大鱗副泥鰍仔稚魚生長與消化酶活性變化

劉亞秋 郭忠娣 胡 雨 高勝濤 王志堅

(西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 水產科學重慶市市級重點實驗室,重慶 400715)

研究簡報

大鱗副泥鰍仔稚魚生長與消化酶活性變化

劉亞秋 郭忠娣 胡 雨 高勝濤 王志堅

(西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 水產科學重慶市市級重點實驗室,重慶 400715)

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)隸屬于鯉形目,鰍科, 花鰍亞科, 副泥鰍屬, 主要分布于長江中下游[1]。其肉質鮮美, 營養豐富。近年來, 大鱗副泥鰍的市場需求量逐年上升, 人工養殖規模不斷擴大, 對大鱗副泥鰍魚苗的需求量也逐漸增加。但是, 大鱗副泥鰍苗種階段的高死亡率,成為了規?；斯ど唐肤~養殖生產的巨大阻礙。掌握大鱗副泥鰍仔稚魚發育過程中攝食和消化的變化規律, 對于其苗種培育十分必要。消化酶活力是衡量仔稚魚營養狀況的重要的指標[2—4]。目前, 有關海水魚類消化酶發育的研究較多[5—7], 而有關淡水魚類的相關研究相對較少。大鱗副泥鰍仔稚魚發育過程中消化酶活性變化的研究還沒有報道。本研究探究了仔稚魚的生長過程和主要消化酶活性變化過程, 為大鱗副泥鰍苗種培育技術開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

大鱗副泥鰍初孵仔魚由重慶市墊江水產站提供, 所獲仔魚均由同一批受精卵于4月20日孵化出膜, 飼養50d, 于6月10日結束, 魚苗飼養于容積100 L的3個循環水族缸內, 每個水族缸內飼養2000尾。5 DAH (日齡, Day after hatching)仔魚開始投喂豐年蟲(天津市丹陽水產科技有限公司), 10 DAH之后投喂混合餌食(豐年蟲, 微顆粒S1飼料)20 DAH后全部投喂微顆粒S1飼料(山東升索漁業飼料研究中心), 投喂之前清除污物。飼養期間每天飽食投喂4次, 投喂時間為7:00、12:00、17:00和22:00。

1.2 飼養條件

飼養期間, 每天 8:00、14:00和 20:00測量水溫取平均值, 循環水族缸水溫變化范圍為 20.5—25.5℃, 循環水族缸保持24h充氧, 溶氧保持在(7.21±0.63) mg/L。

1.3 樣品采集

全長與體重測量時間安排為1、2、3、4、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45和50 DAH(孵化當日記為 0 DAH), 并選取 1、2、3、4、5、7、9、12、15、20、25、30和45 DAH樣品用于測量消化酶活性測定。為了準確測量魚體內消化酶活性, 實驗在中午 12:00投喂完以后2h取樣, 從3個水族缸中隨機撈取魚苗分別放入裝有清水的不同燒杯中, 1h后撈出, 各取10尾測量全長, 稱總體重。稱量過程中樣本置于冰上, 以免消化酶失活。20 DAH之前樣品取全魚, 20 DAH開始的樣品去除頭部和尾部, 僅保留軀干。樣品立即置于–80℃超低溫冰箱保存, 用于進一步消化酶測定。

1.4 特定生長率的測定

根據樣品總質量計算個體的平均質量。特定生長率的計算公式: SGR=100×(lnFBW–lnIBW)/T, 其中FBW為個體終末體量(g), IBW為個體初始體重(g), T為時間(d)。

1.5 可溶性蛋白含量和消化酶活性的測定

從冰箱中取出待測樣品, 置于冰上解凍。解凍完成后將樣品稱重, 按質量 ∶體積為 1∶4加入勻漿稀釋液, 以勻漿器進行勻漿。所得勻漿液用低溫超速離心機 4℃, 3000 r/min轉速離心20min后取上清液用于消化酶活力測定。實驗中的消化酶及可溶性蛋白均使用南京建成公司生產的試劑盒檢測。在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白質中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003定義為1個胰蛋白酶活力單位。在 37℃條件下, 每克組織蛋白在反應體系中與底物反應1min, 每消耗1 μmol底物定義為1個脂肪酶活力單位。組織中每毫克蛋白在 37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位。每克組織蛋白在37℃與基質作用15min產生1 mg酚定義為1個堿性磷酸酶活力單位。實驗中測定酶的全活力表示為1個個體所含有的酶活力單位的量(U/larva); 酶的比活力表示為 1 mg可溶性蛋白所含有的酶活力單位的量(U/mg protein)。本實驗使用全波長酶標儀(Thermo)和紫外分光光度計(UV-2450)測定吸光度。

