日本沼蝦MT基因克隆、組織差異性表達及與飼料銅、鋅含量的相關性

孔有琴陳立僑丁志麗李二超葉金云杜震宇

(1. 華東師范大學生命科學學院, 上海 200241; 2. 湖州師范學院生命科學學院,浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室, 湖州 313000)

日本沼蝦MT基因克隆、組織差異性表達及與飼料銅、鋅含量的相關性

孔有琴1, 2陳立僑1丁志麗1, 2李二超1葉金云2杜震宇1

(1. 華東師范大學生命科學學院, 上海 200241; 2. 湖州師范學院生命科學學院,浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室, 湖州 313000)

為了更全面理解日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的銅/鋅營養生理作用, 研究利用RACE技術從日本沼蝦肝胰腺中克隆獲得一金屬硫蛋白基因cDNA全長(mn-MT), 并對該基因分子特征、組織表達譜和飼料銅/鋅水平對其表達的影響進行分析。結果顯示: (1)mn-MT cDNA全長665 bp, 含編碼59個氨基酸的180 bp的開放閱讀框, 預測該多肽的理論分子量為6.085 kD, 等電點為7.73。該蛋白中半胱氨酸含量最高(30.5%),其次是賴氨酸(16.95%)和絲氨酸(10.17%)。相似性分析顯示 mn-MT氨基酸序列與美洲海螯蝦、斑節對蝦和中華絨螯蟹MT的相似性分別達到78%、75%和75%。(2)qRT-PCR分析顯示, mn-MT mRNA在肝胰腺、血細胞、鰓、胃、卵巢、腸和肌肉中都有表達, 其中肝胰腺中表達量最高。(3)用4組銅添加量分別為0、20、40及160 mg/kg的飼料和3組鋅添加水平分別為0、35和210 mg/kg的飼料飼喂初重為(0.101±0.002) g日本沼蝦56d后, 分析各組蝦肝胰腺的mn-MT mRNA表達。mn-MT mRNA表達隨飼料銅水平的提高而升高, 到40 mg/kg組達到最高(P＜0.05), 而后開始下降; 飼料中高鋅(210 mg/kg)顯著提高mn-MT表達(P＜0.05), 0和35 mg/kg組間差異不顯著(P＞0.05)。結果表明飼料中銅/鋅均可影響mn-MT表達, 且呈現不同的劑量依賴效應。

日本沼蝦; 金屬硫蛋白; 銅; 鋅; mRNA表達

金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一類低分子量、分布廣、保守的金屬結合蛋白, 其氨基酸組成中含有大量半胱氨酸, 對金屬離子具有高親和力,參與微量元素的吸收、代謝, 還具有清除自由基、增強機體免疫力和抗應激的作用[1, 2]。1957年, MT首次在馬(Equus caballus)腎中被發現[3]。MT作為一種可被誘導的蛋白質, 其表達受多種金屬暴露[4—6]、感染和輻射等其他物化處理[7, 8]的誘導, 其中金屬離子是主要的誘導因子, 如水體鎘、銅或鋅暴露均可顯著提高朝鮮(Hemibarbus mylodon)肝臟和腎臟中MT表達水平[9]。

銅和鋅均是動物體生長和代謝活動所必需的微量元素, 具重要生理功能[10], 金屬硫蛋白對它們具有較強的結合力, 形成銅/鋅-金屬硫蛋白復合物[11]。迄今, 學者對水體中銅/鋅暴露對水生動物MT表達影響研究較多, 且側重于探討 MT作為水環境污染生物標記分子的篩選等[5]。銅/鋅是動物體所必需的微量元素, 分析飼料中銅/鋅水平與MT表達間關系可以更全面、深入理解銅/鋅的營養生理, 此類研究多見于脊椎動物[12]。

