中國花鱸精子的超低溫冷凍保存及酶活性檢測

史應學程 順竺俊全吳雄飛

(1. 寧波大學教育部應用海洋生物技術重點實驗室, 寧波 315211; 2. 浙江海洋高效健康養殖協同創新中心, 寧波 315211; 3. 寧波市海洋與漁業研究院, 寧波 315012)

研究簡報

中國花鱸精子的超低溫冷凍保存及酶活性檢測

史應學1, 2程 順1, 2竺俊全1, 2吳雄飛2,3

(1. 寧波大學教育部應用海洋生物技術重點實驗室, 寧波 315211; 2. 浙江海洋高效健康養殖協同創新中心, 寧波 315211; 3. 寧波市海洋與漁業研究院, 寧波 315012)

精子超低溫冷凍保存技術在種質資源保存、遺傳育種及苗種生產上具有重要的應用價值[1, 2]。為了提高冷凍精子的實際應用效果, 需要在提高凍精質量上進行深入研究。凍精質量的提高有賴于精子超低溫冷凍保存技術參數的優化, 諸如稀釋液種類、稀釋比例、抗凍劑種類及濃度、降溫方法及速率等技術參數均需要進行研究與優化選擇。目前, 海水魚類精子超低溫冷凍保存研究已見在真鯛(Pagrus major)[3, 4]、黑鯛(Sparus macrocephalus)[5]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[6]及大菱鲆(Scophthalmus maximus)[7, 8]、條紋狼鱸(Dicentrarchus labrax)[9]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[1, 10]、黃姑魚(Nibea albiflora)[2]等種類中報道; 其使用的稀釋液種類主要有Cortland、TS-2和HBSS等, 稀釋比例一般在1∶1—1∶9; 采用的抗凍劑種類主要有 DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、Gly(甘油)及PG(丙二醇)等, 其適用濃度一般為 5%—20%; 采用的降溫方法有程序降溫儀降溫法或自制簡易降溫裝置降溫法。為了評價精子的超低溫冷凍保存效果, 需對凍精質量進行檢測與分析, 常用檢測方法有精子活力檢測法、酶活性檢測法、單細胞凝膠電泳(SCGE)DNA損傷檢測法、流式細胞術(FCM)細胞結構損傷檢測法等等, 根據實際研究條件選擇應用。

中國花鱸(Lateolabrax maculatus)又名鱸魚, 屬鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、花鱸屬, 分布于中國、日本及朝鮮沿海。近年來, 隨著中國花鱸增養殖產業的發展, 其優良種質保存、遺傳育種及良種繁育研究愈益引起重視, 超低溫冷凍保存的中國花鱸精子在誘導漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)[11]、條斑星鰈(Verasper moseri)[12]、大菱鲆[13]等魚類雌核發育研究方面得到了應用。以往, 中國花鱸精子超低溫冷凍保存研究已見報道[14, 15],但精子的冷凍保存效果因研究者實施的凍存條件不同存在差異, 冷凍保存技術參數還有待于進一步選優, 以提高凍精質量。本研究以0.25 mL麥細管為凍存管、兩步降溫法研究了稀釋液、稀釋比例、抗凍劑種類與濃度以及降溫高度對中國花鱸精子超低溫冷凍保存效果的影響, 并采用酶活性測定技術檢測了鮮精和優選組凍精質量, 旨在優化中國花鱸精子超低溫凍存的技術參數, 為中國花鱸精子超低溫冷凍保存優化工藝的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用性成熟中國花鱸雄魚于2013年11月取自浙江省奉化市石沿育苗廠, 體長51.5—63.5 cm、體重3.0— 4.0 kg, 共10尾, 暫養于水泥池中, 供實驗用。

1.2 方法

精液的采集 用促黃體素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素(LRH-A +HCG)對實驗用魚進行催產, 30h后采精; 用魚夾夾住魚, 用干毛巾擦去生殖孔周圍及體表的水分, 輕壓魚腹使精液自然流出, 用潔凈的注射器將精液移入離心管中, 置于冰浴上(4℃)備用。