1.6 數據分析

采用單因子方差分析(ANOVA)檢驗不同測定日期間可溶性蛋白含量和各消化酶活性差異顯著性。如差異顯著,則采用多重比較方法比較平均數之間的差異。顯著性水平為0.05。數據分析采用SPSS 17.0統計軟件進行。實驗數據均用平均值±標準差(means± SD)表示。

2 結果

2.1 生長以及投喂狀況

大鱗副泥鰍仔稚魚經過 50d飼喂后, 其生長情況如圖1所示。體重由0.70 mg增至998 mg。特定生長率為14.52%, 全長由3.25 mm增至55.24 mm。在發育過程中,全長和體重分別呈線性和指數形式增長, 擬合方程分別為: y=1.1129x(R2=0.9914)和y= 0.0014e0.1536x(R2=0.9244)。

2.2 可溶性蛋白含量

大鱗副泥鰍仔稚魚的可溶性蛋白含量的變化情況如圖2所示, 在1—3 DAH, 可溶性蛋白含量下降, 并3 DAH時到達最小值(0.16±0.01) mg/mL。5 DAH后, 可溶性蛋白質含量快速上升, 15 DAH后顯著下降, 20 DAH后蛋白質含量逐漸增加, 45 DAH時達到(1.58±0.05) mg/mL。

2.3 消化酶的全活力

大鱗副泥鰍仔稚魚消化酶全活力的變化如圖3所示。初孵仔魚均可檢測到淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶以及堿性磷酸酶活性。仔魚淀粉酶全活力在1—15 DAH緩慢上升, 在15 DAH后快速上升, 30 DAH后趨于穩定。脂肪酶全活力在1—9 DAH變化不顯著(P＞0.05), 9—15 DAH緩慢上升, 15 DAH 后顯著上升(P＜0.05), 45 DAH 達到(0.40±0.05) U/larva。胰蛋白酶全活力在1—5 DAH無顯著變化(P＞0.05), 5 DAH后緩慢上升, 15 DAH后顯著升高(P＜0.05), 30 DAH增長速度變慢, 漸趨于穩定。堿性磷酸酶全活力從1 DAH至15 DAH逐漸增加, 到20 DAH顯著上升(P＜0.05)。到30 DAH以后上升速度逐漸變慢。

2.4 消化酶比活力

圖1 大鱗副泥鰍仔稚魚個體全長和體重隨日齡變化Fig. 1 Total length and body weight of Paramisgurnus dabryanuslarvae and juveniles during the experiment

圖2 大鱗副泥鰍仔稚魚可溶性蛋白含量隨日齡變化曲線Fig. 2 Fluctuation of souble protein content of Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

圖3 大鱗副泥鰍仔稚魚發育過程中消化酶全活力變化曲線Fig. 3 Fluctuations of total activities of digestive enzymes for Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

大鱗副泥鰍仔稚魚發育過程中消化酶比活力變化曲線如圖4所示。淀粉酶比活力1—5 DAH間快速上升, 5 DAH達到峰值(2.65±0.09) U/mg protein。隨后淀粉酶比活力顯著下降(P＜0.05), 到 15 DAH, 淀粉酶比活力下降至(0.87±0.04) U/mg protein。20 DAH淀粉酶比活力小幅上升(1.33±0.02) U/mg protein, 隨后又緩慢下降, 30 DAH后趨于穩定。脂肪酶比活力在5 DAH和20 DAH有兩個明顯的峰值分別為(0.32±0.02)和(0.84±0.13) U/mg protein,分別是仔魚卵黃囊耗盡, 由混合營養期向外源性營養期轉變以及仔魚向稚魚轉變關鍵點。5—15 DAH比活力呈現一定的波動, 并在 9 DAH出現一個最小值(0.13±0.02) U/mg protein。20 DAH之后比活力顯著下降(P＜0.05), 到25 DAH趨于穩定。胰蛋白酶比活力1—7 DAH間快速升高, 7 DAH達到最大值(78.97±8.09) U/mg protein, 隨后顯著下降(P＜0.05), 到15 DAH降至最低點(10.12±0.90) U/mg protein; 25 DAH后, 比活力逐漸趨于平穩。堿性磷酸酶比活力從2 DAH開始顯著上升(P＜0.05), 在5 DAH達到最大值(0.78±0.05) U/mg protein, 之后迅速降低, 15 DAH降至最低值(0.22±0.06) U/mg protein, 20 DAH到另一個峰值(0.36±0.04) U/mg protein, 到25 DAH, 比活力趨于穩定狀態。