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)又稱河蝦、青蝦, 屬甲殼綱、十足目、長臂蝦科, 是我國主要淡水養殖品種之一。近年來, 我國日本沼蝦養殖業快速發展, 推動對其生物學特性、營養生理學研究的需求, 但目前對日本沼蝦的基礎研究還較薄弱。關于微量元素銅/鋅只有飼料中適宜需求量確定、銅/鋅水平對蝦的生長性能、抗氧化力影響等的報道[13, 14]。為深入理解營養素的功能和作用機制,探討分析營養素對相關基因表達的影響已成為水產動物營養學研究重點之一。本研究通過克隆日本沼蝦 MT基因, 并分析各組織中的表達變化, 旨在了解日本沼蝦MT基因的結構、功能和組織表達特征;同時觀測飼料中銅/鋅水平變化對MT基因表達的影響, 以期為日本沼蝦 MT基因作用機制和微量元素代謝機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用日本沼蝦于2013年3—5月購于上海市普陀區銅川路水產市場, 先于實驗室內用曝氣自來水暫養一周, 而后選取健康活潑的個體, 活體解剖取肝胰腺、鰓、腸、肌肉、卵巢和胃等組織, –80℃保存, 用于總RNA提取。同時用1 mL無菌注射器從日本沼蝦第三步足基部采集血淋巴, 加入等量預冷的抗凝劑[15], 4℃、8000 ×g離心10min, 收集血細胞, –80℃保存, 用于總RNA提取。

1.2 總RNA提取及反轉錄

采用組織/細胞 RNA快速提取試劑盒(Aidlab,北京)提取總RNA, 提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 與此同時, RNA純度和濃度用Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀檢測。用 Takara (大連)反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit將總RNA反轉錄合成cDNA, 并于–20℃保存備用。

1.3 mn-MT基因cDNA克隆

從本實驗室的日本沼蝦cDNA文庫中獲得一條MT的EST序列。根據該EST序列設計引物mnMT-3′GSP和 mnMT-5′GSP(生工合成, 上海, 表 1)各一條用于3′和5′-RACE擴增mn-MT cDNA全長。運用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clonch,美國)將日本沼蝦肝胰腺總 RNA分別反轉錄合成3′-RACE cDNA和5′-RACE cDNA, 而后根據該試劑盒推薦的條件以這些cDNA為模板進行PCR反應。PCR產物用柱式DNA膠回收試劑盒(生工, 上海)回收純化后與pUCm-T載體(生工, 上海)連接, 轉化至大腸桿菌感受態細胞 DH5α, 選擇陽性克隆進行測序(生工, 上海)。所得序列經NCBI的BLAST比對確定屬于MT基因。

1.4 mn-MT序列分析

用 NCBI的 ORF Finder程序(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/)尋找 mn-MT序列的開放閱讀框和預測編碼氨基酸序列; 用NCBI BLAST程序(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)比較 MT的序列相似性; 日本沼蝦MT基因的氨基酸序列與NCBI數據庫中其他動物 MT的氨基酸序列的多重比對分析使用ClustalX軟件, 而后使用MEGA 5.1程序(http://www. megasoftware.net/)中的Neighbor Joining法構建系統樹。

1.5 mn-MT在不同組織中的表達

用熒光定量PCR (qRT-PCR)對MT在日本沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、腸、血細胞、卵巢和胃中表達進行定量分析, β-actin作為qRT-PCR反應中的內參基因。qRT-PCR中, mn-MT和β-actin基因的特定引物分別是mnMT-s、mnMT-a、β-actin-s 和β-actin-a(表 1)。采用 Takara的實時熒光定量試劑盒 SYBR Premix Ex Taq 進行 PCR反應。PCR反應體積為20 μL, 包括10 μL 2 × SYBR Green Premix Ex Taq、引物(10 μmol/L)各 0.2 μL、1 μL cDNA、8.6 μL ddH2O。qRT-PCR反應條件為: 95℃預變性30s; 94℃變性15s、58℃退火20s、72℃延伸 20s, 共40個循環; PCR反應后繪制融解曲線以判斷擴增產物的正確性, 溫度以0.5℃/5s的速度從60℃上升到95℃。使用2–ΔΔCt方法對mn-MT表達水平進行分析[16]。

