基于微衛星多重PCR技術的黃喉擬水龜親子鑒定

文 萍趙 建李 偉洪孝友朱新平

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

基于微衛星多重PCR技術的黃喉擬水龜親子鑒定

文 萍1, 2趙 建1李 偉1洪孝友1朱新平1, 2

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

利用黃喉擬水龜(Mauremys mutica)微衛星標記, 篩選出16對微衛星引物, 通過優化各引物比例、熒光接頭濃度、退火溫度和循環次數, 建立了基于2組各含8個微衛星位點多重PCR體系的黃喉擬水龜親子鑒定技術。應用2組微衛星多重PCR體系, 通過ABI3130遺傳分析儀以及cervus3.0軟件對428只黃喉擬水龜進行了個體基因型檢測和遺傳多樣性分析, 結果顯示, 群體的平均等位基因數為14.190, 平均多態信息含量為0.748, 平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.687、0.771。對89只候選母本及296只子代進行親子鑒定分析, 結果顯示: 在父本信息未知時, 母本鑒定率為 87%; 母本獲得的子代個數范圍為 1—12, 個體間表現出巨大的差異, 這為選擇育種提供了物質基礎。黃喉擬水龜多重 PCR親子鑒定技術的建立為群體遺傳多樣性分析、家系鑒定管理和選擇育種提供了有效的技術手段。

黃喉擬水龜; 微衛星多重PCR; 親子鑒定

微衛星作為一種分子標記在生物遺傳學研究中得到廣泛應用, 特別是 Chamberlian等[1]在20世紀80年代發展了微衛星多重PCR (Multiplex PCR) 反應模式后, 更是因其高效已廣泛應用于生命科學的各個領域, 其中包括一些水生生物, 如鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[2]、斑節對蝦(Penaeus monodon)[3]的遺傳多樣性分析; 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[4]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[5]、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)[6]、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[7]的親子鑒定; 皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)[8]的遺傳分離模式分析等。微衛星的開發, 為水生生物群體遺傳多樣性、親子鑒定、家系管理等研究提供了有力的工具。

黃喉擬水龜(Mauremys mutica)隸屬龜鱉目(Testudines)、潮龜科(Geoemydidae)、擬水龜屬(Mauremys), 具有較高的食用、藥用和觀賞價值, 在我國主要分布在華東與華南地區, 國外主要分布在越南和日本[9], 已被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約附錄 II[10], 屬易危物種。為保護該物種及滿足人們的需求, 我國在20世紀90年代開展了黃喉擬水龜人工養殖, 目前已形成了產業。但黃喉擬水龜性成熟時間長, 繁殖力低, 導致苗種供應不足,嚴重限制了產業規模的發展[11, 12]。本實驗室近幾年致力于提高黃喉擬水龜繁殖力的研究, 高繁殖力黃喉擬水龜品系選育是其中的一個研究方向。選育需要一個較大群體, 選育過程中需要由后代的數量性狀來確定母本的優良性, 而由大群體自由交配產生的后代其系譜難以確定, 導致后續工作難以開展。因此, 有必要開發黃喉擬水龜親子鑒定技術, 而基于微衛星的親子鑒定技術則成為首選。

目前關于黃喉擬水龜微衛星標記的報道較少,僅見Zhang等[13]關于黃喉擬水龜微衛星的分離與特性描述。本實驗室開發了一些微衛星標記, 結合文獻中的微衛星標記, 篩選、優化構建了黃喉擬水龜微衛星多重PCR體系, 用于親子鑒定及其相關研究,擬以此獲得完整、準確的系譜信息, 為高繁殖力黃喉擬水龜品系選育工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間在2013年, 試驗用父母本材料為人工養殖的9齡黃喉擬水龜, 雌龜89只, 雄龜43只, 共有132只, 采用在背甲上刻字的方法從1—132依次做好標記。養殖場地在中國水產科學研究院珠江水產研究所龜類繁育場。

試驗用子代為上述132只父母本2013年在同一個繁育池中產卵, 人工孵化的子代幼龜, 共296只。同一窩龜卵在采集和孵化過程中作好記錄, 幼龜孵化出來后, 采用刻字法進行標記。

