CuSO4和ZnSO4對尼羅羅非魚N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響

張偉妮 謝璐娜 黃小紅

(福建農林大學, 中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室, 福州 350002)

CuSO4和ZnSO4對尼羅羅非魚N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響

張偉妮 謝璐娜 黃小紅

(福建農林大學, 中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室, 福州 350002)

以分離自尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)精巢的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52, NAGase)為研究對象, 探討了兩種水產常用藥物CuSO4和ZnSO4對NAGase的影響。研究結果表明CuSO4和ZnSO4對該酶抑制的 IC50分別為(1.23±0.05)和(0.28±0.02) mmol/L, 都能改變酶的構象從而影響到其內源熒光的發射。這兩種藥物對該酶的抑制機理均為可逆抑制, 其中CuSO4對酶的抑制類型為非競爭型, ZnSO4為競爭型,且均能明顯影響該酶的pH穩定性和熱穩定性。研究結果為羅非魚養殖過程中CuSO4和ZnSO4的使用和監控提供了參考。

尼羅羅非魚; N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶; CuSO4; ZnSO4

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, EC 3.2.1.52, 簡稱NAGase), 隸屬于糖基水解酶家族, 是廣泛存在于微生物、植物和動物體內的一種重要的溶酶體酶, 主要水解各種糖分子內以β-1,4-糖苷鍵連接的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷鍵[1, 2]。即使在動物體內, 該酶的功能也因機體的不同或同一機體部位的不同而千差萬別[2]。例如,在節肢動物, 該酶參與了孵化、消化和蛻皮過程[3, 4]。在人類, N-乙酰-β-D-氨基己糖苷酶A可以降解腦和外周神經組織的GM2神經節苷脂, 缺少這種酶會導致神經障礙的出現[5]。然而, 更多研究表明該酶的功能與動物的繁殖過程有關。在哺乳動物中, NAGase能夠調節生殖細胞的活性, 參與以酶解為基礎的精子對卵母細胞透明帶的滲透及精子最初與卵母細胞膜的結合[6]。海鞘的卵子受精時釋放的 NAGase被認為可能通過改變卵子表面精子受體的糖蛋白從而阻止多精入卵[7]。Sarosiek等[8]研究指出, 抑制虹鱒(Oncorhynchus mykiss)精子NAGase的活力會直接減少受精卵的數量, 且虹鱒和西伯利亞鱘(Acipenser baerii)的精子和卵子中 NAGase的活力下降, 更會直接降低受精率。

硫酸銅和硫酸鋅均為重金屬鹽類, 其水溶液中游離的二價金屬離子, 能阻礙寄生蟲的生理代謝最終起到殺蟲或抑制其增殖的作用, 因此往往作為傳統的殺蟲藥和水質凈化劑在水產養殖過程中被廣泛應用[9—11]。其中硫酸銅的使用方式為 0.5—0.7 mg/L全池潑灑或 8 mg/L浸浴, 硫酸鋅潑灑濃度為 0.3—2.8 mg/L、浸浴濃度為200 mg/L[9]。另外, 地殼元素的自然釋放和人為活動的影響也是水中銅和鋅的主要來源[12]。藥物的使用和環境的污染常使得養殖水體中銅和鋅的含量超標, 從而被養殖動物富集進而威脅其生存。本文以分離自“新吉富”尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)精巢的 NAGase為研究對象, 以 CuSO4和ZnSO4為效應物, 研究其對該酶的影響, 旨在為羅非魚的健康養殖管理和科學合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

經40%—55%的硫酸銨分級沉淀、DEAE纖維素(DE-32)離子交換層析、Sephadex G-200凝膠過濾層析、DEAE-Sephadex(A-50)層析柱從“新吉富”尼羅羅非魚精巢組織分離純化得到比活力為4100 U/mg、

PAGE檢測為單一純的 NAGase制劑[13], 作為本實驗的實驗材料。

1.2 試劑

對-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, pNP-NAG)購自上海醫藥工業研究所, CuSO4和 ZnSO4購自國藥集團化學試劑有限公司, 其他試劑均為國產分析純。所有溶液均采用雙蒸去離子水配制。