表1 引物序列Tab. 1 The primer sequence

1.6 飼料中銅/鋅水平對mn-MT mRNA表達的影響

以酪蛋白和魚粉作為蛋白源, 魚油和大豆油作為脂肪源配制半純化基礎飼料。根據日本沼蝦對飼料銅/鋅的需求量[13, 14], 添加相應含量硫酸銅/硫酸鋅(分析純試劑, 國藥集團, 上海)到基礎飼料中, 配制4組銅添加量分別為0、20、40和160 mg/kg飼料的實驗飼料和 3組鋅添加量分別為 0、35和210 mg/kg飼料的實驗飼料。實驗飼料按照Li等[17]方法制作自然風干后用自封袋密閉封裝于–20℃保存備用。飼料配方和主要營養成分分析見表 2。飼料中銅含量的實測值分別為 2.8、20.9、43.1和157.1 mg/kg, 鋅含量的實測值分別為 10.3、45.2和211.2 mg/kg。養殖實驗于2013年7—9月在上海市金山區漕涇名特優水產品養殖示范基地進行。實驗用日本沼蝦購自浙江省湖州市南潯區一養殖場, 正式實驗前先暫養1周。而后選擇健康活潑、平均初始體重為(0.101±0.002) g的蝦隨機放入到21只體積為300 L的塑料水箱中, 每只水箱中放入50尾蝦。養殖實驗共分為7組, 每組3個平行, 正式養殖實驗時間共持續 56d。實驗期間連續充氧保持溶氧＞6.5 mg/L。養殖的水質條件為: 水溫27—30℃, 總氨氮＜0.1 mg/L。養殖期間光照為自然光照。養殖水為自然河水, 水中銅含量為 1.2—1.6 μg/L、鋅含量為14—18 μg/L。在56d養殖結束后, 養殖蝦停止飼喂12h, 活體解剖蝦取肝胰腺–80℃保存用于總RNA提取。用 qRT-PCR分析飼料銅/鋅水平對 mn-MT mRNA表達的影響。

1.7 統計分析

所有實驗數據的表示方式為平均值±標準差(Mean ± SD), 采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA), 若處理組間存在顯著差異, 再進行 Duncan’s多重比較, 顯著性差異設置水平為P＜0.05。

表2 實驗飼料配方和營養成分分析Tab. 2 Ingredients and approximate compositions of experimental diets (%)

2 結果

2.1 mn-MT序列特征

通過RACE技術, 克隆獲得mn-MT cDNA全長為665 bp(GenBank登錄號為KJ415090), 包括75 bp 的5′-非翻譯區、410 bp含polyA的3′-非翻譯區和180 bp的開放閱讀框(ORF)。ORF編碼59個氨基酸的多肽, 其蛋白質的理論分子量為6.085 kD、等電點為7.73。該蛋白中半胱氨酸含量最高, 達30.5%, 其次是賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸, 含量分別為16.95%、10.17%、8.47%和8.47%, 不含有芳香族氨基酸和組氨酸等, 含有無脊椎動物金屬硫蛋白的特征序列Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys和Cys-X-X-X-Cys。

NCBI的BLAST比對分析結果顯示, 日本沼蝦MT的氨基酸序列與其他無脊椎動物 MT氨基酸序列相似性較高, 其中與美洲海螯蝦(Homarus americanus)、斑節對蝦(Penaeus monodon)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的相似性分別達到78%、75%和75%。運用Mega 5.1軟件中NJ法對24種MT氨基酸序列構建系統發育樹(圖1)。發育樹中脊椎動物和無脊椎動物各分為一支, 在無脊椎動物分支中, 日本沼蝦與斑節對蝦、羅氏沼蝦(M. rosenbergii)等歸為一分支。