親代和子代每個個體抽取10—20 μL血液, 置于裝有200 μL buffer TL (MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒, OMEGA, USA)的離心管中, 標上與龜個體對應的編號, 冰盒保存, 當天提取DNA。

1.2 基因組DNA的提取

用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取樣本基因組DNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性, DNA經NanoQTM微型分光光度計(博奧)檢測濃度, 并用去離子水稀釋至終濃度 20 ng/μL, 置于–20℃保存備用。

1.3 微衛星引物篩選

從本實驗室黃喉擬水龜簡化基因組測序數據庫及文獻中的微衛星標記篩選微衛星引物。一共設計38對微衛星引物, 引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。合成時, 每對引物的正向引物 5′端添加相同的接頭序列(PET)。通過PCR擴增篩選, 從中選出能穩定擴增、產物條帶清晰、產物多態性豐富的16對引物來構建多重PCR體系。16對微衛星引物中, 10對來自實驗室開發, 6對來自于發表文獻[13]。16對微衛星引物序列信息見表1。

1.4 多重PCR體系構建

根據上述16對引物的退火溫度及其PCR產物長度范圍進行引物組合, 確定構建2個多重PCR體系, 每個體系包含8個微衛星位點。16對引物由英濰捷基公司合成, 根據添加同種接頭的同一體系中的引物其擴增產物不重疊的原則, 合成時在正向引物5′端添加不同的接頭序列(PET、VIC、NED、FAM),另外單獨的PET、VIC、NED、FAM分別以紅色、綠色、黃色、藍色熒光進行標記, 合成熒光標記接頭, 4種接頭序列見表2。PCR擴增前將引物稀釋至10 μmol/L, 每對引物上下游按1∶40混合; 4種熒光接頭均稀釋至 20 μmol/L, 并按 1∶1∶1∶1混合,在渦旋混合器上混勻。通過優化體系內各引物混合比例、退火溫度、循環次數、熒光接頭混合物濃度等條件確定最佳PCR擴增條件。

表1 多重PCR 16對微衛星引物序列Tab. 1 The sixteen microsatellite primers for multiplex PCR

表2 四種熒光標記接頭Tab. 2 The four fluorescent joints

PCR 反應體系 10 μL: 包括 1 μL模板 DNA, 5 μL ABI Multiplex PCR Master Mix, 2 μL 10 μmol/L上下游引物混合物, X μL 20 μmol/L熒光標記接頭,添加去離子水至10 μL。PCR擴增程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性30s, 退火40s, 72℃延伸40s, 若干循環; 94℃變性30s, 53℃退火40s, 72℃延伸30s, 8個循環, 72℃再延伸10min, 4℃保存。

PCR擴增產物加樣到 ABI3130遺傳分析儀中進行毛細管電泳檢測, 同時每個樣孔中加入分子量內標 GeneScanTM-500LIZTM和去離子甲酰胺, 微衛星標記基因型采用 Peak Scanner Software V1.0軟件分析。

1.5 遺傳統計分析及親子鑒定

采用上述建立的微衛星多重 PCR體系對428只黃喉擬水龜進行微衛星標記基因型檢測, 經 Peak Scanner Software V1.0軟件分析, 獲取其基因型, 并輔以人工校對, 為了保證等位基因分型結果的準確性, 對于不能確定基因型的樣品, 可利用完全相同的條件重復 2—3 次擴增和分型。建立親本(132個體)和子代(296個體)的基因型數據庫, 運行Cervus 3.0[14]軟件獲得各微衛星座位的遺傳多樣性參數, 包括等位基因數(Number of alleles, Na)、多態信息含量(polymorphism information content, PIC)、觀測雜合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity, He)、哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測、無效等位基因頻率[Null allele frequency, F (Null)]等。采用Cervus 3.0軟件進行親子鑒定, 分析89個母本個體在2013年的繁殖信息。

2 結果

2.1 多重PCR體系構建

通過對多重PCR反應參數的優化, 建立了2組微衛星多重 PCR體系, 每組包含 8個微衛星位點,每組多重 PCR 的具體參數見表 3。其中多重 PCR體系2在黃喉擬水龜中的擴增效果見圖1。2.2 群體遺傳多樣性分析