精子活力測定 以過濾海水(水溫15℃、pH 8.1、鹽度 27%)為激活液(下同), 精液與激活液混合后在顯微鏡下觀察精子活力(激活率、活動時間和壽命)。激活率為給定視野中被激活精子的數量占全部精子數量的百分比;運動時間是指精子自激活開始至 90%的精子原地顫動為止所經歷的時間; 精子的壽命指精子從激活開始至 90%的精子停止運動的時間。實驗重復3次。

稀釋液種類對精子超低溫冷凍保存效果的影響試驗

分別以 HBSS、MPRS、Cortland 液為稀釋液(表 1), 以10%EG為抗凍劑(抗凍劑為終濃度, 下同)配制抗凍液;將精液與抗凍液按1∶3比例混勻, 4℃平衡30min; 將平衡后的精液-抗凍液混合物分裝入 0.25 mL麥細管中, 然后用兩步降溫法(即將盛精麥細管平放在自制簡易降溫裝置的液氮面上7.5 cm處, 停留10min后投入液氮中)保存。12h后, 將麥細管從液氮中快速取出, 于40℃水浴中溶化后檢測精子激活率。

稀釋比例對精子超低溫冷凍保存效果的影響試驗以10%EG為抗凍劑、Cortland液為稀釋液配制抗凍液, 將精液與抗凍液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶7、1∶9混勻, 按前文方法冷凍保存精子及解凍與激活率檢測。

抗凍劑種類及濃度對精子超低溫冷凍保存效果的影響試驗 以5%、10%、15%及20%四個濃度的DMSO、Gly、EG、PG為抗凍劑、Cortland液為稀釋液配制抗凍液, 將精液與抗凍液按 1∶3混勻, 按前文方法冷凍保存精子及解凍與活力檢測。

降溫高度對精子超低溫冷凍保存效果的影響試驗

以10%EG為抗凍劑、Cortland液為稀釋液配制抗凍液, 將精液與抗凍液按1∶3混勻, 裝入0.25 mL麥細管中于4℃平衡 30min后, 分別平放在液氮面之上 2.5、5、7.5、10 及 12.5 cm處(通過控制麥細管距離液氮面的高度, 來改變冷凍過程的降溫速率, 5個距離液氮面不同高度代表了5個不同的降溫速率), 停留10min后投入液氮中保存。按前文方法進行凍精解凍與激活率檢測。

鮮精及優選組凍精的酶活性檢測 按章龍珍等[16]的方法處理鮮精和優選組(活力最優組)凍精樣本(0.25 mL麥細管為凍存管、Cortland液為稀釋液、1∶3為稀釋比、10%EG為抗凍劑、距離液氮面7.5 cm高度降溫10min后投入液氮, 保存12h后按前文方法進行解凍的凍精樣本)。用購自南京建成生物工程研究所的酶活檢測試劑盒測定酶活性(實驗操作參照其說明書進行)?？侫TP酶采用比色法測定, 酶活力單位定義為每小時每毫升樣品中 ATP 酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP 酶活力單位(U)。SDH(琥珀酸脫氫酶)采用比色法, 酶活力單位定義為每毫克蛋白每分鐘使反應體系的吸光度降低 0.01為 1個比活性單位(U)。LDH(乳酸脫氫酶)采用比色法, 酶活力單位定義為1000 mL血清37℃與基質作用15 min, 在反應體系中產生1 μmol丙酮酸為1單位(U)。SOD(超氧化物歧化酶)采用黃嘌呤氧化酶法, 酶活力單位定義為每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位(U)。CAT(過氧化氫酶)采用比色法, 活力單位定義為每分鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為1個酶活力單位(U)。GR(谷胱甘肽還原酶)采用比色法, 活力單位定義為每升樣品中每分鐘使反應體系中底物NADPH的濃度改變1 mmol/L所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

