺傳改良和生產實踐。

表2 15個微衛星位點在翹嘴鱖混養家系檢測值Tab. 2 Detective values of the fiveteen microsatellite loci in mix-feed families of mandarin fish

表3 翹嘴鱖選育世代及體重指標 (平均值±標準差)Tab. 3 Body parameters of selective generation of superior families in mandarin fish (mean ± SD)

3.2 翹嘴鱖家系鑒定影響因素

親本規模及其親緣關系和標記數量及其多態性是影響家系準確性一個重要原因[4]。以往的微衛星親子鑒定研究結果表明, 使用5—8個微衛星標記就能達到90%以上的鑒定準確率, 而在本研究中當使用超過12個微衛星標記時, 才能達到相同的鑒定準確率。這可能是因為本研究構建的30個F2家系是由5個F1家系繁育而來, 而來源于同一 F1家系的后裔親緣關系較近, 從而增加了家系鑒定的難度。無效等位基因的存在是影響家系鑒定準確性另一個重要原因[4], 通常是由于引物結合位點的替代、插入或缺失等突變造成引物無法結合而產生。然而, 無效等位基因的存在會造成群體雜合子缺失, 從而降低鑒定準確率, 目前已在多個物種中證實了它的存在[11]。在進行親子鑒定研究所用的 15個微衛星標記中, 有 6個微衛星標記偏離Hardy-Weinberg平衡和 3個微衛星標記無效等位基因頻率超過 5%, 這些標記的使用可能會降低鑒定準確率。另外, 基因分型錯誤也會降低家系鑒定率。O’Reilly等[6]研究發現平均每個基因座位會產生 2%—3%分型錯誤率,如果個體在多個位點都出現了錯誤的分型結果, 就會產生錯配的現象, 但如果僅在 1—2個位點出現分型錯誤, 可通過多基因座位的綜合分析也會得到準確的結果[9]。本研究混養家系的鑒定率高達98.8%, 一方面本研究使用了較多的微衛星標記(15個); 另一方面是因為混養群體是由近交繁育而成, 微衛星位點在群體中的平均等位基因只有3.39個, 因而較少產生分型錯誤。

圖1 翹嘴鱖F2真實家系(實際)和軟件分析結果比較圖Fig. 1 The comparison of real and software analysis results of F2selective generation in mandarin fish

3.3 優良家系鑒定

家系選育是根據某個性狀或某幾個性狀明顯優于其親屬、生長性能顯著高于其親屬的混有不同類型的原始群體里選出一些優良個體留種, 建立幾個或若干個家系并繁殖后代, 逐代與原始群體相比較, 選留那些符合原定選擇指標的優良家系, 進而參加品系產量測定、繁育推廣后鑒定新品種[3]。近交和選擇是家系選育中建系的重要手段。一般來說, 顯性性狀對生長發育有較好的作用, 可通過累代近親繁殖將顯性基因純化, 但與此同時不良作用的隱形性狀也表現出來, 因此在近親繁殖的同時, 必須進行選擇。選擇是選擇育種最有效的方法,在選擇過程中有積累顯性基因, 減少隱性基因的作用,從而構建性狀穩定的自交系。然后進行自交系間雜交,有利于優勢性狀顯性基因的聚合, 進而能達到更好的育種效果。

本研究以生長性狀為育種目標, 采用家系選育的方法構建了翹嘴鱖F2代家系30個, 以1.6%左右的擇優率從30000尾混養群體中挑選了486尾體質量大的個體作為下一代繁育親本。根據家系鑒定結果, 470尾個體被準確地鑒定到30個F2代家系, 每個家系個體數在3—28個, 可見, 在個體質量≥500 g的同一選育標準下, 各個家系選育出個的體數存在較大差異, 數量占有比例越大, 說明該家系群體越具備生長優勢, 群體產量越高, 反之亦然。從家系繁育數量和統計學要求考慮, 對達到 15尾以上的F2家系進行統計分析。結果表明, 各個家系間存在顯著的生長差異(P＜0.05), 具有進一步選育的空間和意義(表3)。綜合各個家系個體數和體質量指標, 試驗選育的廣東養殖群體家系GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北養殖群體家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22共7個優勢家系作為翹嘴鱖下一代家系選育的優勢親本。

