銅離子急性脅迫對虎紋蛙肝臟中三羧酸循環及自由基代謝的影響

李 斌 黃 艷 邵 晨 王 宇

(浙江師范大學生態研究所, 金華 321004)

銅離子急性脅迫對虎紋蛙肝臟中三羧酸循環及自由基代謝的影響

李 斌 黃 艷 邵 晨 王 宇

(浙江師范大學生態研究所, 金華 321004)

為探明銅離子(Cu2+)對兩棲動物肝臟線粒體中三羧酸(Tricarboxyl acid, TCA)循環及自由基代謝的毒理作用, 采用靜水暴露實驗, 研究了 Cu2+不同濃度和不同暴露時間對虎紋蛙(Hoplobatrachus chinensis)肝臟線粒體中異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)活性、α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性、抗超氧陰離子(anti-·O2–)活性、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(inhabit-·OH)活性、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合成酶(NOS)活性的影響。暴露實驗共設置6個Cu2+濃度組(0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L), 分5個暴露時間(0、24h、48h、72h和96h)取材, 對每個濃度的不同暴露時間分別取6個樣本, 測定TCA循環及自由基代謝的相關指標。結果顯示, 在TCA循環中隨著Cu2+濃度的增加和暴露時間的延長, 時間和濃度因素對ICDHm活性影響無顯著性交互作用(P＞0.05), 暴露時間的延長對 ICDHm 活性無顯著性影響(P＞0.05), 但隨著 Cu2+濃度的增加ICDHm 活性逐漸減小; 而時間和濃度因素對 α-KGDH 活性影響有顯著交互作用(P＜0.05), 暴露處理后α-KGDH活性下降, 分別在24h和96h的4.0、6.0 mg/L時活性最低。在自由基代謝中, 時間和濃度因素對抗·O2–活性、H2O2含量影響有顯著交互作用(P＜0.05), 而對抑制·OH活性、NO含量、NOS活性的影響無顯著性交互作用(P＞0.05)。不同時間隨著 Cu2+濃度的增加, 抗·O2–活性均呈現出逐漸下降的趨勢; 實驗處理后H2O2含量升高, 在24h的6.0 mg/L時含量最大; 隨著暴露時間的延長和Cu2+濃度的增加抑制·OH活性均逐漸降低; 而NO 含量和NOS 活性的變化趨勢基本相同, 即隨著Cu2+濃度的增加先增加后減少并趨近0濃度組, 且都在6.0 mg/L時達到最大。研究結果表明急性Cu2+暴露對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環及自由基代謝有顯著的毒性作用。

虎紋蛙; 銅離子; TCA循環; 自由基代謝; 毒性效應

銅是生物體所必須的微量元素之一, 對生物體的生長發育和繁殖起著重要的作用, 但過量的銅離子(Cu2+)則會對機體產生毒害作用[1, 2]。Cu2+是水體中常見的重金屬, 主要來源于銅鋅礦開采和冶煉、金屬加工、機械制造、鋼鐵生產等工業廢水[3]。含銅廢水的排放不僅污染環境, 同時對棲息于其中的動植物產生極大的影響[4, 5]。兩棲動物作為脊椎動物從水生過渡到陸生的重要類群, 其生命活動的各個環節均離不開水環境。因此, 以銅為代表的重金屬污染被認為是導致當今全球兩棲動物急劇下降的重要原因之一[6]。