表1 三種精子超低溫冷凍保存稀釋液的組成成分Tab. 1 Composition of three extenders for sperm cryopreservation of Lateolabrax maculatus

1.3 數據分析

采用 Excel和 SPSS 17.0軟件對實驗數據進行處理,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗各組精子活力、酶活性的差異顯著性, 差異顯著水平為 P＜0.05。統計結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 稀釋液種類對精子超低溫冷凍保存效果的影響

以MPRS、HBSS及Cortland液為稀釋液、10% EG為抗凍劑, 超低溫冷凍保存中國花鱸精子, 12h后解凍,激活率檢測結果見表2。凍精激活率Cortland組最高, 其次為MPRS組, HBSS組最低, 組間凍精激活率差異顯著。

表2 稀釋液種類對中國花鱸精子超低溫冷凍保存效果的影響Tab. 2 Effects of extenders on activation rate during sperm cryopreservation in Lateolabrax maculatus

2.2 稀釋比例對精子超低溫冷凍保存效果的影響

以10%EG為抗凍劑、Cortland液為稀釋液, 不同稀釋比例對精子冷凍保存效果的影響(圖1)。稀釋比例為1∶3時凍精激活率最高, 達(87.33±2.52)%, 與鮮精相比差異不顯著; 稀釋比例低于或高于 1∶3, 精子激活率均明顯下降, 與鮮精相比差異顯著。

2.3 降溫高度對精子超低溫冷凍保存效果的影響

以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑, 不同降溫高度超低溫冷凍保存中國花鱸精子 12h后解凍, 激活率檢測結果見圖2。以距液氮面高度為7.5 cm的降溫高度冷凍保存的精液, 解凍后激活率最高, 達(87.33±2.52)%,與鮮精相比差異不顯著; 距液氮面高度小于或大于7.5 cm的降溫高度, 凍精激活率與鮮精相比差異顯著。

2.4 抗凍劑種類及濃度對精子超低溫冷凍保存效果的影響

以Cortland液為稀釋液、5%—20% DMSO、Gly、EG 及PG為抗凍劑, 超低溫冷凍保存中國花鱸精子, 12h后解凍, 活力檢測結果見表3。4種抗凍劑隨著濃度的增加, 凍精活力都呈先上升后減低的變化趨勢。E2、E3組凍精活力與鮮精相比差異不顯著, 其中E2組凍精激活率、運動時間及壽命最高, 分別達(87.33±2.52)%、(15.23± 0.81)min 及(20.00±0.68)min; 其他各組凍精激活率、運動時間及壽命均顯著低于鮮精。

2.5 鮮精及優選組凍精的總ATP酶、SDH、LDH及SOD、CAT、GR活性

由表4可知, 優選組凍精的總ATP酶、SDH、LDH、SOD及CAT活性與鮮精相比均有所下降, GR活性與鮮精相比有所上升, 但差異均不顯著。

3 討論

3.1 稀釋液及抗凍劑對精子超低溫冷凍保存效果的影響

圖1 稀釋比例對中國花鱸精子超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 1 Effects of ratios of milt to diluent on activation rate of frozen-thawed sperm in Lateolabrax maculatus

圖2 降溫高度對中國花鱸精子冷凍保存效果的影響Fig. 2 Effects of cooling heights on activation rate of frozenthawed sperm in Lateolabrax maculates

表3 抗凍劑種類及濃度對中國花鱸精子超低溫冷凍保存效果的影響Tab. 3 Effects of types and concentrations of cryoprotectant on frozen-thawed sperm motility in Lateolabrax maculatus

表4 鮮精及優選組凍精的總ATP酶、SDH、LDH及SOD、CAT、GR活性Tab. 4 The total ATPase, SDH, LDH and SOD, CAT, GR activities of fresh sperm and optimized frozen-thawed sperm in Lateolabrax maculatus