[1] Yang Y H, Liang X F, Lin Q, et al. Cultivated and natural populations of Siniperca chuatsi in Guangdong and Jiangxi: sequence polymorphism of the mitochondrial DNA control region and population genetic diversity analysis [J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(4): 515—520. [楊宇暉, 梁旭方, 林群, 等. 廣東與江西翹嘴鱖養殖與天然種群的遺傳多態性分析. 水產學報, 2010, 34(4): 515—520]

[2] Sun J H, Liu H, Gao Y J. Research on technology for artificial propagation of mandarin fish with a rare and precious economic species[J]. Henan Fisheries, 2008, 3: 3—4. [孫劍惠, 劉輝, 高燕軍. 高效名優魚類翹嘴鱖的人工繁殖技術.河南水產, 2008, 3: 3—4]

[3] Lou Y D. Fish Breeding [M]. China Agriculture Press. 2006, 10—29 [樓允東. 魚類育種學. 中國農業出版社. 2006, 10—29]

[4] Zhang C L, Tong G X, Kuang Y Y, et al. Applicability of Microsatellite DNA Markers to the Parental Identification of Hucho taimen (Pallas) [J]. Zoological Research, 2010, 31(4): 395—400 [張春雷, 佟廣香, 匡友誼, 等. 哲羅魚微衛星親子鑒定的應用. 動物學研究, 2010, 31(4): 395—400]

[5] Jerry D R, Preston N P, Crocos P J, et al. Parentage determination of Kuruma shrimp Penaeus (Marsupenaeus) japonicus using microsatellite markers (Bate) [J]. Aquaculture, 2004, 235(1): 237—247

[6] O’reilly P T, Herbinger C, Wright J M. Analysis of parentage determination in Atlantic salmon (Salmo salar) using microsatellites [J]. Animal Genetics, 1998, 29(5): 363—370

[7] Moore S S, Whan V, Davis G P, et al. The development and application of genetic markers for the Kuruma prawn (Penaeus japonicus) [J]. Aquaculture, 1999, 173(1): 19—32

[8] Qu C, Liang X, Huang W, et al. Isolation and characterization of 46 novel polymorphic EST-simple sequence repeats (SSR) markers in two Sinipercine fishes (Siniperca) and cross-species amplification [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(8): 9534—9544

[9] Dong S R, Kong J, Zhang T S, et al. Microsatellite markers simulation and application for parentage determination on fenneropenaeus chinensis [J]. Acta Hudrobiologica Sinica, 2008, 32(1): 96—100 [董世瑞, 孔杰, 張天時, 等. 中國對蝦微衛星家系鑒定的模擬分析與應用. 水生生物學報, 2008, 32(1): 96—100]

[10] Chen T, Zhang L L, Lai J H, et al. Genetic polymorphisms in nine STR loci of China Dongxiang [J]. Hereditas, 2002, 24(3): 247—250 [陳騰, 張琳琳, 賴江華, 等. 中國東鄉族9 個 STR 基因座遺傳多態性研究. 遺傳, 2002, 24(3): 247—250]

[11] Alderson G W, Gibbs H L, Sealy S G. Parentage and kinship studies in an obligate brood parasitic bird, the brown-headed cowbird (Molothrus ater), using microsatellite DNA markers [J]. Journal of Heredity, 1999, 90(1): 182—190

PARENTAGE ANALYSIS OF F2SELECTIVE GENERATION IN MANDARIN FISH USING MICROSATELLITES

YANG Kai, CHENG Wei-Wei, GAO Yin-Ai, WANG Qing-Yun, LUO Feng, XIA Ru-Long, ZHU Si-Hua, CHENG Ying-Hong and DENG Guo-Qiao
(Wuhan Fisheries Science Research Institute, Wuhan Academy of Agricultural Science &Technology, Wuhan 430207, China)

翹嘴鱖; 微衛星; 親子鑒定; 家系

Mandarin fish; Microsatellite; Parentage identification; Family

Q347

A

1000-3207(2015)06-1231-05

10.7541/2015.160

2014-11-06;

2015-01-16

武漢市農業科學技術研究院創新項目(翹嘴鱖優勢家系遺傳距離的評估及選育CX201419; 鱖良種選育、遺傳性狀分析及品質評價 Cxtd201504)項目資助

楊凱(1982—), 男, 山西五臺人; 碩士; 主要研究方向為遺傳育種。E-mail: 593539389@qq.com

高銀愛, 高級工程師; E-mail: 304104752@qq.com