近年來, 虎紋蛙(Hoplobatrachus chinensis)由于棲息地破壞、環境污染和人類過度捕獵等因素, 其野生種群瀕臨滅絕, 已被列為國家Ⅱ級重點保護野生動物, 并被列入中國瀕危動物紅皮書?；⒓y蛙主要生活于稻田、魚塘、水坑和溝渠內, 對水體污染反應敏感。目前關于虎紋蛙的研究主要集中于形態學[7]、細胞生物學[8]、分子遺傳學[9]、生理生態[10]等方面, 而有關 Cu2+對虎紋蛙的急性毒性效應, 以及由此引起的三羧酸(Tricarboxyl acid, TCA)循環和自由基代謝方面的研究尚未見報道。本研究擬通過實驗室急性脅迫實驗, 研究 Cu2+對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環及自由基代謝的毒理作用, 以期可為探討重金屬污染導致的兩棲類種群下降機制的討論和含銅廢水排放標準的制定提供理論依據, 同時也可為該物種的野外保護提供重要的數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究用虎紋蛙種群來自浙江省金華市的虎紋蛙養殖場。將虎紋蛙置于圓柱形水族箱(半徑0.5 m× 高0.8 m)馴化飼養, 提供充足的水陸環境和遮蔽物,自然光照, 溫度為(25±1) , ℃ 飼養密度為 30只/缸,每日以虎紋蛙養殖專用飼料(漳州市聯泰飼料有限公司)投食 1次, 并定時用經曝氣脫氯的自來水[pH: 7.5±0.1, 溶氧量: (8.7±0.2) mg/L]換水1次, 清除死亡個體、記錄死亡率, 馴化時間為1周。

1.2 半致死濃度實驗

在預實驗的基礎上, 用分析純五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)分別配制銅離子(Cu2+)濃度為8.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 mg/L的溶液15 L, 每個處理組設置2個平行, 另設空白對照組(0 mg/L)。向每個實驗水族箱中放置15只體表無傷、大小均一[體重: (178.01±1.77) g; 體長: (12.30±0.13) cm]的虎紋蛙成體, 實驗處理過程中不喂食, 每日定時更換實驗溶液1次, 觀察并分別記錄每個水族箱中24h、48h、72h 和96h虎紋蛙的累積死亡個數, 及時清除死亡個體。

1.3 暴露實驗

用分析純 CuSO4·5H2O分別配制 Cu2+濃度為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L的溶液15 L, 每個Cu2+濃度設置 2個平行組, 另設空白對照組(0 mg/L)。每個實驗水族箱中放置30只體表無傷、大小均一[體重: (178.01±1.77) g; 體長: (12.30± 0.13) cm]的虎紋蛙成體。實驗過程中不喂食, 每日定時換溶液 1次, 注意觀察并及時清除死亡個體。分別于暴露時間0、24h、48h、72h和96h在每個濃度組中隨機取活體虎紋蛙 6只進行解剖, 并將所獲取的肝臟組織置于–80℃冰箱中保存待用。

1.4 檢測方法

采用差速離心法分離肝臟細胞中的線粒體, 操作方法詳見試劑盒說明書(蘇州科銘生物技術有限公司), 并將分離獲取的線粒體置于–80℃冰箱中保存。

TCA 循環中異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, ICDHm)和 α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase, α-KGDH)的活性采用試劑盒測定(蘇州科銘生物技術有限公司)。自由基代謝中抗超氧陰離子(anti-·O2–)活性、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(inhabit-·OH)活性、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合成酶(NOS)活性及線粒體中蛋白含量均采用試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)。上述指標在每個樣本中均重復測定3次, 并取平均值, 測定程序參照試劑盒說明書。

1.5 數據分析

實驗數據采用SPSS 21.0數據包進行統計分析,并以平均值±標準誤(Mean±SE)表示檢測結果。以時間和濃度為自變量進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA), 若二因素間出現顯著交互作用, 則固定其中一個因素, 以另一個因素做單因素方差分析(One-way ANOVA)或 t檢驗; 若二因素間無交互作用, 則進行兩因素主效應分析, 并用 LSD進行組間差異顯著性檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 虎紋蛙的半致死濃度

采用直線內插法計算得出(圖1): Cu2+對虎紋蛙的24h半致死濃度(24h LC50)為62.5 mg/L, 48h LC50為 24.7 mg/L, 72h LC50為 9.5 mg/L, 96h LC50為8.2 mg/L。