3 討論

在本實驗(21.5±1.50)℃條件下, 大鱗副泥鰍仔稚魚的生長較梁秩 燊等[8]報道要慢, 可能是因為本實驗中養殖水溫較低的原因所致(后者實驗溫度為25℃以上)。仔魚發育到出膜后5 DAH開始投喂豐年蟲, 并能在體視顯微鏡下檢測到消化管中豐年蟲的存在?？扇苄缘鞍缀吭? DAH降至最低, 5 DAH后開始上升。1—3 DAH, 仔魚尚未開口, 主要由卵黃囊里的營養物質為其生長發育提供能量, 隨著卵黃蛋白不斷消耗, 總蛋白含量呈下降趨勢。5 DAH開始投喂, 仔魚蛋白含量開始明顯上升。因此, 可溶性蛋白含量變化過程與仔稚魚魚營養方式轉換過程相關。

本研究大鱗副泥鰍1 DAH仔魚中檢測出淀粉酶, 胰蛋白酶, 脂肪酶, 堿性磷酸酶的活性。其他一些淡水和海水魚類, 例如塞內加爾鰨( Solea senegalensis)[9]、細點牙鲆 (Dentex dentex)[7]、 斑 帶 副 鱸 (Paralabrax maculatofasciatus)[10]、黃尾(Seriola lalandi)[11]、胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)[12]、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[13]等, 在開口前也可以檢測到消化酶的活性。這表明消化酶的發生并不是外源食物的誘導, 可能是受到魚類自身基因的調控[7, 10, 14, 15]。

大鱗副泥鰍仔魚消化酶全活力和比活力表現出完全不同的變化模式, 全活力的上升趨勢, 而比活力呈先上升后下降的變化趨勢, 這與仔魚體內可溶性蛋白的累積有關[9]。在實驗中, 5 DAH初次投喂后, 胰蛋白酶活力顯著上升, 并在7 DAH達到最大值。這說明外源食物對于胰蛋白酶分泌起到了一定刺激作用[16]。7—15 DAH胰蛋白酶活力顯著下降, 這一方面是由于大鱗副泥鰍體內的可溶性蛋白的累積[5], 另一方面是由于消化器官尚未發育完全。在仔魚開始攝食后, 消化酶活性主要受到消化器官發育的影響。在20 DAH達到峰值后逐漸下降, 25 DAH后趨于穩定。20 DAH是大鱗副泥鰍仔魚向稚魚轉變的關鍵點。胰蛋白酶的全活力在此期間快速增加。證明了在這一時期仔魚消化體系更加完善。

圖4 大鱗副泥鰍仔稚魚發育過程中消化酶比活力變化曲線Fig. 4 Fluctuations of specific activities of digestive enzymes for Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

有學者研究表明早期仔魚體內存在脂酶和磷脂酶 A2兩種不同類型的脂肪酶。磷脂酶 A2可被磷脂激活, 而仔魚的卵黃囊富含磷脂, 脂酶能被三酸甘油酯激活, 它的活性與外源食物中脂肪消化密切相關[17, 18]。初次攝食后脂肪酶比活力顯著下降是這兩種脂肪酶相互轉變引起的[5, 10]。5—15 DAH脂肪酶比活力呈現一定的波動變化后開始顯著上升, 這是由于胰腺外分泌功能以及利用食物中脂肪能力增強所致[2]。20 DAH之后顯著下降后趨于穩定。這可能是魚體自身對于食物攝入量的變化和可溶性蛋白沉積所致[19]。