表3 二組黃喉擬水龜微衛星多重PCR特征Tab. 3 Characteristics of the two multiplex PCRs

圖1 微衛星多重PCR體系2在子代9號中的毛細管電泳圖Fig. 1 Electrophorograms of the microsatellite multiple PCR (set 2) of offspring 9

用 2組微衛星多重 PCR體系對 132只親龜, 296只仔龜進行擴增, 將獲得的子代和親本基因型整理保存為txt格式的文件。采用Cervus 3.0軟件分析得到如下結果: 16個微衛星位點共檢測到227個等位基因, 單個位點等位基因數(Na)介于 5—26, 平均等位基因數 14.190; 多態信息含量(PIC)介于0.383—0.925, 平均值為0.748, 其中15個微衛星位點PIC＞0.5表現為高度多態性, Mmu3位點PIC＞0.25表現為中度多態性[15]; 觀測雜合度(Ho)介于0.364—0.921, 平均值為 0.687; 期望雜合度(He)介于 0.429—0.930, 平均值為0.771。上述數值表明, 黃喉擬水龜群體遺傳多樣性較豐富。HWE檢驗顯示: 其中8個位點符合 HWE, 3個位點顯著偏離 HWE平衡(P＜0.05), 5個位點極顯著偏離HWE (P＜0.01)。16個位點在428個個體中的具體遺傳參數見表4。

2.3 親子鑒定分析

運行Cervus3.0中Allele frequency analysis程序,獲得 16個微衛星座位在群體中各等位基因的頻率,以及在下列 3種情況中的非排除概率: 當雙親基因型均未知時, 單個微衛星位點的非排除概率(Nonexclusion probability, NE-1P)介于0.250—0.905, 平均值為0.544, 累積非排除概率(Combined non-exclusion probability, CNE-1P)為0.182×10–4; 已知單親基因型時單個微衛星位點的非排除概率(NE-2P)介于 0.143—0.778, 平均值為 0.389, 累積非排除概率 (CNE-2P) 為0.004×10–5, 具體參數見表4。

運行Simulation程序中的maternity子程序, 輸入等位基因頻率文件, 模擬 10000 次親子鑒定。參數設置為: 母本數 89, 抽樣比例為 1, 置信度為95%, 在父本信息未知的情況下進行鑒定, 2個多重PCR 16個微衛星位點的母本模擬鑒定率為100%。

運行Parentage Analysis程序中的maternity子程序, 輸入子代及候選母本的基因型文件、等位基因頻率分析和模擬分析輸出文件, 在父本信息未知的情況下進行鑒定, 結果表明, 在置信水平為 95%時, 258個子代個體找到了母本, 鑒定率為 87%。余下38個子代的母本LOD值小于0, 不宜判定。

將 258個子代的分配情況與原始記錄相比較,發現有13個子代鑒定結果與原始記錄不一致, 即標記來源于同窩的個體, 其鑒定母本不同。原因可能為: 在產卵期, 不同母龜將卵產在同一地點, 實驗人員誤認為屬于同一窩而放在一起孵化, 或是在孵化出苗過程不慎搞混所導致。258個子代在不同母本中的分配情況如表5所示。

2.4 母本繁殖力分析

本實驗89只雌龜成功得到296只子龜, 平均每只母龜有3.3只后代。親子鑒定可明確分配258只子龜, 這 258個子代只分配到 60個母本中, 有 29個母本沒有被分配子代。這結果表明, 有可能一些母龜沒有獲得后代, 獲得后代的不同母本個體也表現出不同的繁殖力, 子代個數介于 1—12, 這些個體在繁殖力上的差異為選擇育種提供了物質基礎。其中母本 m114的子代數多達 12, 表現出優異的繁殖能力, 這些母本及子代都是黃喉擬水龜高繁殖力品系的選育對象。如果以子代數 7為選擇指標, 將有14個母本個體被選擇留種, 同時其子代也一同被選擇留種以接受下一輪的選擇。14個母本占實驗群體的 15.7%, 這預示高繁殖力一代的選擇率為15.7%。有不同子代數量的母本個數如圖2所示。