2.2 Cu2+對TCA循環中關鍵酶的影響

圖1 虎紋蛙在不同濃度銅離子下的累積死亡率Fig. 1 The cumulative mortality rate of H. chinensis under various concentrations of Cu2+

Cu2+濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中 ICDHm活性的影響無交互作用(P＞0.05)(表1)。兩因素主效應分析結果顯示: 隨著Cu2+濃度的增加, ICDHm活性呈現逐漸減小的趨勢, 而暴露時間對ICDHm活性無影響(P＞0.05)(圖2)。

Cu2+濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中α-KGDH活性的影響有極顯著的交互作用(P＜0.01)(表1)。在24h、48h和96h三個處理組中隨著Cu2+濃度的增加α-KGDH活性均出現先減小后增大的趨勢, 但其酶活均小于或等于對照組的酶活力;而在72h處理組中α-KGDH的活性只呈現出下降的趨勢。相同 Cu2+濃度在不同暴露時間下, 隨著處理時間的延長, α-KGDH活性均呈現出先減小后增大再減小的趨勢(圖3)。

表1 銅離子濃度和作用時間對虎紋蛙肝臟細胞線粒體TCA循環關鍵酶和自由基代謝的雙因素方差分析Tab. 1 Two-way ANOVA analysis of the effects of various copper ion concentrations and exposure time on the key enzymes in TCA cycle and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 2 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中異檸檬酸脫氫酶活性的影響Fig. 2 The effects of Cu2+concentrations on the activity of ICDHm in the mitochondria of the liver of H. chinensis

2.3 Cu2+對自由基代謝的影響

Cu2+濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中的抗超氧陰離子活性及 H2O2含量的影響有極顯著的交互作用(P＜0.01)(表1)。在相同時間下,隨著Cu2+濃度的增加抗超氧陰離子活性均有逐漸降低的趨勢(圖4)。在24h和48h處理組中, H2O2的含量隨著Cu2+濃度的增加而呈現出先增大后減小的趨勢, 但其含量均高于對照組; 而在72h和96h處理組中, H2O2的含量則是呈逐漸增加的趨勢。在同一Cu2+濃度處理組中, 隨著時間的延長, H2O2的含量呈逐漸減小的趨勢(圖5)。

暴露濃度和時間雙因素對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中抑制羥自由基活性、NO含量和NOS活性的影響無交互作用(P＞0.05)(表1)。兩因素主效應分析結果顯示: 暴露時間顯著影響抑制羥自由基的活性,抑制羥自由基活性隨暴露時間的延長而呈現逐漸減小的趨勢(圖6), 然而暴露時間對NO含量和NOS的活性無顯著影響(P＞0.05); 抑制羥自由基的活性隨Cu2+濃度的增加而呈現逐漸減小的趨勢(圖7), NO含量和NOS的活性則呈現先增大后減小的趨勢(圖8)。

圖3 銅離子對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中α-酮戊二酸脫氫酶活性的影響Fig. 3 The effects of Cu2+exposure on the activity of α-KGDH in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖4 銅離子對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中抗超氧陰離子活性的影響Fig. 4 The effects of Cu2+exposure on the anti-·O2–activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖5 銅離子對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中過氧化氫含量的影響Fig. 5 The effects of Cu2+exposure on the H2O2content in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 6 暴露時間對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中抑制羥自由基活性的影響Fig. 6 The effects of exposure time on the inhibit-·OH activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 7 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中抑制羥自由基活性的影響Fig. 7 The effects of Cu2+concentration on the inhibit-·OH activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