2.2 mn-MT在日本沼蝦不同組織中的表達

qRT-PCR結果顯示 mn-MT在所檢測的日本沼蝦各組織中都有表達, 其中肝胰腺中表達量最高并顯著高于所檢測的其他組織(P＜0.05), 其次是血細胞(P＜0.05), 鰓、胃、卵巢、腸和肌肉中表達量最低,有些組織甚至幾乎檢測不到(圖2)。

2.3 飼料銅/鋅水平對mn-MT mRNA表達的影響

qRT-PCR結果顯示, 日本沼蝦幼蝦肝胰腺 MT mRNA的表達水平隨飼料銅水平升高而升高, 到40 mg/kg組達到最大(P＜0.05), 而后開始下降, 0、20 和160 mg/kg組間的MT mRNA表達量沒有顯著差異(P＞0.05, 圖3)。飼料鋅水平也顯著影響日本沼蝦肝胰腺MT mRNA表達, 高鋅(210 mg/kg)顯著提高MT表達(P＜0.05), 0和 35 mg/kg組間差異不顯著(P＞0.05, 圖4)

3 討論

3.1 mn-MT分子特征

圖1 基于MT氨基酸序列建立的系統發育樹Fig. 1 The phylogenetic tree based on the sequences of metallothionein from different species

圖2 mn-MT基因在各組織的相對表達量Fig. 2 The expression of mn-MT in different tissues shown by qRT-PCR

圖3 飼料銅水平對mn-MT mRNA表達的影響Fig. 3 The effect of dietary copper on the relative expression of mn-MT

圖4 飼料鋅水平對mn-MT mRNA表達的影響Fig. 4 The effect of dietary zinc on the relative expression of mn-MT

MT是一種富含半胱氨酸的小分子量蛋白質,主要生理功能是重金屬解毒、清除自由基和參與一些微量元素代謝等[18—20]。本研究克隆mn-MT cDNA全長并分析其表達特征。mn-MT編碼的 59個氨基酸的多肽具有分子量小、半胱氨酸含量最高、賴氨酸和脯氨酸含量也相對較高等特征, 這與其他甲殼動物研究結果類似[21], 半胱氨酸殘基數與甲殼動物特有的18個半胱氨酸殘基數一致[22, 23]。在多肽序列中, 賴氨酸殘基多數伴隨著半胱氨酸殘基出現, 且含量僅次于半胱氨酸, 這可能與穩固金屬硫蛋白與金屬離子的相互作用有關[24]。mn-MT中的半胱氨酸分布也具有典型的無脊椎動物金屬硫蛋白的結構特征, 有5個Cys-X-Cys重復(CDC、CQC、CKC、CEC、CKC)、2個Cys-X-X-Cys重復(CTSC、CDPC)和3 個Cys-X-X-X-Cys重復(CKTGC、CASKC、CAKNC),這些結構的重復數與中華絨螯蟹 MT完全一致[25],但與斑節對蝦稍有差異[21]。mn-MT特征序列(CEKCASKCECS)與已報道的無脊椎動物 MT的特征序列(CKCXXXCXCX, X為除了半胱氨酸之外的其他氨基酸)只有一個氨基酸的差別。mn-MT中半胱氨酸的這些重復分布結構可能與金屬離子的螯合有關[26, 27]。

基于 MT氨基酸序列建立的系統發育樹中, 脊椎動物和無脊椎動物分為兩個獨立的分支, 這與傳統的分類學結果一致。mn-MT與其他甲殼動物 MT的相似性很高, 如與美洲海螯蝦和斑節對蝦的相似性分別達到78%和75%, 說明mn-MT很保守、同屬于甲殼動物家族的MT具有類似的特有序列、在進化上也相關[28]。