1.3 對尼羅羅非魚NAGase活力的影響

活力測定參照文獻[14]的方法進行。在37℃下, 0.1 mol/L的磷酸鹽測活體系(pH 5.7, 含0.2 mmol/L pNP-NAG)中, 加入不同濃度的CuSO4和ZnSO4, 以不加藥物的作對照, 測定這兩種常用藥物對羅非魚NAGase活力的影響。重復測定3次。

1.4 對尼羅羅非魚NAGase熒光發射光譜的影響

分別在3 mL含不同CuSO4和ZnSO4的磷酸鹽緩沖液中(pH 5.7)中, 加入一定量的羅非魚NAGase,混合均勻, 4℃放置30min后, 以波長285 nm的熒光為激發光, 用Hitachi F-4010型熒光分光光度計掃描記錄波長為300—400 nm的羅非魚NAGase的熒光發射光譜。以不含酶的對應緩沖液做空白對照。

1.5 對尼羅羅非魚NAGase的抑制機理

在含不同濃度CuSO4和ZnSO4的上述測活體系中, 改變加入的酶量, 研究剩余酶活力與酶量之間的關系, 探討這兩種常用藥物對該酶抑制作用的機理。

1.6 對尼羅羅非魚NAGase的抑制類型

固定反應體系溫度為 37 , ℃ 在 pH 5.7 磷酸鹽的測活體系中, 改變底物[S]濃度, 固定酶量為8 μg/mL, 探討不同濃度的CuSO4和ZnSO4對該酶催化底物水解反應的影響, 測定酶促反應的初速度, 以Lineweaver-Burk雙倒數法作圖, 測定其對羅非魚NAGase的抑制類型和抑制常數。

1.7 對尼羅羅非魚NAGase熱穩定性和pH穩定性的影響

分別在酶液中加入一定濃度的CuSO4和ZnSO4,放置不同溫度下(5—80 )℃保溫 30min, 測定酶的剩余活力, 以酶的剩余活力對保溫溫度作圖, 確定其對該酶熱穩定性的影響。

取10 μL酶液與含有不同濃度CuSO4和ZnSO4的緩沖液(pH 2.1—10.6)等體積混合, 4℃放置24h后,正常測活體系下測定處理后酶的剩余活力, 確定其對該酶pH穩定性的影響。

2 結果

2.1 CuSO4和 ZnSO4對尼羅羅非魚 NAGase活力的影響

通過測定CuSO4和ZnSO4對尼羅羅非魚NAGase活力的影響, 發現這兩種藥物對該酶均表現出強抑制作用。在3 mmol/L的濃度下, 兩種藥物對該酶抑制率已經達到80%以上, CuSO4和ZnSO4導致該酶活力降低 50%的 IC50分別為(1.23±0.05)和(0.28± 0.02) mmol/L(圖1A)。

2.2 CuSO4和 ZnSO4對尼羅羅非魚 NAGase熒光發射光譜的影響

圖1 CuSO4和ZnSO4對尼羅羅非魚NAGase的影響Fig. 1 Effects of CuSO4and ZnSO4on tilapia NAGase

在3 mL含不同濃度CuSO4的磷酸鹽緩沖液中(pH 5.7)中, 加入30 μL尼羅羅非魚NAGase, 混合均勻, 4℃放置30min后, 以波長285 nm的熒光為激發光, 用Hitachi F-4010型熒光分光光度計掃描記錄該酶的熒光發射光譜, 以含有不同濃度 CuSO4的緩沖液做空白對照, 研究其對尼羅羅非魚 NAGase熒光發射光譜的影響。結果如圖1B所示, 天然酶的熒光發射峰值在338 nm處, 隨著CuSO4濃度的增大,該酶的熒光發射峰值迅速降低, 當 CuSO4濃度增大到50 μmol/L時, 該酶的特征性熒光發射峰已經消失。