3 討論

肝臟是糖類、脂類和蛋白質等進行代謝的主要場所, 其在維持生物體的代謝平衡方面起著重要的作用。此外, 肝臟也是機體的解毒器官, 可將來自體內外的各種有毒物質經過生物代謝轉化為無毒或低毒的物質。肝臟細胞中含有大量的線粒體, 線粒體不僅是細胞的“能量工廠”, 而且在維持細胞功能上也發揮著重要作用[11]。肝臟細胞中的線粒體在合成ATP的同時會生成活性氧自由基(ROS), 二者在正常機體內處于動態平衡之中, 其含量共同調節著機體的生長發育、細胞凋亡、氧化應激、基因表達等生理生化活動[12, 13]。然而, 當機體受到外界不良環境的脅迫時(如高鹽、低溫等), 機體將產生過量的ROS積累, 造成線粒體損傷和細胞凋亡[14]。

圖 8 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細胞線粒體中一氧化氮含量和一氧化氮合成酶的影響Fig. 8 The effects of Cu2+concentration on the NO content and NOS activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

3.1 Cu2+對TCA循環的影響

TCA循環作為生物體能量代謝的重要途徑, 不僅是糖、脂和蛋白質代謝的最終代謝通路, 也是糖、脂和蛋白質代謝聯系的樞紐。ICDHm和 α-KGDH 是TCA循環中的關鍵酶, 對調節TCA循環具有重要的作用[15, 16]。

研究顯示, TCA循環中NADPH的生成主要受到ICDHm活性的影響, 同時活性氧自由基(ROS)在體內的代謝又受到 NADPH所提供質子數量的影響[17],因此ICDHm在TCA循環中的活性將影響到對ROS的清除能力[18]。本研究結果顯示隨著Cu2+濃度的增加, ICDHm的活性將逐漸降低, 這與李明達等[19]對釀酒酵母體內 ICDHm活性研究結果一致, 說明Cu2+的脅迫能夠對ICDHm活性產生顯著影響。

α-KGDH則是TCA循環的限速酶, 在TCA循環中α-KGDH催化α-酮戊二酸生成琥珀酰-CoA和NADH。NADH在機體的電子呼吸鏈中可與FADH2共同作用促使 ADP和 Pi反應合成 ATP[20]和產生ROS[21]。因此, α-KGDH的活性將直接影響線粒體的能量代謝和ROS的生成[22]。在不良環境中, ROS的積累將會降低α-KGDH的活性[23], 且過量的ROS將引起機體組織慢性缺氧, 促使機體產生適應性調節,并誘導α-KGDH活性的回升[24]。本研究結果與此基本一致, 虎紋蛙在經Cu2+處理24h和48h后, α-KGDH的活性呈現出先降低后回升的趨勢; 而在處理 72h后由于機體受損程度已超過機體的適應性調節范圍,因而造成自身調節失效并引起α-KGDH活性的逐漸下降; 隨著處理時間繼續延長, 96h后α-KGDH的活性在銳減后回升, 這可能是因為外界傷害超過機體適應性調節范圍后觸發了機體的某種補償機制。同樣, 在相同離子濃度不同暴露時間的分析上也說明可能存在這種補償機制。在2、4、6和8 mg/L的處理組中, 隨著處理時間的延長, α-KGDH活性呈現出先下降后回升再下降的趨勢; 而在 10 mg/L的處理組中α-KGDH的活性除了先下降后回升再下降的趨勢外, 其酶活性還有再次回升的趨勢?；⒓y蛙機體中出現的關于α-KGDH活性的補償目前尚不清楚其機制, 還有待后續研究。然而, 經 Cu2+處理后無論是機體自身的適應性調節還是機體觸發的補償機制所導致α-KGDH活性的回升, 其活性均小于或等于對照組的酶活性。

3.2 Cu2+對自由基代謝的影響

重金屬對生物體的毒性效應主要表現在自由基介導的生物氧化損傷[21], 而生物體的氧化脅迫又可誘導生物體產生過量的 ROS[25]并降低生物體清除ROS的能力[26]。在線粒體中, ROS主要包括·O2–、H2O2、·OH和NO等幾種。其中·O2–是一種在線粒體中具有高度生物活性的自由基[26], 可由呼吸鏈在進行電子傳遞時形成[27], 是形成 H2O2和·OH 的前體?！H 是·O2–經過歧化反應和 Fenton反應及Haber-Weiss反應生成, 可與大多數細胞發生反應造成氧化損傷或過氧化損傷[28]。H2O2則是·O2–反應生成·OH的中間產物, 其在機體內的含量直接影響對ROS的清除能力和抗氧化系統的穩定性[21]。