3.2 mn-MT在各組織種的表達

MT參與機體的多種生物過程[29], 所以研究者發現 MT在所檢測組織中基本都有表達, 而且不同物種中其組織表達有一定的差異。在脊椎動物中, MT在卵巢、睪丸、肝臟、腎臟、鰓、腸、大腦、眼中都有一定量的表達[4, 9]; 在無脊椎動物中, MT在肝胰腺、心臟、生殖腺、腎臟、神經組織和消化腺組織等表達量都較高[8, 24, 30—32]。在本研究中, mn-MT在所分析的蝦的肝胰腺、血細胞、胃、腸、卵巢、鰓和肌肉各組織中都有表達, 肝胰腺中表達量最高, 這與石蟹(Charybdis japonica)[31]、龍蝦(Homarus americanus)[30]、眼斑龍蝦(Panulirus argus)[8]和中華絨螯蟹[25]等結果類似, 可能是因為甲殼動物肝胰腺作為一種多功能器官, 在維持體內金屬元素動態平衡和解毒重金屬中毒方面所起的核心作用有關[33, 34]。mn-MT在卵巢中也有一定的表達,說明可能與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[35]、中華絨螯蟹[25]、斑節對蝦[21]類似, mn-MT在蝦發育中也起著重要作用, 但具體機制需要深入研究。

3.3 飼料中銅/鋅水平對mn-MT mRNA表達的影響

MT氨基酸組成中含有大量半胱氨酸, 對金屬離子具有高親和力, 其表達量受多種重金屬暴露的誘導[36]。大量研究顯示動物的金屬硫蛋白表達量受水體銅[8, 25]、鋅[8, 37]等金屬元素濃度的影響。如隨著水體暴露銅濃度的升高, 中華絨螯蟹MT mRNA表達表現出先升高后下降的趨勢[25]; 按3 mg/kg體重的劑量給大鼠腹腔單獨注射銅也會顯著提高其肝臟MT含量, 但飼喂銅含量為1.8 g/kg的飼料并不能提高大鼠 MT的表達, 作者認為可能是因為銅劑量太低或是時間太短不足以誘導MT的高表達[12]。據報道飼料中添加高鋅也可顯著提高大鼠肝臟[38]、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中腸[39]的MT水平。目前關于飼料中銅、鋅水平對甲殼動物金屬硫蛋白表達影響的還鮮有報道。本研究結果顯示日本沼蝦肝胰腺MT mRNA表達均受飼料銅、鋅水平的影響, 且都顯示出劑量依賴效應。mn-MT mRNA表達隨著飼料銅水平的升高而升高, 在40 mg/kg組達到最大, 而后呈下降趨勢, 與水體銅濃度對中華絨螯蟹 MT表達影響的變化趨勢類似[25]。同樣mn-MT表達也隨著飼料鋅水平的升高而升高, 高鋅組達到最高。徐振華等[40]研究發現飼料鋅水平也顯著影響新西蘭肉兔肝臟 MT表達水平, 且表現出先升高后下降的趨勢?？梢? 飼料鋅水平對機體 MT表達的影響存在物種差性, 且mn-MT表達隨飼料銅、鋅水平變化對也表現出不同劑量依賴效應, 具體機制還需進一步深入研究。

[1] Va?ák M. Advances in metallothionein structure and functions [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2005, 19(1): 13—17

[2] Lu J G, Xu J, Zhang P X, et al. Analysis of functional compensation of two different metallothionein subfamilies from Tetrahymena thermophila [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(2): 249—256. [盧劍功, 許靜, 張鵬幸, 等.嗜熱四膜蟲兩類不同金屬硫蛋白的功能補償分析. 水生生物學報, 2014, 38(2): 249—256]

[3] Margoshes M, Vallee B L. A cadmium protein from equine kidney cortex [J]. Journal of the American Chemical Society, 1957, 79(17): 4813—4814

[4] Gao A, Wang L, Yuan H. Expression of metallothionein cDNA in a freshwater crab, Sinopotamon yangtsekiense, exposed to cadmium [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(3): 253—258

