沉水植物恢復對湖泊沉積物產甲烷菌的影響研究

徐 思張 丹王艷云周巧紅王亞芬劉碧云賀 鋒吳振斌

(1. 武漢理工大學資源與環境工程學院, 武漢 430070; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

沉水植物恢復對湖泊沉積物產甲烷菌的影響研究

徐 思1, 2張 丹2王艷云2周巧紅2王亞芬2劉碧云2賀 鋒2吳振斌2

(1. 武漢理工大學資源與環境工程學院, 武漢 430070; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

為探明沉水植物恢復對湖泊沉積物中產甲烷菌的影響, 本文選用杭州西湖沉水植物恢復區域進行研究, 同時對比分析未進行沉水植物恢復區域。產甲烷菌多樣性和群落結構分析采用限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)及分子克隆等技術。研究結果表明, 沉水植物恢復區產甲烷菌OTU類型均數為13種, 高于沉水植物匱乏區域的9種; 并且沉水植物恢復區的Shannon指數、Simpson多樣性指數較對照區分別高21.7% 和9.5%, 表明沉水植物的恢復有利于提高沉積物中產甲烷菌群落結構多樣性。就產甲烷菌種類而言, 沉水植物的恢復對甲烷微菌綱 Methanomicrobia等影響不顯著, 恢復區和匱乏區分別占 43.6%—67.4%、41.5%—58.1%。甲烷球菌綱Methanococci在沉水植物恢復區和匱乏區的存在量較少, 分別占1.7%和4.1%。而沉水植物的恢復一定程度上提高甲烷桿菌綱Methanobacteria的比例, 較匱乏區高14.6%, 且僅在恢復區檢測到甲烷桿狀熱菌科Methanothermaceae和甲烷八疊球菌科Methanosarcinaceae。

沉水植物恢復; 沉積物; 產甲烷菌; 限制性片段長度多態性; 克隆

甲烷(CH4)是產甲烷菌在厭氧條件下分解有機質而產生的溫室氣體, 它對全球氣候變暖的貢獻僅次于CO2[1, 2]。自20世紀80年代, 甲烷的溫室效應已達到20%, 且每年以0.8%—1.0%的速度增加, 可見甲烷對溫室效應的作用越來越大。湖泊是大氣CH4的主要來源, 目前國內對湖泊 CH4總釋放量的研究主要集中在源與匯的探討上[3—5]。在低溫條件下, 我國八大淡水大型湖泊作為大氣 CH4的源, 主要源于沉積物的產甲烷古菌, 其在厭氧條件下, 利用有機質作為能量來源, 以H2或甲酸鹽為電子受體,產生并釋放甲烷[6]。因此, 為全面了解甲烷釋放的根源, 開展湖泊沉積物中產甲烷菌多樣性和群落結構的研究顯得尤為必要, 將為準確估算湖泊沉積物中CH4排放量提供數據支撐。

富營養化已日益成為一個全球范圍內的水環境污染問題, 富營養化的加劇, 常伴隨著藻類水華的暴發、水生動植物的急劇減少等現象[7]。目前湖泊沉水植物的恢復已經成為重建湖泊生態系統的重要措施之一[8]。研究表明沉水植物可改變湖泊沉積物的局部氧化還原狀態, 影響著沉積物中微生物的活動及組成[9, 10]。作為湖泊沉積物中的厭氧功能細菌產甲烷菌, 其群落結構和多樣性受沉水植物恢復的影響研究卻少有報道[11]。為此, 本文以西湖為實驗對象, 采用 PCR-RFLP和克隆文庫的分子生物學方法, 通過對比沉水植物恢復湖區和未恢復湖區的產甲烷菌群落結構的差異性, 反映沉水植物的恢復對產甲烷菌群落結構的影響, 為揭示沉水植物在恢復過程中對湖泊甲烷氣體的影響提供生物學支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自杭州西湖沉水植物恢復區, 包括茅家埠、烏龜潭、浴湖灣(編號1Y、2Y、3Y), 以及沉水植物匱乏區, 包括外湖湖心、西里湖、北里湖(編號1N、2N、3N), 共 6個采樣點, 中心位置為N30°14′45″, E120°08′30″, 采樣點如圖1。其中茅家埠、烏龜潭、浴湖灣在“十一五”水專項的支持下從2011年開始恢復沉水植物, 至采樣期間水生植物蓋度達到30%—70%, 而西湖外湖湖心、西里湖、北里湖湖區未進行水生植物恢復, 沉水植物蓋度低于2%。