同法探討ZnSO4對羅非魚NAGase熒光發射光譜的影響, 結果如圖1C所示。隨著ZnSO4濃度的增大, 該酶的熒光發射強度反而升高, 而且出現明顯的紅移現象, 當ZnSO4濃度增大至100 mmol/L時,該酶的特征性熒光發射峰值紅移至350 nm處。

2.3 CuSO4和 ZnSO4對尼羅羅非魚 NAGase的抑制機理

在含不同濃度CuSO4(0、0.5、1、1.5和2 mmol/L)的測活體系(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液, pH 5.7, 含0.2 mmol/L pNP-NAG)中, 改變加入的酶量, 以剩余酶活力對加入的酶量作圖, 得到一組通過原點的直線(圖2A)。且隨著CuSO4濃度的增大, 直線的斜率降低。這說明在測試濃度范圍內, CuSO4對尼羅羅非魚NAGase的抑制是可逆的。同樣方法測得ZnSO4在測試的濃度范圍內(0—0.3 mmol/L), 對尼羅羅非魚NAGase的抑制也是可逆過程(圖2B)。

2.4 CuSO4和 ZnSO4對尼羅羅非魚 NAGase的抑制類型

進一步通過改變CuSO4濃度(0、0.5、1、1.5和2 mmol/L), 測定CuSO4存在的條件下不同底物濃度對酶促反應的影響效果, 從而研究 CuSO4對尼羅羅非魚 NAGase的抑制作用類型。通過 Lineweaver-Burk雙倒數作圖得到交于橫坐標軸的一組直線(圖3A), 說明 CuSO4對該酶催化底物水解反應的米氏常數 Km不產生影響, 只影響其最大反應速度 Vm,酶促反應的催化速度隨著抑制劑CuSO4濃度的增加而逐漸降低, CuSO4對羅非魚NAG酶的抑制作用表現為非競爭型抑制。以1/v－1/[S]關系圖中直線的斜率(Slope)對抑制劑 CuSO4濃度作圖得到一條直線(圖3A內插圖), 通過直線橫軸截距求得CuSO4對該酶的抑制常數KI為1.11 mmol/L。

在0、0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L的ZnSO4濃度下, 改變底物的量, 研究 ZnSO4對尼羅羅非魚NAGase的抑制作用類型, 通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖得到交于縱軸的一組直線(圖 3B), 說明ZnSO4濃度改變并不會影響酶促反應的最大反應速度Vm值, 而是影響米氏常數Km值, 且Km隨著抑制劑ZnSO4濃度的增大而增大, 由此可見ZnSO4對該酶的抑制作用屬于競爭型抑制。底物與ZnSO4可以競爭性地結合在自由酶分子上, ZnSO4的存在不影響該酶催化底物反應的速度, 而是影響其與底物的親和力。以 Km值對抑制劑 ZnSO4濃度作圖得到一條直線(圖 3B內插圖), 通過直線橫軸截距求得ZnSO4對該酶的抑制常數KI為0.20 mmol/L。

2.5 CuSO4對尼羅羅非魚NAGase熱穩定性和pH穩定性的影響

圖2 CuSO4(A)和ZnSO4(B)對尼羅羅非魚NAGase的抑制機理Fig. 2 The mechanism of CuSO4(A) and ZnSO4(B) on NAGase

在0、0.01和 0.02 mmol/L CuSO4存在的條件下, 將尼羅羅非魚 NAGase放置在不同溫度下(5—80 )℃ 保溫 30 min后, 測定酶的剩余活力, 研究CuSO4對該酶熱穩定性的影響。如圖 4(A)所示, 在不含CuSO4的情況下, 羅非魚NAGase在低于45℃時都是穩定的, 當溫度達到 70℃時酶活力才完全喪失; 當CuSO4濃度為0.01 mmol/L時, 該酶只在低于20℃時保持穩定, 當溫度達到 50℃時酶活力完全喪失; 當CuSO4濃度達到0.02 mmol/L時, 該酶的穩定范圍縮小至低于10 , ℃ 酶活力在35℃時即已完全喪失。