仔魚在開口攝食之前, 淀粉酶已具有較高的比活力。這與卵黃囊中含有較豐富的糖原有關。大鱗副泥鰍淀粉酶比活力的兩個峰值分別出現在內源向外源性營養轉變期和仔魚向稚魚的轉變期[8]。淀粉酶比活力在5 DAH后顯著下降, 是由于仔魚腸道上皮細胞增加, 仔魚對蛋白質和脂肪的利用能力增強, 而對糖類的利用能力減弱。20 DAH后停止投喂豐年蟲, 全部投喂糖類含量相對較低的飼料可能是導致淀粉酶比活力的下降的原因[20]。也有學者認為在仔魚消化系統的發育過程中會出現淀粉酶分泌功能減弱的現象[21, 22]。

堿性磷酸酶是一類單酯磷酸水解酶, 主要存在于魚類前腸上皮細胞的淺部和紋狀緣上, 體外的堿性磷酸酶在堿性條件下起催化無機和有機磷酸酯水解的作用[5]。并有多數學者提出, 將堿性磷酸酶活性顯著上升作為仔魚腸道功能發育完全的標志[2, 5, 21]。大鱗副泥鰍初孵仔魚就檢測到活性, 這種現象在其他多種魚類中也有報道[9, 10]。仔魚在2—5 DAH顯著上升, 表明了大鱗副泥鰍仔魚腸道消化功能在這個階段的快速發育。15—20 DAH 堿性磷酸酶比活力顯著性上升, 提示這個期間腸細胞逐漸成熟,腸道消化功能逐漸完善。

4 結論

大鱗副泥鰍仔稚魚在發育過程中, 消化酶的活性隨仔魚消化系統的發育變化顯著。大鱗副泥鰍為雜食性魚類,在早期對糖類物質消化能力較強, 隨著消化系統發育完善, 對于蛋白質, 脂肪利用率提高, 而減弱了對糖類物質的利用。在培育苗種過程中, 可根據不同發育時期消化酶活性的變化來相應調整餌料配方, 從而促進仔稚魚的生長和提高育苗成活率。

[1] Ding R H. The Fishes of Sichuan, China [M]. Sichuan: Sichuan Science and Technology Press. 1994, 120-122 [丁瑞華. 四川魚類志. 四川: 四川科學技術出版社. 1994, 120—122]

[2] Comabella Y, Mendoza R, Aguilera C, et al. Digestive enzyme activity during early larval development of the Cuban gar (Atractosteus tristoechus) [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2006, 32(2): 147—157

[3] Uebersch? r B. Measurement of Proteolytic Enzyme Activity: Significance and Application in Larval Fish Research [M]. Physiological and Biochemical Aspects of Fish Development. University of Bergen, Norway. 1993, 233—237

[4] Ji H, Sun H T, Tian J J, et al. Digestive enzyme activity during early larval development of the paddlefish Polyoodon spathula [J]. Acta Hydrobiologica Sinca, 2012, 36(3): 458—463. [吉紅,孫海濤, 田晶晶, 等. 匙吻鱘仔稚魚消化酶發育的研究. 水生生物學報, 2012, 36(3): 458—463]

[5] Alvarez-González C A, Cervantes-Trujano M, Tovar-Ramírez D, et al. Development of digestive enzymes in California halibut Paralichthys californicus larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2005, 31(1): 83—93

[6] Reza A, Gholamreza R, Soheil E, et al. Ontogeny of the digestive enzyme activities in hatchery produced Beluga (Huso huso) [J]. Aquaculture, 2013, 416: 33—40

[7] Gisbert E, Giménez G, Fernández I, et al. Development of digestive enzymes in common dentex Dentex dentex during early ontogeny [J]. Aquaculture, 2009, 287(3—4): 381—387

[8] Liang Z X, Liang J Y, Chen C, et al. The embryonic development and fingerling culture of loach, Paramisgurnus dabryanus sauvage [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 1988, 12(1): 28—39 [ 燊梁秩 , 梁堅勇, 陳朝, 等. 大鱗副泥鰍的胚胎發育以及魚種培育. 水生生物學報, 1988, 12(1): 28—39]