表4 基于2組多重PCR體系分析的黃喉擬水龜群體遺傳多樣性參數Tab. 4 The genetic diversity of Asian Yellow Pond Turtles, based on the analysis with two sets of multiplex PCR

表5 子代在不同母本中的分配Tab. 5 The allocation of the offspring in different female parents

圖2 有不同子代數量的母本個數Fig. 2 The number of female parents corresponding to different numbers of offspring

3 討論

3.1 微衛星多重PCR的建立與優化

多重PCR要求多對引物能同時在同一反應體系中進行特異性擴增, 因而技術難度較大, 理想的多重PCR反應體系, 并非單一PCR的簡單組合, 需要針對目標產物, 進行全面的分析和反復試驗。因此與單個位點PCR相比, 建立多重PCR的前期準備工作比較繁瑣, 但技術一旦開發成熟, 可大幅度提高效率。

在影響多重PCR反應的主要因素中, 張毅等[16]認為引物間的兼容性和引物濃度比例是最重要的影響因素; 而黃銀花等[17]認為緩沖液的成分對多重PCR的擴增效果產生較大的影響, 而反應體積、循環次數的影響較小。本實驗主要對引物組合及其混合比例、退火溫度、循環次數進行優化, 結果顯示前兩個因素影響較大。不同引物組合時, 需注意引物間不能相互作用, 如形成二聚體、發卡結構等, 另外, 激發同種顏色熒光的引物其擴增片段不能重疊,以免造成基因型統計困難; 引物混合比例需根據產物量加以調整, 直至擴增效率相近; 用于構建同一多重PCR體系的引物其退火溫度相差不宜超過5℃,在確保每對引物均能擴增出PCR產物前提下, 需盡量將多重PCR退火溫度調高, 以免產生雜帶。本實驗多重 PCR產物采用ABI3130遺傳分析儀進行檢測、運行Peak Scanner Software V1.0軟件分析片段大小, 因此 PCR產物的量應該控制在檢測范圍內(能夠有效檢測峰值范圍 50—8000), 實驗中通過調整模板濃度、循環次數、熒光接頭濃度可達到目的。

3.2 試驗群體遺傳多樣性

生物群體的遺傳多樣性是生物多樣性的核心和本質, 也是評估生物資源狀況的一個重要指標。一個種群遺傳多樣性越豐富, 其環境適應能力就越強,生存和進化的潛力也就越大[18]。多態信息含量是基因豐富度的一個指標, 多態信息含量的高低表明了群體遺傳基礎的豐富多樣性, 等位基因數越多, 多態性越豐富。本實驗采用的16個微衛星座位的PIC平均值為 0.748, 表明這些基因座位能夠提供豐富的信息, 可有效用于黃喉擬水龜遺傳多樣性分析。雜合度是衡量群體遺傳多樣性高低的指標。在本研究中 16個微衛星標記的平均觀測雜合度(Ho)為0.687, 平均期望雜合度(He)為0.771。以上數據說明該群體遺傳多樣性水平較高, 與朱新平等[19]運用RAPD分析黃喉擬水龜南北兩個群體遺傳多樣性的結果相類似。

哈迪溫伯格平衡檢驗顯示: 16個微衛星位點中有8個位點有不同程度的偏離, 其中5個位點極顯著偏離(P＜0.01)。雜合子缺失一般是造成群體偏離HWE的主要原因, 5個極顯著偏離HWE的位點期望雜合度都遠大于它們的觀測雜合度, 表明純合子的個體較多, 說明該試驗群體存在一定程度的近交或者存在無效等位基因。在本試驗中16個微衛星位點無效等位基因頻率介于–0.85%—22.04%, 5個極顯著偏離 HWE的位點的無效等位基因頻率均大于10%, 說明無效等位基因是造成其偏離HWE一大原因。從本研究的樣本來源中可以看出, 非隨機交配群體以及育苗過程中的人工選擇可能是造成8個位點偏離HWE的另一個主要原因。