2013年 12月于相應位點采用柱狀采泥器隨機采集表層0—20 cm底泥樣品3份, 混勻, 轉移至實驗室–80℃冰箱中保存, 以備后期DNA的提取和產甲烷菌群落結構的分析, 并采用哈希HQ40d便攜式在線監測儀器監測記錄水樣相關理化指標, 手持測深儀(Speedtech SM-5)測定水深。

1.2 測定方法

沉積物含水率測定采用干燥恒重法, 土壤活性有機碳采用333 mmol/L KMnO4氧化法, 底泥總磷測定采用鉬酸銨分光光度法(GB11893-89), 總氮采用過硫酸鹽消化法(GB11894-89)。

1.3 DNA提取和PCR

沉積物總DNA提取采用SDS高鹽抽提法, 并測定DNA的濃度和純度。采用古菌16S rRNA的特異性引物對其進行PCR擴增, 正向引物A109f (5′-A CKGCTCAGTAACACGT-3′), 反向引物是 A912rt (5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3′)[12, 13]。30 μL 的PCR反應液組成: TaKaRa Taq HS(5 U/μL)0.2 μL、10×PCR Buffer 3 μL、dNTP Mixture (Mg2+) 2.4 μL、DNA Template 1 μL、引物各1 μL, 滅菌蒸餾水稀釋至30 μL。PCR反應條件為: 94℃預變性5min, 94℃變性60s、54℃退火90s、72℃延伸60s, 反應35個循環, 最后72℃延伸6min, 4℃保溫。采用Gel Extraction Kit (EZgeneTM)對3次的PCR平行產物進行切膠純化回收目的片段, 以去除小片段的 DNA分子等雜質。

1.4 克隆及RFLP

圖1 杭州西湖采樣位點圖(黑色方塊)Fig. 1 Sampling sites in the West Lake, Hangzhou (Black block)

將PCR產物連接到pMD18-T Vector (TakaRa),然后轉入大腸桿菌 DH5α, 建立克隆文庫, 其中10 μL的連接液組成: Insert DNA 4.5 μL、pMD18-T Vector 1 μL, 滅菌蒸餾水稀釋至10 μL。每個文庫選取45個陽性克隆, 通過16S rRNA的引物對A109f/ A912rt進行擴增, 產物用限制性內切酶HaeⅢ于37℃酶切3—4h, 產物通過2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,具有相同酶切條帶的陽性克隆子定義為一個分類操作單元, 即OTU。將不同的OTU進行測序分析, 測序由上海睿迪生物科技有限公司完成。16S rRNA基因的測序結果通過BLAST(http://www.Ncbi.nlm.nih. gov/blast)進行數據庫比對, 然后使用 MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件, 運用最相似進化距離法(MJ法)構建系統發育樹。

1.5 數據處理與分析

數據的統計分析主要使用Excel軟件、origin軟件進行, 產甲烷菌群落結構和多樣性分析采用克隆文庫覆蓋率、Shannon指數和Simpson指數等指標,其中計算公式如下:

其中, i為第i個采樣點; s為采樣咪總數; ni為第i個采樣點的OUT種類數; Ni為第i個采樣點的陽性克隆子數; Pi為第i個采樣點的OUT種類數占陽性克隆子數的比例。