在0、0.02和 0.04 mmol/L CuSO4存在的條件下, 將尼羅羅非魚NAGase放置在等量不同pH的緩沖液(pH 2.1—10.6)中4℃放置24h后測定酶的剩余活力, 研究 CuSO4對該酶 pH穩定性的影響。如圖4(B)所示, 在不含CuSO4的情況下, 羅非魚NAGase的pH穩定范圍很廣, 達到3.3—8.1; 隨著CuSO4濃度的增加, 該酶的pH穩定范圍在堿性區域內變窄。當CuSO4濃度為0.02 mmol/L時, 該酶的pH穩定范圍縮小至3.3—6.9; 當CuSO4濃度為0.04 mmol/L時,該酶的pH穩定范圍僅為3.3—6.3。

2.6 ZnSO4對尼羅羅非魚NAGase熱穩定性和pH穩定性的影響

在0、0.01和 0.05 mmol/L ZnSO4存在的條件下,探討ZnSO4對該酶熱穩定性的影響。如圖5(A)所示,在不含 ZnSO4的情況下, 尼羅羅非魚 NAGase在4 5℃以下時都是穩定的; 當 Z n S O4濃度為0.01 mmol/L時, 該酶只在低于 30℃時保持穩定, 45℃時酶活力僅存約15%, 當溫度達到50℃時酶活力完全喪失; 當ZnSO4濃度達到0.05 mmol/L時, 該酶活力從25℃已開始下降, 酶活力在45℃時即已完全喪失。

圖3 CuSO4(A)和ZnSO4(B)對酶的抑制類型Fig. 3 Inhibition type of CuSO4(A) and ZnSO4(B) on tilapia NAGase by Lineweaver-Burk plots

圖4 CuSO4對酶熱穩定性(A)和pH穩定性(B)的影響Fig. 4 Effects of CuSO4on thermal stability (A) and pH stability (B) of tilapia NAGase

圖5 ZnSO4對酶熱穩定性(A)和pH穩定性(B)的影響Fig. 5 Effects of ZnSO4on thermal stability (A) and pH stability (B) of tilapia NAGase

在0、0.05和 0.2 mmol/L ZnSO4存在的條件下,將尼羅羅非魚NAGase放置在等量不同pH的緩沖液(pH 2.1—10.6)中4℃放置24h后測定酶的剩余活力,研究ZnSO4對該酶pH穩定性的影響。如圖5B所示,隨著ZnSO4濃度的增加, 該酶的pH穩定范圍在堿性區域內變窄, 當ZnSO4濃度為0.05 mmol/L時, 該酶的pH 穩定范圍縮小至 3.3—6.3; 當 ZnSO4濃度為0.2 mmol/L時, 該酶的pH穩定范圍僅為3.3—5.7。

3 討論

熒光發射光譜實驗表明, CuSO4的加入導致了該酶特征性熒光發射光譜的消失, 說明 CuSO4使酶的構象發生了改變。而且比較圖 1A和圖 1B發現, CuSO4為500 μmol/L時該酶的特征性熒光發射峰早已經消失, 而此時酶活力尚有 80%, 說明 CuSO4使酶的構象變化要快于使酶的活力變化, 揭示維持該酶構象穩定的某些基團比酶水解底物的基團對CuSO4更敏感。這與 CuSO4對鋸緣青蟹(Scylla serrata)NAGase的作用效果是一致的[15]。而隨著ZnSO4濃度的增大, 該酶的熒光發射強度反而升高, 說明ZnSO4與酶分子的結合可能更好地暴露了該酶分子的熒光發射基團。