稀釋液為精子提供一個適宜的生理環境, 延長其在體外的存活時間, 并防止精子被激活。稀釋液的冷凍保存效果與其滲透壓、pH及離子組成密切相關, 精子可被與精漿等滲或接近等滲的溶液抑制; 酸性溶液會降低或抑制精子運動; 高濃度K+能抑制精子活動, 而Na+、Ca2+、Mg2+能緩解或部分緩解這種抑制[17, 18]。不同種魚類精子生理特性不同, 適宜的稀釋液也不盡相同。Fauvel等[9]以MMM液為稀釋液、10% DMSO為抗凍劑超低溫冷凍保存條紋狼鱸精子, 凍精激活率與鮮精之間無顯著差異。Chen等[7]以TS-2液為稀釋液, 10%、14% DMSO為抗凍劑超低溫冷凍保存大菱鲆精子, 激活率達(78.3±7.6)%和(76.6±5.8)%。Koh等[19]以FBS為稀釋液, 5%DMSO為抗凍劑冷凍保存七帶石斑魚(Epinephelus septemfasciatus)精子, 激活率達(77.6±8.5)%。

本研究所選的 3種稀釋液在海水魚類精子超低溫冷凍保存中較常用。如以 HBSS液為稀釋液、5%—20% DMSO為抗凍劑冷凍保存的黃姑魚精子激活率達(79.25± 3.86)%—(85.25±3.95)%[2]; 以MPRS液為稀釋液、10%DMSO為抗凍劑冷凍保存的中國花鱸精子激活率達(68.3± 4.4)%[14]; 以Cortland液為稀釋液、10%DMSO和10%Gly為抗凍劑冷凍保存的黑鯛和大黃魚精子, 激活率最高分別達(92.91±1.25)%和(89.93±1.07)%[5, 10]。本研究以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑超低溫冷凍保存的精子激活率較高, 達(87.33±2.52)%。分析認為, 與HBSS、MPRS液相比, Cortland液的滲透壓、pH及離子環境可以更好地抑制中國花鱸精子運動, 提高凍后精子活力。因此, Cortland液適宜作為中國花鱸精子冷凍保存用稀釋液。

抗凍劑的作用是在溶液中結合水分子, 發生水合作用, 使溶液的黏性增大, 從而弱化水的結晶過程, 達到保護精子的目的; 不同種魚類精子適宜的抗凍劑種類及濃度有所不同。Zhang等[6]以12%DMSO和12%Gly為抗凍劑冷凍保存牙鲆精子, 激活率分別達(60.5±3.6)%和(79.17± 4.5)%; Chen等[7]以10%—14% DMSO為抗凍劑冷凍保存大菱鲆精子, 激活率達(76.6%±5.8)%—(78.3±7.6)%, 而以10%PG為抗凍劑時, 激活率下降為(51.7±2.9)%; 姜建湖等[1]以 5%—20% EG為抗凍劑冷凍保存大黃魚精子, 激活率達(81.25±2.30)%—(87.50±2.52)%, 與鮮精相比無顯著差異; 程順等[10]以5%—20% Gly為抗凍劑冷凍保存大黃魚精子, 激活率達(83.98±2.70)%—(89.93±1.07)%, 與鮮精無顯著差異。本實驗采用 Gly、DMSO、EG及 PG四種常用抗凍劑超低溫冷凍保存中國花鱸精子, 其效果是EG＞PG＞DMSO＞Gly, 其中以10% EG為抗凍劑時精子活力最高, 激活率、運動時間和壽命分別達(87.33±2.52)%、(15.23±0.81)min和(20.00±0.68)min, 與鮮精相比無顯著差異。分析認為, EG分子量相對較小, 其滲透性比 PG、DMSO及Gly高, 能更快速地進入中國花鱸精子, 與水結合, 弱化結晶過程; 10%EG既能起到良好的抗凍保護作用, 又不會因其濃度過高而導致精子中毒。因此, 中國花鱸精子冷凍保存宜選用10% EG為抗凍劑。