在本研究中, 虎紋蛙在 Cu2+水溶液暴露后, 線粒體抗超氧陰離子和抑制羥自由基的活性均呈逐漸下降的趨勢?？钩蹶庪x子和抑制羥自由基是機體內清除·O2–和·OH的主要物質, 在Cu2+作用下, 二者的含量和活性均受到嚴重的抑制而降低[4, 29, 30], 并導致機體對ROS清除能力的下降。本實驗的結果與用鎘對河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺線粒體自由基代謝的研究結果大致相同[21]。而H2O2的含量則在外界 Cu2+的影響下, 出現有規律的變化。在相同Cu2+濃度或較短時間(24h和48h)暴露后, H2O2的含量都表現出隨暴露時間延長或 Cu2+濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢。這說明機體在面對 Cu2+的脅迫時, 首先其生成了大量的 ROS, 隨后大量的ROS觸發機體的適應性調節, 并產生抗氧化物使得H2O2的濃度隨之降低。然而在較長時間(72h 和96h)暴露后, H2O2的含量則隨Cu2+濃度的增加只表現出上升的趨勢。這說明在較長時間的污染下,大量的H2O2引起機體抗氧化系統的紊亂, 導致ROS的積累; 同時機體自身對不良環境的適應性調節已失效, 因而其H2O2濃度呈單調上升的趨勢。本實驗的結果與對中國花鱸(Lateolabrax maculatus)幼魚的毒性研究結果類似[4]。

NO作為線粒體中具有高度生物活性的另一種自由基, 在調節線粒體氧化呼吸和能量代謝方面起到重要的作用[21]。存在于線粒體內膜上的鈣依賴性NOS可通過氧化L-精氨酸形成NO, 且其活性受到線粒體內膜的影響[31]。本研究結果顯示, 經 Cu2+處理后, NO的含量和NOS的活性均隨著Cu2+濃度的增大而出現先上升后下降的變化, 這與用鎘對河南華溪蟹的相關研究結果相一致[21]。低濃度的Cu2+在機體內可作為微量元素被吸收[32], 從而誘導NOS活性的增加, 并促使 NO合成量的增大; 隨著 Cu2+濃度的不斷增大, NOS的活性和NO的含量均不斷增加; 大量的NO一方面將與O2競爭性的與呼吸鏈復合體Ⅳ結合, 降低呼吸鏈活性, 減少 O2的消耗, 導致機體產能受阻[33]; 另一方面, 大量的 NO 還可與·O2–發生反應生成活性更強的過氧化亞硝酸離子(ONOO–)[34], 導致呼吸鏈受損和脂質過氧化, 使機體的ATP合成受到阻礙[35]。此后, 隨著Cu2+濃度繼續增大, 高劑量的 Cu2+不僅導致機體的呼吸鏈受損、產能受阻, 還可直接與NOS作用而改變其分子構型[32], 最終導致NOS活性和NO生成的下降。

綜上所述, 急性 Cu2+暴露對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環及自由基代謝有顯著的毒性作用, 其不僅可通過影響虎紋蛙肝臟線粒體中 TCA循環關鍵酶ICDHm和α-KGDH的活性降低TCA循環的轉化效率, 而且可通過降低虎紋蛙肝臟線粒體中抗自由基的生成能力和增加線粒體中自由基的含量破壞線粒體的自由基代謝平衡。

致謝:

感謝代亞如、程巖巖、朱麗麗和金芬對本實驗相關數據的處理和文稿的校對。感謝孫梅好教授對英文摘要進行潤色。

參考文獻：

[1] De Boeck G, Meeus W, Coen W D, et al. Tissue-specific Cu bioaccumulation patterns and differences in sensitivity to waterborne Cu in three freshwater fish: rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), common carp (Cyprinus carpio), and gibel carp (Carassius auratus gibelio) [J]. Aquatic Toxicology, 2004, 70(3): 179—188

[2] Wu F C, Feng C L, Cao Y J, et al. Aquatic life ambient freshwater quality criteria for copper in China [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2011, 6(6): 617—628 [吳豐昌,馮承蓮, 曹宇靜, 等. 我國銅的淡水生物水質基準研究.生態毒理學報, 2011, 6(6): 617—628]

[3] Wang H D, Fang F M, Xie H F. Research situation and outlook on heavy metal pollution in water environment of China [J]. Guangdong Trace Elements Science, 2010, 17(1): 14—18 [王海東, 方鳳滿, 謝宏芳. 中國水體重金屬污染研究現狀與展望. 廣東微量元素科學, 2010, 17(1): 14—18]

[4] Zhu Y F, Hong W S, Lin J Z. Toxicity of Cu2+to juvenile perch Lateolabrax maculatus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2011, 6(3): 331—336 [朱友芳, 洪萬樹, 林金忠. 銅離子對中國花鱸幼魚的毒性研究. 生態毒理學報, 2011, 6(3): 331—336]

[5] Zhang F, Liu H W, Song Z D. Effects of some heavy metals on superoxide anion (O2–) production by coelomocytes of Stichopus japonicus [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(suppl): 100—103 [張峰, 劉洪偉, 宋志東.幾種重金屬對刺參體腔細胞超氧陰離子(O2–)產生的影響.農業環境科學學報, 2006, 25(增刊): 100—103]

[6] Gascon C, Collins J P, Moore R D, et al. Amphibian Conservation Action Plan. IUCN/SSC Amphibian Specialist Group [M]. Gland, Switzerland and Cambridge, UK. 2007, 64

[7] Lin Z H, Ji X. Sexual dimorphism in morphological traits and food habits in tiger frogs, Hoplobatrachus rugulosus in Lishui, Zhejiang [J]. Zoological Research, 2005, 26(3): 255—262 [林植華, 計翔. 浙江麗水虎紋蛙形態特征的兩性異形和食性. 動物學研究, 2005, 26(3): 255—262]

[8] Lin X, Wang S K, Chen M F, et al. Study on tryptase in the mast cell in the digestive tract of indian bullfrog (Rana tigrina rugulosa) by an immunohistochemical method [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(1): 29—34 [林旋, 王壽昆, 陳梅芳, 等. 虎紋蛙消化道肥大細胞類胰蛋白酶免疫組化研究. 水生生物學報, 2010, 34(1): 29—34]

[9] Shao C, Wang Y, Qiao N. Isolation and characterization of microsatellite loci in tiger frog (Hoplobatrachus rugulosus) [J]. Conservation Genetics, 2009, 10(5): 1601—1603

[10] Wang N, Shao C, Xie Z G, et al. Viability and changes of physiological functions in the tiger frog (Hoplobatrachus rugulosus) exposed to cold stress [J]. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(11): 3538—3545 [王娜, 邵晨, 頡志剛, 等. 低溫脅迫下虎紋蛙的生存力及免疫和抗氧化能力. 生態學報, 2012, 32(11): 3538—3545]

[11] Gunter T E, Yule D I, Gunter K K, et al. Calcium and mitochondria [J]. Febs Letters, 2004, 567(1): 96—102

[12] Wallace D C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine [J]. Annual Review of Genetics, 2005, 39: 359—407

[13] Navarro A, Boveris A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process [J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2007, 292(2): C670—C686

[14] Xu Z K, Guan G Q, Yin H, et al. Mitochondrial research of animal piroplasms [J]. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases, 2011, 18(6): 67—73 [徐宗可, 關貴全, 殷宏, 等.動物梨形蟲線粒體研究進展. 中國動物傳染病學報, 2010, 18(6): 67—73]