[9] Martínez I, Moyano F J, Fernández-Díaz C, et al. Digestive enzyme activity during larval development of the Senegal sole (Solea senegalensis) [J]. Fish Physiology Biochemistry, 1999, 21(4): 317—323

[10] Alvarez-González C A, Moyano-López F J, Civera-Cerecedo R, et al. Development of digestive enzyme activity in larvae of spotted sand bass Paralabrax maculatofasciatus. Biochemical analysis [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2008, 34(4): 373—384

[11] Ben N C, Jian G Q, Martin S K, Ontogenetic development of digestive enzymes in yellowtail kingfish Seriola lalandi larvae [J]. Aquaculture, 2006, 260: 489—501

[12] Zheng K D, Chen G L, Sun B, et al, Variations of growth and digestive enzymes activities in the developmental Chinese sucker larvae (Myxocyprinus asiaticus Bleeker) [J]. Freshwater Fisheries, 2010, 40(6): 9—14 [鄭凱迪, 陳桂來, 孫彬,等．胭脂魚仔魚的生長和消化酶活力變化．淡水漁業, 2010, 40(6): 9—14]

[13] Li Q, Long Y, Qu B, et al. Assessment of digestive enzymes activities during larval development of Pelteobagrus vachelli [J]. Journal of Fishes Sciences of China, 2008, 15(1): 73—78 [李芹, 龍勇, 屈波, 等. 瓦氏黃顙魚仔稚魚發育過程中消化酶活性變化研究. 中國水產科學, 2008, 15(1): 73—78]

[14] Lazo J P, Mendoza R, Holt G J, et al．Characterization of digestive enzymes during larval development of red drum (Sciaenops ocellatus) [J]. Aquaculture, 2007, 265: 194—205

[15] abaei S S, Abedian Kenari A, Nazari R, et al. Developmental changes of digestive enzymes in Persiansturgeon (Acipenser persicus) during larval ontogeny [J]. Aquaculture, 2011, 318(1—2): 138—144

[16] Chen B N, Qin J G, Carragher J F, et al. Deleterious effects of food restrictions in yellowtail kingfish Seriola lalandi during early development [J]. Aquaculture, 2007, 271(1—4): 326—335

[17] Oozeki Y, Bailey K M．Ontogenetic development of digestive enzyme in activities in larval walleye pollock Theragra chalcogramma [J]．Marine Biology, 1995, 122(2): 177—186

[18] Izquierdo M S, Socorro J, Arantzamendi L, et al．Recent advances in lipid nutrition in fish Larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2000, 22(2): 97—107

[19] Morals S, Cahu C, Dinis M T, et al. Dietary TAG source level affect performance and lipase expression in larval sea bass (Dicentrarchus labrax) [J]. Lipids, 2004, 39(5): 449—458

[20] Ma H, Cahu C, Zambonino-Infante J L, et al. Activities of selected digestive enzymes during larval development of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) [J]. Aquaculture, 2005, 245(1—4): 239—248

[21] Rbeiro L, Zambonino-Infante J L, Cahu C, et al. Development of digestive enzymes in larvae of Sole asenegalensis, Kaup1858 [J]. Aquaculture, 1999, 179(1): 465—473

[22] Zmbonino-Infante J L, Cahu C L．Development and response to a diet change of some digestive enzymes in sea bass (Dicentrar-chus labrax) larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 1994, 12(5): 399—408

GROWTH AND FLUCTUATIONS OF DIGESTIVE ENZYMES ACTIVITIES IN PARAMISGURNUS DABRYANUS DURING LARVAL AND JUVENILE STAGES

LIU Ya-Qiu, GUO Zhong-Di, HU Yu, GAO Sheng-Tao and WANG Zhi-Jian
(Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, the Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

大鱗副泥鰍; 仔稚魚; 生長; 消化酶活力

Paramisgurnus dabryanus; Larvae and juveniles; Growth; Digestive enzymes activities

Q175

A

1000-3207(2015)06-1236-05

10.7541/2015.161

2014-10-30;

2015-05-17

公益性行業(農業)科研專項(201203086); 重慶市科委重點實驗室專項經費資助

劉亞秋(1990—), 男, 湖北武漢人; 碩士研究生; 主要研究方向為水生生物學。E-mail: 393386160@qq.com

王志堅(1969—)男, 教授; E-mail: wangzj1969@126.com