2 結果

2.1 采樣區理化指標分析

沉水植物恢復區(1Y、2Y和3Y)主要為狐尾藻、菹草, 且透明度見底, 而沉水植物匱乏區(1N、2N、3N)幾乎無沉水植物存在, 采樣點各理化指標如表1。其中, 湖泊沉水植物恢復區的水深較匱乏區存在顯著差異, 均值相差90 cm。沉水植物恢復區的水體pH均值為7.78, 較匱乏區的均值pH低0.23。種植沉水植物的湖泊區域, 其底泥溫度普遍較匱乏區的低, 同一時期最大溫差達2.0℃。對于采樣點的底泥含水率, 沉水植物恢復區的含水率集中在 50.0%—65.0%, 而匱乏區的底泥含水率均高于前者, 其最大含水率較沉水植物恢復區含水率的均值高出39.2%,表明沉水植物的根系環境對湖泊底泥起到一定的固定作用, 從而影響微生物的棲息區域。相對于匱乏區, 沉水植物恢復區的氧化還原電位(ORP)較低,約為–130 mV, 可能因為冬季部分沉水植物根系逐漸衰亡腐敗, 生物殘留使得沉積物局部缺氧[14]。另外, 沉水植物恢復區沉積物的氮均值顯著高于匱乏區, 約為2.608 g/kg, 而恢復區和匱乏區的沉積物中總磷含量相差不大, 集中在0.508—0.797 g/kg?；謴蛥^中活性有機碳最大值較匱乏區活性有機碳均值低 16.34 mg/kg, 該差值幾乎占到恢復區活性有機碳均值的 36.4%, 說明沉水植物的恢復在一定程度上促進細菌包括產甲烷菌群落對活性有機碳的間接利用率。

2.2 克隆文庫分析

沉水植物恢復區和匱乏區的16S rRNA克隆文庫的陽性克隆子總數分別為132、124, 陽性克隆經過限制性酶 HaeIII酶切, 凝膠電泳分析后, 共得到24種不同條帶類型, 分別命名為OTU1-OTU24, 其中沉水植物恢復區和匱乏區的克隆文庫 OTU類型數分別為 16、15種。6個克隆文庫的覆蓋率介于67.4%—81.4%, 說明實驗分析的陽性克隆子數較好地反映采樣位點處產甲烷菌群落結構的多樣性, 代表性比較高。反映克隆文庫中 OTU的豐度和均勻度的綜合性指標Shannon指數、Simpson多樣性指數如表2, 可以得出, 沉水植物恢復區的多樣性指數較匱乏區分別高21.7%、9.5%, 表明基于16S rRNA的產甲烷菌群落結構多樣性在沉水植物恢復區表現得更高。

表1 湖泊沉水植物恢復區和匱乏區的主要理化指標Tab.1 Major physicochemical indicators of the submerged macrophytes rehabilitation (SMR) areas and scarce areas

2.3 限制性片段長度多態性分析RFLP

沉水植物恢復區和匱乏區所對應各采樣點, 各個克隆文庫的 OTU所占比值如圖 2所示。其中, OTU1、OTU9共同存在于沉水植物恢復區和匱乏區的采樣點中, 分別占兩者總 OTU數量的 47.0%和53.0%, 為湖泊產甲烷菌群落優勢種的條帶類型。OTU6、OTU7、OTU19、OTU20、OTU22共5種OTU類型均勻的分布在恢復區和匱乏區。從表3可以得出, 沉水植物恢復區的獨特 OTU類型數達到 9種,較匱乏區的獨有OTU類型數多2種, 兩采樣區的獨特OTU統計如表3, 恢復區的獨特OTU類型主要分布在典型和常見OTU類型中, 占該采樣區總OTU類型數的50.0%。而匱乏區的獨特OTU類型主要為罕見OTU類型, 占該匱乏區總OTU類型數的30.0%。

表2 基于RFLP類型的沉水植物恢復區和匱乏區的克隆文庫多樣性指標Tab. 2 The diversity indices of the SMR areas and the scarce areas based on RFLP patterns