精液與抗凍液的稀釋比是影響精子冷凍保存效果的又一重要因素, 適宜的稀釋比能使稀釋液充分滲透入精子細胞。不同種魚類精液中精子密度及其生理特性不同,適宜的稀釋比也會有所不同。據報道, 大菱鲆精子的冷凍保存試驗, 稀釋比從1∶1升高到1∶9, 精子激活率無顯著變化[7, 8]。黃姑魚、真鯛和大黃魚精子冷凍保存試驗, 稀釋比1∶3, 凍精激活率最高分別達(85.25±3.95)%、(81.0± 5.4)%和(89.93±1.07)%[2, 3, 10]。Ji等[14]以1∶1稀釋比冷凍保存中國花鱸精子, 凍精激活率最高達(73.3±5.7)%。本研究的中國花鱸精子超低溫冷凍保存試驗, 稀釋比為 1∶3時激活率達(87.33±2.52)%, 稀釋比大于或小于1∶3時激活率明顯下降。分析認為, 稀釋比 1∶3時, 稀釋液能充分滲透入中國花鱸精子, 這一稀釋比適于中國花鱸精子冷凍保存。

3.2 降溫高度對精子超低溫冷凍保存效果的影響

簡易降溫裝置-兩步降溫法是魚類精子冷凍保存的常用方法, 它通過設置凍存管距離液氮面的高度及停留時間來控制降溫速率。當距液氮面高度增加、降溫減慢時,細胞外冰晶形成速度快于細胞內, 導致細胞因暴露于較高濃度環境中而脫水產生滲透休克, 而當距液氮面高度降低、降溫加快時, 細胞內水分來不及滲出, 細胞因形成冰晶而刺破細胞膜和細胞器等結構, 導致細胞死亡, 所以當距液氮面的高度高于或低于適宜高度時, 凍精激活率降低。不同種魚類精子適宜的降溫高度有所不同。Koh等[19]對七帶石斑魚精子的冷凍保存試驗是在距離液氮面高度2.5、5.0、7.5及10 cm處先降溫至－50 , ℃ 然后投入液氮中保存, 各高度組凍精激活率無顯著差異。Dreanno等[8]在距離液氮面6.5 cm高度降溫15min與在2 及13 cm高度處降溫相同時間冷凍保存大菱鲆精子, 其激活率分別達(81.1±3.6)%與(56.7±4.6)%及(74.7±4.9)%。程順等[10]對大黃魚精子的冷凍保存試驗是在距離液氮面3—4 cm處降溫 3—5min, 然后投入液氮中保存, 凍精激活率達(83.98±2.70)%—(89.93±1.07)%。Ji等[14]試驗發現,花鱸精子在距離液氮面2、6及13 cm高度處降溫10min,接著在液氮面停留5min后投入液氮中保存, 凍精激活率分別為(41.7±10.6)%、(73.3±5.7)%及(48.3±2.9)%。本研究5個不同的液氮面設置高度(2.5、5、7.5、10及12.5 cm)代表5組不同的降溫速率, 其中以7.5 cm高度組凍精激活率最高, 達(87.33±2.52)%, 與鮮精無顯著差異。分析認為, 在此降溫高度, 細胞內冰晶的形成和滲透休克(溶液效應)可能都降到了最低限度。因此, 兩步降溫法冷凍保存中國花鱸精子宜選擇液氮面設置高度7.5 cm。