[15] Hao Z F, Yuan J C, Liu Y H. Role of isocitrate dehydrogenase on oxidative stress in plants [J]. Biotechnology Bulletin, 2012, (6): 32—35 [郝兆豐, 袁進成,劉穎慧. 異檸檬酸脫氫酶在植物抗氧化脅迫中的作用. 生物技術通報, 2012, (6): 32—35]

[16] Li K, Guo X, Yang Y, et al. Effects of high humidity environment on isocitrate dehydrogenase and alpha ketone glutaric acid dehydrogenase in liver of rat [J]. Journal of Third Military Medical University, 2013, 35(23): 2595—2596 [李昆, 郭鑫, 楊蕓, 等. 高濕環境對大鼠肝臟異檸檬酸脫氫酶及 α-酮戊二酸脫氫酶的影響. 第三軍醫大學學報, 2013, 35(23): 2595—2596]

[17] Jo S H, Lee S H, Chun H S, et al. Cellular defence against UVB-induced phototoxicity by cytosolic NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 292(2): 542—549

[18] Jo S H, Son M K, Koh H J, et al. Control of mitochondrial redox balance and cellular defense against oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase [J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(19): 16168—16176

[19] Li M D, Zhao R, Jiang X L, et al. Effects of adding intermediate material in tricarboxylic acid cycle on the activity of key enzymes of Saccharomyces cerevisiae [J]. Microbiology China, 2010, 37(3): 331—335 [李明達, 趙睿,姜曉雷, 等. TCA循環中間產物對釀酒酵母胞內代謝關鍵酶活性的影響. 微生物學通報, 2010, 37(3): 331—335]

[20] Liu L M, Li Y, Shi Z P, et al. Enhancement of pyruvate productivity in Torulopsis glabrata: Increase of NAD+availability [J]. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2): 173?185

[21] Jin F F, Wang L. Effects of cadmium on hepatopancreas mitochondrial free radical metabolism in freshwater crab Sinopotamon henanense [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(2): 457—464 [金芬芬, 王蘭. 鎘對河南華溪蟹肝胰腺線粒體自由基代謝的影響. 環境科學學報, 2012, 32(2): 457—464]

[22] Starkov A A, Fiskum G, Chinopoulos C, et al. Mitochondrial α-ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species [J]. Journal of Neuroscience, 2004, 24(36): 7779—7788

[23] Huang H M, Ou H C, Xu H, et al. Inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase complex promotes cytochrome c release from mitochondria, caspase-3 activation, and necrotic cell death [J]. Journal of Neuroscience Research, 2003, 74(2): 309—317

[24] Lu Z F, Jia F, Qiu Y M, et al. Effect of mild hypothermia on the activities of α-ketoglutarate dehydrogenase of mitochondria following traumatic brain injury [J]. Chinese Journal of Neurosurgery, 2007, 22(11): 659—662 [陸兆豐,賈鋒, 邱永明, 等. 亞低溫對創傷性腦損傷后線粒體 α-酮戊二酸脫氫酶活性的影響. 中華神經外科雜志, 2007, 22(11): 659—662]

[25] Sarkar B. Metal replacement in DNA-binding zinc figer protein and its relebance to mutagenicity and carcinogenicity through free radica feneration [J]. Nutrition, 1995, 11(5 Suppl): 646—649

[26] Del-Rio D, Stewart A J, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress [J]. Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2005, 15(4): 316—328

[27] Gill S S, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48(12): 909—930

[28] Anwer T, Sharma M, Pillai K K, et al. Protective effect of bezafibrate on streptozocin-induced oxidative stress and toxicity in rats [J]. Toxicology, 2007, 229(1/2): 165—172