[5] Hauser-Davis R A, Bastos F F, Tuton B, et al. Bile and liver metallothionein behavior in copper-exposed fish [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2014, 28(1): 70—74

[6] Lü D, Luo K Y, Pan B P, et al. Expression of metallothionein and thioredoxin gene in Cyclina sinensis exposed to cadmium [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012, 43(1): 47—51 [呂達, 羅凱婭, 潘寶平, 等. 青蛤(Cyclina sinensis)金屬硫蛋白及硫氧還蛋白基因的克隆與表達分析. 海洋與湖沼, 2012, 43(1): 47—51]

[7] Pedersen S N, Pedersen K L, Hojrup P, et al. Primary structures of decapod crustacean metallothioneins with special emphasis on freshwater and semi-terrestrial species [J]. Journal of Biochemistry, 1996, 319(3): 999—1003

[8] Moltó E, Bonzón-Kulichenko E, Arco A D, et al. Cloning, tissue expression and metal inducibility of an ubiquitous metallothionein from Panulirus argus [J]. Gene, 2005, 361: 140—148

[9] Cho Y S, Lee S Y, Kim K Y, et al. Gene structure and expression of metallothionein during metal exposures in Hemibarbus mylodon [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, 71(1): 125—137

[10] Watanabe T, Kiron V, Satoh S. Trace minerals in fish nutrition [J]. Aquaculture, 1997, 151(1—4): 185—207

[11] Wang W X, Rainbow P S. Significance of metallothioneins in metal accumulation kinetics in marine animals [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part C: Toxicology & Pharmacology, 2010, 152(1): 1—8

[12] Irato P, Albergoni V. Interaction between copper and zinc in metal accumulation in rats with particular reference to the synthesis of induced-metallothionein [J]. Chemico-Biological Interactions, 2005, 155(3): 155—164

[13] Kong Y Q, Ding Z L, Du Z Y, et al. Dietary copper requirement of juvenile oriental river prawn Macrobrachium nipponense, and its effects on growth, antioxidant activities and resistance to Aeromonas hydrophila [J]. The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh, IJA_66. 2014.1017, 11

[14] Guo J L, Chen J M, Sun L H, et al. Dietary zinc requirement of juvenile oriental river prawn (Macrobrachium nipponense) [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(3): 661—668 [郭建林, 陳建明, 孫麗慧, 等. 日本沼蝦幼蝦對飼料中鋅的需求量. 動物營養學報, 2013, 25(3): 661—668]

[15] Zhao D X, Song S H, Wang Q, et al. Discovery of immune-related genes in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) by expressed sequence tag analysis of haemocytes [J]. Aquaculture, 2009, 287(3—4): 297—303

[16] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCtmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402—408

[17] Li E C? Yu N, Chen L Q, et al. Dietary Vitamin B6requirement of the pacific white shrimp? Litopenaeus vannamei? at low salinity [J]. Journal of World Aquaculture Society, 2010, 41(5): 756—763

[18] Xiang D F, Zhu J Q, Jin S, et al. Expression and function analysis of metallothionein in the testis of Portunus trituberculatus exposed to cadmium [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 140—141: 1—10

[19] Felix-Portillo M, Martinez-Quintana J A, Peregrino-Uriarte A B, et al. The metallothionein gene from the white shrimp Litopenaeus vannamei: Characterization and expression in response to hypoxia [J]. Marine Environmental Research, 2014, 101: 91—100

[20] Siscar R, Koenig S, Torreblanca A, et al. The role of metallothionein and selenium in metal detoxification in the liver of deep-sea fish from the NW Mediterranean Sea [J]. Science of the Total Environment, 2014, 466—467: 898—905

[21] Zheng L M, Zhou F L, Yang Q B, et al. Molecular cloning and expression analysis of metallothionein from Penaeus monodon [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(6): 913—919 [鄭麗明, 周發林, 楊其彬, 等. 斑節對蝦金屬硫蛋白cDNA克隆與表達分析. 水生生物學報, 2011, 35(6): 913—919]