3.3 親子鑒定

本研究使用的親龜是在2013年3月挑選分池養殖, 由于龜類具有上一年交配的精子可以保留在母體體內至下一年受精的特點[20], 因此有可能部分父本個體不出現在試驗群體中, 故本試驗只進行了母本群體和子代群體的親緣關系鑒定。試驗中使用 2組微衛星多重PCR體系進行子代與候選母本的關系鑒定, 模擬鑒定率達到100%, 實際鑒定率為87%。

實際鑒定率低于模擬鑒定率, 原因可能是: (1)無效等位基因的存在[21, 22]。本文采用cervus3.0軟件分析微衛星位點基因型數據后, 發現16個微衛星位點無效等位基因頻率介于–0.85%—22.04%, 其中位點sg8、Mmu7、sg10、Mmu4、sg16的無效等位基因頻率大于10%。無效等位基因主要是因為引物無法與微衛星側翼發生突變的位點相結合, 導致微衛星序列不被擴增而產生的, 且微衛星序列點突變頻率很高(10–2—10–5)[23]。(2)基因型統計誤差, 本實驗多重PCR產物采用ABI3130毛細管電泳檢測, 同一樣品在不同批次的檢測中, 結果有一定的差異, 這可能導致統計結果有一定的誤差。另外, 用軟件cervus3.0分析時, 需將PCR片段大小化為整數, 也可能會降低鑒定率。另外基因突變, 以及酶在擴增以單、二核苷酸為核心序列的微衛星座位時易發生滑動而引起PCR產物出現同源異型的現象均有可能導致實際鑒定率下降。

親子鑒定結果顯示, 試驗群體中不同母本的子代數目有所差異, 這對選擇育種有非常大的參考價值。在實際育種過程中, 可以選擇子代數目較多的母本及其子代進行留種, 連續幾年對其繁殖情況進行觀察, 同時觀察其子代性成熟之后的繁殖情況,以考察母本高繁殖力能否在子代中遺傳。同時根據親子鑒定, 可將母龜分為高繁殖力與低繁殖力兩個群體, 為將來進行分子輔助育種研究提供了重要的研究材料。這些工作將為黃喉擬水龜高繁殖力品系培育打下良好基礎。

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THE PARENTAGE ASSIGNMENT OF MAUREMYS MUTICA USING MULTIPLEX PCR OF MICROSATELLITES

WEN Ping1, 2, ZHAO Jian1, LI Wei1, HONG Xiao-You1and ZHU Xin-Ping1, 2
(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation of Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Life Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this study, we established a technique for the parentage assignment in Asian Yellow Pond Turtles (Mauremys mutica) based on two multiplex PCR panels. The primer ratio, the concentration of the fluorescent joint, the annealing temperature and the number of cycles were optimized in this technique. Each multiplex PCR panel had eight loci, 10 of which were developed in our lab and the other 6 were chosen from published literatures. With the multiplex PCR tool we performed the genotyping and the genetic diversity analysis on 428 individuals using ABl3I30 genetic analyzer and Cervus 3.0 software. The results showed that the average number of alleles was 14.190; the average polymorphism information content (PIC) was 0.748; the average observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) were 0.687 and 0.771 respectively. The parentage assignment was performed on 89 candidate female parents and 296 offspring. Without information on the male parent, the identification rate was 87%. The numbers of offspring of different female parents were remarkably various, ranging from 1 to 12. This provided the material foundation for the selective breeding. This technique could be a highly efficient tool for the genetic diversity analysis, the marker-assisted family identification and management, and the selective breeding of Asian Yellow Pond Turtles.

Mauremys mutica; Microsatellite multiplex PCR; Parentage assignment

Q347

A

1000-3207(2015)06-1134-08

10.7541/2015.149

2014-11-18;

2015-01-15

國家自然科學基金(31302176)資助

文萍(1989—), 女, 湖南株洲人; 碩士; 研究方向為種質資源與遺傳育種。E-mail: 461211601@qq.com

朱新平(1964—), 男, 博士, 研究員; E-mail: zhuxinping_1964@163.com