[29] Wang C G, Yu Q, Yu A, et al. Effect of benzo(a)pyrene and pyrene exposure on hepatic superoxide dismutase in Mugil so-iuy [J]. Marine Environmental Science, 2002, 21(4): 10—13 [王重剛, 余群, 郁昂, 等. 苯并(a)芘和芘暴露對梭魚肝臟超氧化物歧化酶活性的影響. 海洋環境科學, 2002, 21(4): 10—13]

[30] Hultberg B, Andersson A, Isaksson A. Alterations of thiol metabolism in human cell lines induced by low amounts of copper, mercury of cadmium ions [J]. Toxicology, 1998, 126(3): 203—212

[31] Riobó N A, Melani M, Sanjuán N, et al. The modulation of mitochondrial nitric-oxide synthase activity in rat brain development [J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(45): 42447—42455

[32] Knowles R G, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals [J]. Biochemical Journal, 1994, 298(Pt 2): 249—258

[33] Solien J, Haynes V, Giulivi C. Differential requirements of calcium for oxoglutarate dehydrogenase and mitochondrial nitric-oxide synthase under hypoxia: impact on the regulation of mitochondrial oxygen consumption [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2005, 142(2): 111—117

[34] Ghafourifar P, Colton C A. Mitochondria and nitric oxide [J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2003, 5(3): 249—250

[35] Brown G C, Borutaite V. Nitric oxide and mitochondrial respiration in the heart [J]. Cardiovascular Research, 2007, 75(2): 283—290

THE EFFECTS OF ACUTE COPPER STRESS ON TCA CYCLE AND FREE RADICAL METABOLISM IN THE LIVER OF HOPLOBATRACHUS CHINENSIS

LI Bin, HUANG Yan, SHAO Chen and WANG Yu
(Institute of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

In this study, we applied acute toxicity test to investigate the toxic effects of copper ion (Cu2+) on tricarboxylic acid cycle (TCA) and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of Hoplobatrachus chinensis. We treated the animals with Cu2+at different concentrations and for different exposure time, and tested the activities of TCA-related enzymes and free radicals. We found that although Cu2+at high concentrations could reduce the activity of ICDHm, prolonged exposure time had no significant effect on ICDHm (P ＞ 0.05). We did not observe cross effects between the concentration of Cu2+and the exposure time on the activity of ICDHm (P ＞ 0.05). However there were significant cross effects between the exposure time and the concentration of Cu2+on the activity of α-KGDH (P ＜ 0.05). The activity of α-KGDH decreased when exposed to Cu2+, and the lowest activities were detected when the exposure times were 24h and 96h and concentrations were 4.0 and 6.0 mg/L. In terms of free radical metabolism, the exposure time and copper concentration had strong cross effects on the activities of anti-·O2–and H2O2(P ＜ 0.05), but not on the activity of inhibit-·OH, the content of NO, and the activity of NOS. The activities of anti-·O2–decreased along with the increase in the concentration of Cu2+. The content of H2O2increased after the treatments and perked at 24h and 6.0 mg/L. There was a negative correlation between the activity of inhibit-·OH and the exposure time and the concentration of Cu2+. Along with the increase in the concentration of Cu2+, the content of NO and the activity of NOS first increased and then decreased to the values of the control group, and the maximum values appeared in the 6.0 mg/L group. Our study demonstrated that the acute exposure of Cu2+could have significant toxic effects on TCA cycle and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of H. chinensis.

Hoplobatrachus chinensis; Copper ion; TCA cycle; Free radical metabolism; Toxic effect

Q593+.1

A

1000-3207(2015)06-1160-09

10.7541/2015.152

2014-11-10;

2015-04-17

國家自然科學基金(31400472); 浙江省自然科學基金(LQ14C040001); 浙江師范大學博士科研啟動基金(ZC304013020)資助

李斌(1988—), 男, 湖北孝感人; 碩士; 研究方向為動物資源與保護生物學。E-mail: libinldgl@126.com

王宇, E-mail: yuwang@zjnu.edu.cn