[22] Hamer D H. Metallothionein 1, 2 [J]. Annual Review of Biochemistry, 1986, 55: 913—951

[23] Peng J X, Fang Z F, Wei P Y, et al. Sequence and expression analysis of metallothionein from Litopenaeus vannmei [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(4): 678—683 [彭金霞,房振峰, 韋嬪媛, 等. 凡納濱對蝦 MT基因序列及其在卵巢發育和低溫脅迫中的表達分析. 水生生物學報, 2013, 37(4): 678—683]

[24] Cody C W, Huang P C. Replacement of all alpha-domain lysines with glutamates reduces metallothionein detoxification function [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994, 202(2): 954—959

[25] Ren F, Jiang H, Sun J L, et al. Cloning, characterization, expression, and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis [J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(4): 2383—2393

[26] Viarengo A, Nott J A. Mechanisms of heavy metal cation homeostasis in marine invertebrates [J]. Comparative Biochemistry & Physiology-Part C: Toxicology & Pharmacology, 1993, 104(3): 355—372

[27] Kagi J H, Schaffer A. Biochemistry of metallothionein [J]. Biochemistry, 1988, 27(23): 8509—8515

[28] Binz P A, K?gi J H R. Metallothionein: molecular evolution and classification [A]. In: Klaassen C (Eds.), Metallothionein IV [C]. Basel: Birkhauser Verlag. 1999, 7—13

[29] Mao H, Wang D H, Yang W X. The involvement of metallothionein in the development of aquatic invertebrate [J]. Aquatic Toxicology, 2012, 110—111: 208—213

[30] Zhang J Q, Wang J, Gui T S, et al. A copper-induced metallothionein gene from Exopalaemon carinicauda and its response to heavy metal ions [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 70: 246—250

[31] Mao H, Tan F Q, Wang D H, et al. Expression and function analysis of metallothionein in the testis of stone crab Charybdis japonica exposed to cadmium [J]. Aquatic Toxicology, 2012, 124—125: 11—21

[32] Aceto S, Formisano G, Carella F, et al. The metallothionein genes of Mytilus galloprovincialis: Genomic organization, tissue expression and evolution [J]. Marine Genomics, 2011, 4(1): 61—68

[33] Canli M, Stagg R M, Rodger G. The induction of metallothionein in tissues of the Norway lobster Nephrops norvegicus following exposure to cadmium, copper and zinc: the relationships between metallothionein and the metals [J]. Environmental Pollution, 1997, 96(3): 343—350

[34] Mouneyrac C, Amiard-Triquet C, Amiard J C, et al. Comparison of metallothionein concentrations and tissue distribution of trace metals in crabs (Pachygrapsus marmoratus) from a metal-rich estuary, in and out of the reproductive season [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part C: Toxicology & Pharmacology, 2001, 129(3): 193—209

[35] Meistertzheim A L, Lejart M, Go?c N L, et al. Sex-, gametogenesis, and tidal height-related differences in levels of HSP70 and metallothioneins in the Pacific oyster Crassostrea gigas [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2009, 152(2): 234—239

[36] Wang C L, Zhang F T, Cao W X, et al. The identification of metallothionein in rare minnow (Gobiocypris rarus) and its expression following heavy metal exposure [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2014, 37(3): 1283—1291

[37] Wu J P, Chen H C. Metallothionein induction and heavy metal accumulation in white shrimp Litopenaeus vannamei exposed to cadmium and zinc [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part C: Toxicology & Pharmacology, 2005, 140(3—4): 383—394

[38] Irato P, Albergoni V. Interaction between copper and zinc in metal accumulation in rats with particular reference to the synthesis of induced-metallothionein [J]. Chemico-Biological Interactions, 2005, 155(3): 155—164