圖2 沉水植物恢復區(1Y、2Y、3Y)和匱乏區(1N、2N、3N)的OTU所占比例圖Fig. 2 OTU proportion of the SMR areas and the scarce areas

表3 沉水植物恢復區和匱乏區的OTU分類統計表Tab. 3 OTU classification of the SMR areas and the scarce areas

2.4 系統發育樹分析

產甲烷菌 16SrRNA的測序結果與已知系列進行比對, 相似度為 83%—100%, 其中相似度達到97%的序列占到 60.0%。產甲烷菌屬于古菌域的廣古菌界, 目前主要分為甲烷微菌目 Methanomicrobiales、甲烷八疊球菌目Methanosarcinales、甲烷桿菌目 Methanobacteriales、甲烷球菌目 Methanococcales、甲烷火菌目Methanopyrales, 前四者在本次研究中均有檢測到。根據產甲烷菌的生存環境和形態的差異性, 各甲烷菌目可衍生出群落結構多樣性的甲烷菌科和甲烷菌屬等。

產甲烷古菌16S rRNA的系統發育樹如圖3, 文庫中 53.4%的序列為甲烷微菌綱 Methanomicrobia,如屬于甲烷微菌目 Methanomicrobiales的甲烷產生菌屬Methanogenium、甲烷囊菌屬Methanoculleus、Methanoregulaceae和甲烷蠅菌屬Methanolinea等。其中, 與甲烷八疊球菌目 Methanosacrinales相近的菌群主要來源于三峽庫區的稻田底泥和 Monoun湖區的缺氧沉積物, 相似度達到 97%; 與 Methanoregulaceae相近的菌群主要來源于厭氧消化器中的微生物群落, 該菌大量的存在于春季的沼澤地中。

西湖沉水植物恢復區和匱乏區沉積物產甲烷菌測序結果表明, 甲烷微菌綱 Methanomicrobia在兩大采樣區中的差異性不顯著, 其作為優勢綱, 分別占到43.6%—67.4%、41.5%—58.1%, 主要有甲烷微菌目Methanomicrobiales、甲烷八疊球菌目Methanosacrinals, 其中甲烷微菌目Methanomicrobiales分別占沉水植物恢復區和匱乏區中甲烷微菌綱Methanomicrobia的93.5%和78.8%, 說明種植沉水植物對西湖底泥產甲烷菌的優勢種甲烷微菌綱 Methanomicrobia影響不大。甲烷桿菌綱Methanobacteria在匱乏區的僅一個采樣點存在, 約為該采樣點總菌數的2.4%, 比例較低, 但在沉水植物恢復區的三個采樣點均有檢測到, 部分比例高達 17.0%, 受沉水植物的影響比較顯著。甲烷球菌綱Methanococci在沉水植物恢復區和匱乏區的存在量較少, 分別占到1.7% 和4.1%。在沉水植物恢復區和匱乏區中, 同時存在大部分未知古菌。

沉水植物恢復區和匱乏區的四大產甲烷菌目下級的各產甲烷菌科的比例如圖 4所示, 甲烷微菌科Methanomicrobiaceae大量的存在于采樣區域, 為優勢產甲烷菌科, 與其同屬于產甲烷微菌目的甲烷八疊球菌科Methanosarcinaceae僅在沉水植物恢復區中發現。另外, 甲烷鬃菌科Methanoseataceae、甲烷暖球菌科 Methanocaldococcaceae、甲烷桿菌科Methanobacteriaceae這3種產甲烷菌科均存在于兩大采樣區, 而前兩者在沉水植物恢復區的比例明顯較匱乏區低。甲烷熱菌科 Methanothermaceae僅存在于沉水植物恢復區。