3.3 超低溫冷凍保存對精子能量代謝酶及抗氧化酶活性的影響

精子的ATP酶、SDH及LDH等能量代謝相關酶活性與精子的活力密切相關, 可作為精子質量評價的重要指標[20—25]。據研究, 長鰭籃子魚(Siganus canaliculatus)精子和日本鰻鱺(Anguilla japonica)精子在超低溫冷凍保存后總ATP酶、SDH活性顯著降低, 活力明顯下降[26, 27];黃鱔(Monopterus albus)精子在冷凍保存后LDH活性顯著下降, 活力明顯降低[28]。虹鱒(Oncorhynchus mykiss)精子在超低溫冷凍保存后LDH活性顯著下降, 活力明顯受影響[29]。精子超低溫冷凍保存后能量代謝酶活性的降低可能是因為精子冷凍過程中酶類物質結構受損, 也可能是因為精子凍融過程中的機械損傷、細胞膜結構改變, 導致精子內的酶類物質溢出。本研究, 中國花鱸精子經超低溫冷凍保存后, 最優組凍精總ATP酶、SDH及LDH活性與鮮精相比下降并不明顯, 凍精活力與鮮精相比也未見明顯降低。這說明采用本試驗的優選工藝超低溫冷凍保存中國花鱸精子, 其內能量代謝酶受到了較好保護, 精子活力較高。

精子在超低溫凍存過程中會產生大量的活性氧, 過量的活性氧會導致精子細胞脂質過氧化、DNA和軸絲結構損傷、活力及授精能力降低等[30—32]。SOD、CAT及GR等是精子中重要的抗氧化酶, 具有清除活性氧、保護細胞免受氧化損傷的作用, 其活性與精子活力密切相關[16, 30, 31, 33]。Maxwell等[34]研究發現, 5℃保存公羊精液一段時間后,精子激活率從＞75%降到 41.2%, 而若在精液中分別添加800 U/mL的SOD或200 U/mL的CAT, 精子激活率分別為52.1%和53.6%, 添加SOD+CAT(800 U/mL+200 U/mL)混合物, 精子激活率為 55.7%。Lahnsteiner等[35]在褐鱒(Salmo trutta)精液中添加150 U/L的CAT, 4℃保存72h后精子激活率為(74.1±9.7)%, 而不添加組精子激活率為(44.0±8.7)%。長鰭籃子魚精子、日本鰻鱺精子以及俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti)精子在超低溫冷凍保存后GR活性顯著上升, SOD、CAT活性顯著下降, 精子活力明顯降低[16, 26, 27]。本研究, 中國花鱸精子經超低溫冷凍保存后, 最優組凍精與鮮精相比, GR活性上升及SOD與CAT活性下降并不明顯, 凍精活力與鮮精相比也未見明顯降低。這說明采用本試驗的優選工藝超低溫冷凍保存中國花鱸精子, 其細胞內的抗氧化酶系統受到了較好保護,多余的活性氧得到及時清除, 精子活力接近鮮精。

綜上所述, 以0.25 mL麥細管為凍存管、Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑、精液稀釋比1∶3、兩步降溫法降溫高度為距液氮面7.5 cm處降溫10min, 超低溫冷凍保存的中國花鱸精子, 其活力、酶活性與鮮精相比差異不顯著, 因此, 可作為花鱸精子超低溫冷凍保存適用技術參數選擇之一。

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SPERM CRYOPRESERVATION AND ENZYME ACTIVITY DETECTION IN LATEOLABRAX MACULATUS

SHI Ying-Xue1, 2, CHENG Shun1, 2, ZHU Jun-Quan1, 2and WU Xiong-Fei2, 3
(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture, Ningbo 315211, China; 3. Ningbo Academy of Oceanology and Fisheries, Ningbo 315012, China)

中國花鱸; 超低溫冷凍保存; 精子; 活力; 酶活性

Lateolabrax maculatus; Cryopreservation; Spermatozoa; Motility; Enzyme activities

S961

A

1000-3207(2015)06-1241-07

10.7541/2015.162

2014-11-13;

2015-02-26

寧波市科技計劃重大項目(2011C11005); 國家海洋局海洋資源生物種質資源庫建設項目(12PYY001SF08-NBDX-1)資助

史應學(1988—), 男, 安徽阜陽人; 碩士研究生; 主要從事水產動物遺傳育種研究。E-mail: ahsyxue@163.com

竺俊全(1964—), E-mail: zhujunquan@nbu.edu.cn