筆者之前的試驗已經證明SO42ˉ、Clˉ、NOˉ3等酸根并不會影響尼羅羅非魚 NAGase的活力, 說明試驗結果是由金屬離子造成的[13]。重金屬離子對許多酶都有抑制作用, 往往會使酶變性失活, 然而其對酶的抑制類型卻各不相同。本文發現CuSO4對羅非魚 NAGase 的抑制類型為非競爭型, 說明底物和Cu2+與酶結合的部位不同, 酶與底物的結合并不影響Cu2+的結合位點, 反之亦然。這與Cu2+對鋸緣青蟹NAGase的競爭型抑制不同[15]。

Xie等[16]發現在一定濃度內 Zn2+對分離自南美白對蝦的 NAGase表現為可逆的非競爭型抑制; Zhang等[17]報道Zn2+對鋸緣青蟹NAGase為混合型抑制; 而筆者之前研究發現 Zn2+對于克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)NAGase則為反競爭型抑制[18]。本文結果顯示ZnSO4對尼羅羅非魚NAGase 表現為競爭型抑制效應, 這說明 Zn2+與該酶的結合位點可能和底物與該酶的結合位點相同, 或者 Zn2+與底物雖不是結合在酶的同一位點, 但當 Zn2+結合在該酶分子上時, 酶分子發生了空間構象的變化, 使得底物與該酶的結合受阻; 反之, 底物與酶的結合也可以導致Zn2+與酶的結合受阻。即使是同種金屬離子對不同來源的特定酶, 其抑制作用也不盡相同, 具體機理還有待于進一步研究。

本實驗還發現CuSO4和ZnSO4都可以顯著縮短尼羅羅非魚NAGase的熱穩定性和pH穩定性且呈濃度依賴關系, 但跟其對酶活力的影響相比, CuSO4對其穩定性的影響要快于 ZnSO4, 可能也是由于低濃度的CuSO4即可使酶的構象發生變化從而引起酶穩定性的急劇變化。

低于 μg/L的低劑量 Cu2+即可在魚體內臟器官中富集造成內臟器官一定程度的損傷[19], 且已被證明可以在泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)卵巢中蓄積, 造成卵細胞的DNA損傷[20]; 而Zn2+也已被證實會造成雄性動物生殖系統的組織損傷和功能降低[21]。本實驗發現Cu2+和Zn2+對尼羅羅非魚精巢NAGase也有明顯的抑制作用, 其對羅非魚生殖功能的影響還有待深入研究。

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EFFECTS OF CuSO4AND ZnSO4ON N-ACETYL-β-D-GLUCOSAMINIDASE FROM OREOCHROMIS NILOTICUS

ZHANG Wei-Ni, XIE Lu-Na and HUANG Xiao-Hong
(University Key Lab for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcare in Fujian Province, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (EC 3.2.1.52, NAGase), hydrolyzing the oligomers of N-Acetyl-β-D-glucosamine (NAG) into monomer, is correlated with animal reproduction. In the current study, we investigated the effect of two common drugs (CuSO4and ZnSO4) on NAGase from spermary of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). The results showed that the IC50of CuSO4and ZnSO4were (1.23±0.05) mmol/L and (0.28±0.02) mmol/L, respectively. Both CuSO4and ZnSO4regulated the conformation of tilapia NAGase, which affected the fluorescence emission of the enzyme. The inhibitory activities of these two drugs were reversible, and the inhibition type of CuSO4was noncompetitive but ZnSO4was competitive. Both CuSO4and ZnSO4had significant influences on the thermal and pH stability of the enzyme. The results contribute to the use and control of CuSO4and ZnSO4in tilapia culture.

Oreochromis niloticus; N-acetyl-β-D-glucosaminidase; CuSO4; ZnSO4

Q556.2

A

1000-3207(2015)06-1093-07

10.7541/2015.144

2014-11-23;

2014-12-28

福建省科技重點項目(2012N0002)資助

張偉妮(1980—)女, 山東招遠人; 博士; 主要從事水產動物疾病學方面的研究。E-mail: weinizhang@hotmail.com

黃小紅(1966—), 女, 福建建甌人; 教授, 博士; 主要從事動物生物化學方面的研究。E-mail: xhhuang@vip.sina.com