3 討論

現階段, 國內外對湖泊沉水植物的恢復對沉積物中產甲烷菌群落結構和多樣性的研究較少, 產甲烷菌作為專性厭氧菌, 理論上僅能生存于低含氧量且含有 H2/甲酸鹽的環境中, 其群落結構多樣性的研究也大部分集中在自然濕地等厭氧生境[15—20]。佘晨興等[21]研究表明, 在閩江口蘆葦沼澤濕地存在著3大類群: 甲烷桿菌目 Methanobacteriales、甲烷微菌目Methanomicrobiales、甲烷八疊球菌目Methanosarcinales, 且該區域不同土壤深度的甲烷菌群落分布呈現出不同的特征。Galand等[22]采用DGGE和RFLP等方法, 研究表明泥炭地中施灰肥對甲烷的潛在產生力和產甲烷菌群落結構沒有顯著影響, 且深層和淺層泥炭層中主要存在著氫營養型產甲烷菌。Glissmanm等[23]研究德國東北部Dagow湖泊沉積物發現, 溫度變化首先會影響產甲烷菌的功能活性, 其次是產甲烷菌群落結構。上述也為在沉水植物恢復區和匱乏區的底泥中檢測到大量的產甲烷菌群落的研究提供實例支撐。

沉水植物作為湖泊水體中的高等植物, 對水生生態系統的維持、物質循環和能量傳遞中起著重要的調控作用[24]。本文研究發現沉水植物恢復區產甲烷菌群落結構的多樣性均較匱乏區的高, 主要表現在沉水植物恢復區的克隆子經過限制性片段長度的多態性分析, 湖區的 OTU類型平均數多達13種, 明顯高于匱乏區平均9種OTU類型。在沉水植物恢復區, 植物根系和沉積物大面積地接觸,根系黏附作用吸附根系局部區域凝集的菌膠體,可防止由于水流的攪動而破壞細菌的生態位, 為產甲烷菌的生存提供較大的固定空間, 從物理層面上解釋沉水植物恢復區中產甲烷菌群落結構多樣性較匱乏區的高。

圖3 沉水植物恢復區和匱乏區基于16S rRNA的系統發育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of the SMR areas and the scarce areas based on 16S rRNA

圖 4 各產甲烷菌科在沉水植物恢復區和匱乏區的比例圖(‘M.’為‘Methano’縮寫)Fig. 4 The proportion of methanogens in the SMR areas and the scarce areas (‘M.’ for ‘Methano’)

在沉水植物存在下, 沉積物中氮磷濃度會呈現不同程度的降低[25]。在本研究中沉水植物恢復區總氮也有一定的降低, 但沉積物總磷在恢復區和匱乏區中差異不顯著?？赡茉蚴且巴庠囼灨鲄^域中本底營養鹽濃度的差異; 已有的研究主要采用室內實驗進行相應環境因子的人為控制, 進而能比較出沉水植物對沉積物中營養鹽的影響。

沉水植物恢復區的ORP值較匱乏區的低, 原因可能是沉水植物最適生長季節的差異性, 使得臨近冬季采樣時, 恢復區中部分種類的沉水植物處于生長旺盛期, 比如菹草, 而狐尾藻、金魚藻等沉水植物開始出現衰亡現象, 衰亡沉水植物根系的腐敗引起沉積物中厭氧微生物的活性增強, 碳源消耗速率加快。雖然旺盛期沉水植物根系具有泌氧功能, 但對沉積物ORP的貢獻率較前者小, 兩者的綜合作用使得恢復區的ORP較低, 也為厭氧菌產甲烷菌的群落結構多樣性提供依據。