[39] Shu Y H, Zhang G R, Wan J W. Response of the common cutworm Spodoptera litura to zinc stress: Zn accumulation, metallothionein and cell ultrastructure of the midgut [J]. Science of the Total Environment, 2012, 438: 210—217

[40] Xu Z H, Li F C, Qin Y H. Effects of dietary Zn levels on the production performance, antioxidase activity in serum and liver, and metallothionein (MT)-1 mRNA expression of growing rabbits [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2008, 20(3): 337—342 [徐振華, 李福昌, 秦應和. 日糧鋅水平對生長肉兔生產性能、血清肝臟抗氧化酶活性和金屬硫蛋白-1基因表達的影響. 動物營養學報, 2008, 20(3): 337—342]

MOLECULAR CLONING, TISSUE-SPECIFIC EXPRESSION AND RELEVANCE TO DIETARY COPPER AND ZINC OF GENE METALLOTHIONEIN IN MACROBRACHIUM NIPPONENSE

KONG You-Qin1, 2, CHEN Li-Qiao1, DING Zhi-Li1, 2, LI Er-Chao1, YE Jin-Yun2and DU Zhen-Yu1
(1. College of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development, College of Life Sciences, Huzhou University, Huzhou 313000, China)

Metallothionein (MT) is a metal binding protein with low molecular weight. The expression of MT can be induced by minerals such as copper or zinc, and it is involved in the metabolism of trace elements. To better understand the physiological and nutritional effects of copper and zinc on Macrobrachium nipponense, we cloned mn-MT from the oriental river prawn using rapid amplification of the cDNA ends (RACE), and evaluated the effects of dietary copper and zinc on the expression of MT. The full length of mn-MT cDNA was 665 bp, and it had a 180 bp open reading frame (ORF) encoding a 59aa peptide. The calculated molecular weight of the peptide was 6.085 kD and the predicted isoelectric point was 7.73. The most abundant amino acid in this protein was cysteine residues (30.5%), followed by lysine (16.95%) and serine (10.17%). The similarity analysis showed that mn-MT shared the similarities of 78%, 75% and 75% with the counterparts in the Homarus americanus, Penaeus monodon and Eriocheir sinensis respectively. Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) analysis showed that the mn-MT mRNA was expressed in the hepatopancreas, gill, hemocytes, intestine, ovary, muscles and stomach, with the highest level in the hepatopancreas. M. nipponense were fed for 56 days with seven different diets supplemented with Cu at 0, 20, 40 and 160 mg/kg diet and Zn at 0, 35, 210 mg/kg diet, and then we analyzed the expression of mn-MT mRNA in the hepatopancreas. The expression of mn-MT mRNA was first elevated along with the increase in dietary Cu level, reached to the maximum at 40 mg/kg diet, and then dropped as the Cu concentration was further increased. The expression of mn-MT mRNA was higher in prawns fed with high Zn (210 mg/kg diet) than that in prawns fed with 35 mg Zn/kg diet or 0 mg Zn/kg diet (P＜0.05). There was no significant difference between the 0 mg Zn/kg group and the 35 mg Zn/kg group (P＞0.05). These results suggested that the expression of mn-MT mRNA could be affected by dietary copper and zinc with different dose-dependent response curves.

Macrobrachium nipponense; Metallothionein; Copper; Zinc; mRNA expression

S966.1

A

1000-3207(2015)06-1126-08

10.7541/2015.148

2014-11-20;

2015-03-10

公益性行業(農業)科研專項(201003020, 201203065);“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD25B00); 國家自然科學基金項目(31172422); 上海市科委重點項目(10JC1404100); 浙江省自然科學基金項目(LQ14C190004)資助

孔有琴(1977—), 女, 浙江長興人; 博士; 主要從事水產動物營養與飼料研究。E-mail: susankuq@hutc.zj.cn

陳立僑, 教授, 博士生導師; E-mail: lqchen@bio.ecnu.edu.cn