Lee等[26]通過DNA穩定同位素13C探針檢測方法, 證實在甲酸鹽和 H2/CO2存在的土壤微環境中,亦存在著甲烷八疊球菌屬 Methanosarcina、甲烷桿菌屬Methanobacterium等的生長。Leybo等[27]研究表明在穩定條件下, 乙酸、H2/CO2兩種營養型產甲烷菌比例為 2∶1, 其中僅屬于甲烷八疊球菌科Methanosarcinaceae的甲烷菌群可以利用乙酸、甲酸和甲基, 其他產甲烷菌目皆只能利用H2/CO2或甲酸基質[28]。這說明Methanosarcinaceae可利用的營養基質較其他產甲烷菌豐富, 沉水植物根部吸收底泥中的營養物質, 通過同化作用將營養物質轉化為自身生長所需的物質, 同時也不斷地向沉積物中分泌大量的有機化合物(碳水化合物、氨基酸以及有機酸等)[29], 可供根系產甲烷菌利用; 另外部分發酵性細菌可代謝這些有機物, 產生多種有機酸(主要成分為乙酸)[30], 而豐富的代謝基質也選擇性存在著結構多樣性的產甲烷菌, 這也解釋僅在沉水植物恢復區中檢測到 Methanosarcinaceae, 且甲烷桿菌目在恢復區中大量存在。由于氫營養型的甲烷微菌目Methanomicrobiales生長周期較其他產甲烷菌目短, 且營養利用效率高, 故在沉水植物恢復區和匱乏區都是作為優勢種存在, 沒有顯著差異。在我國鄱陽湖、洪澤湖和青藏高原若蓋爾濕地均有檢測出該菌[31, 32]。

從微生物角度開展沉水植物恢復對湖泊沉積物中產甲烷菌群落結構和多樣性的影響研究, 為更深層次的研究湖泊甲烷釋放提供生物學支撐。對單種沉水植物或者其覆蓋率、不同生長期對產甲烷菌結構多樣性的影響是否存在, 后期還需通過大量的實驗來佐證。并且湖泊底泥產甲烷菌的群落多樣性及其分布與甲烷氣體的最終逸出量的相互關系也是今后研究的一大重點, 將沉水植物的恢復情況與甲烷氣體釋放的緊密結合也是湖泊研究需考慮的熱點。

致謝:

本研究采樣過程中課題組常駐西湖工作站同學提供諸多幫助, 及資料整理過程中, 左進城博士提供相關數據, 在此表示感謝; 并感謝課題組張甬元、劉保元老師的悉心指導。

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IMPACTS OF SUBMERGED MACROPHYTES REHABILITATION ON THE METHANOGENIC COMMUNITY IN THE SEDIMENT OF FRESHWATER LAKES

XU Si1, 2, ZHANG Dan2, WANG Yan-Yun2, ZHOU Qiao-Hong2, WANG Ya-Fen2, LIU Bi-Yun2,
HE Feng2and WU Zhen-Bin2
(1. School of Resource & Environmental Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

In this study, we investigated the impacts of submerged macrophytes rehabilitation (SMR) on the methanogenic community structure in the lake sediments. We compared the diversity and structure of methanogenic populations between the SMR areas and the plant scarce areas in the West Lake of Hangzhou by using restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and molecular cloning techniques. The results showed that the average OTU type number in the SMR areas was 13, and the number was 9 in the scarce areas. Shannon-Weaver diversity and Simpson’s evenness in the SMR areas were 21.7% and 9.5% respectively, which were higher than those in the control areas. This indicated that the diversity of the methanogenic community structure could be improved by the rehabilitation of submerged macrophytes. The in-depth analysis suggested that SMR had no significant effect on Methanomicrobia that accounted for 43.6%—67.4% and 41.5%—58.1% in the SMR areas and the scarce areas respectively. Methanococci was rare in both the SMR areas (1.7%) and the scarce areas (4.1%). We also found that the proportion of Methanobacteria in the SMR areas was 14.6% higher than in the scarce areas. Methanothermaceae and Methanosarcinaceae were only detected in the SMR areas.

Submerged macrophytes rehabilitation; Sediment; Methanogens; RFLP; Clone

X172

A

1000-3207(2015)06-1198-09

10.7541/2015.156

2014-09 -30;

2015-05-25

水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07101007-005); 國家自然科學基金(31123001); 湖北省自然科學基金(2010CDA066)資助

徐思(1990—), 女, 湖北隨州人; 碩士; 主要研究環境微生物學。E-mail: xusi1990@126.com

周巧紅(1977—), 女, 湖北羅田人; 副研究員, 碩士生導師; 主要從事環境微生物學研究。E-mail: qhzhou@ihb.ac.cn