應用宏基因組學鑒定國內第一株鴨2型腺病毒

陳 峰，招麗嬋，覃健萍，周慶豐，羅玉子，林麗苗，操 勝，李海燕

(1.華南農業大學動物科學院，廣東廣州 510642；2.廣東溫氏食品集團股份有限公司溫氏集團研究院(技術中心)，廣東云浮 527439；3.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001)

腺病毒(Adenovirus)為線性雙鏈DNA 病毒，基因組約35 kb，是家禽和野鳥常見病原，許多腺病毒可以在健康禽體內復制，癥狀非常輕微，然而有些腺病毒(如火雞出血性腸炎病毒等)則能夠引起較高的發病率和死亡率。近年來，對禽腺病毒的研究主要集中在Ⅰ、Ⅲ亞群禽腺病，但大多數禽腺病毒對禽類的致病作用尚未完全確定。某些種腺病毒株具有肝細胞嗜性，并且能夠在特定的情況下導致嚴重的肝損傷、包涵體肝炎(IBH)[2-3]。

宏基因組學(Metagenomics)是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以測序分析為研究手段，不需分離培養即可鑒定微生物群落組成的方法。主要技術包括DNA 的提取、文庫的構建和高通量測序分析，可用于發現新基因、開發新的生物活性物質、研究群落中微生物多樣性和基因組成與功能預測等方面。該方法不依賴已知核酸序列和病毒分離培養，彌補了傳統檢測方法的不足，在新發、突發感染性疾病的診斷中表現出極大優勢，已在諸多領域得到廣泛應用。

本實驗從廣東某地區20 日齡～30 日齡發生嚴重肝臟腫大、斑駁狀出血、白色點狀壞死的番鴨病料樣品中分離到一株無血凝性能致細胞病變的未知病毒，采用常規方法未能就其分類歸屬給出明確的結論。因此，為明確該病毒的分類地位及遺傳進化，本研究利用宏基因組學對該病毒分離株部分基因組進行克隆和序列分析，為進一步對該病的深入研究及防控提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 病料樣品采自廣東某鴨場20日齡～30 日齡發病番鴨，病死鴨肝臟表面呈彌漫性樣出血壞死，脾臟胰腺腫大出血等；番鴨胚購自云浮市云城溫氏畜牧有限公司；番鴨胚成纖維細胞(MDEF)選用12 日齡～14 日齡番鴨胚按常規方法制備。DNase I、RNase A、RNA 酶抑制劑(RRI)、dNTP(2.5 mM)、MgCl2、Ex Taq HS 酶及pSIMPLE18 Eco RV/BAP 載體購自TaKaRa 公司；TRIzol 試劑、Super-Script III 反轉錄試劑盒購自Invitrogen 公司；3'-5'exo-Klenow DNA Polymerase 購自NEB 公司；限制性內切酶Eco RV 購自Fermentas 公司；Tissue DNA Kit、Cycle-pure Kit 和Plasmid Mini Kit 購自Omega公司；Gel Extraction Mini Kit 購自上海華舜生物技術有限公司；TOP10 感受態細胞購自北京博邁德生物技術有限公司。

1.2 病毒分離 將發病鴨肝臟、胰腺、脾臟等組織病料樣品研磨勻漿，加入一定比例的青霉素、鏈霉素生理鹽水，反復凍融3 次，3 000 r/min 離心10 min，取上清經尿囊腔接種于9 日齡～11 日齡番鴨胚(0.2 mL/枚)。孵化，觀察鴨胚死亡情況并收獲24 h～96 h 番鴨胚尿囊液，并盲傳3 代。

1.3 病毒對MDEF致病性及TCID50測定 將F3 代病毒尿囊液接種于MDEF，每天觀察細胞病變(CPE)情況，并傳至F6 代。常規方法測定病毒TCID50，每天觀察CPE 情況至感染后7 d，按Reed-Muench 法計算TCID50。

1.4 PCR檢測 按照本實驗室建立的常規PCR 方法(未發表)對采集的病料樣品和分離病毒尿囊液、細胞培養病毒液進行鴨肝炎病毒(DHV)、鴨乙型肝炎(DHBV)、鴨瘟病毒(DPV)、呼腸孤病毒(MDRV)、新型呼腸孤病毒(NDRV)、細小病毒(MPV)及小鵝病毒(GPV)等病原檢測。

1.5 未知病原的宏基因組學方法建立

1.5.1 病毒培養物前處理及核酸提取 將能夠導致CPE 但經多種常規方法未能確定病原的細胞培養病毒液進行前處理，12 000 r/min 離心5 min，取上清用0.22 μm 濾膜過濾，取濾液加入DNase I 和RNase A，37 ℃水浴3 h，以降解樣品中宿主游離核酸，置75 ℃水浴10 min，滅活DNase I。處理后的樣品均分成兩份，采用試劑盒分別提取病毒DNA及RNA，具體操作參照說明書進行。

1.5.2 cDNA 的制備及隨機PCR 擴增 參考文獻[4]合成反轉錄引物FR26RV-N、隨機PCR 單引物FR20RV。提取樣品RNA，按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄及合成雙鏈DNA。以雙鏈cDNA 和雙鏈DNA 作為模板，利用FR20RV 單引物進行隨機PCR擴增[5]，采用試劑盒純化回收PCR 產物。經Eco RV切除引物序列后膠回收目的片段。

1.5.3 PCR 產物克隆測序及序列分析 將回收的DNA 片段克隆于pSIMPLE18 Eco RV/BAP 載體中，并轉化TOP10 感受態細胞，挑取單菌落進行菌液PCR 鑒定，隨機挑取50 個片段大小不等的陽性克隆由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。利用DNAStar 軟件進行拼接并去除載體序列，應用NCBI 數據庫中Blastn 和Blastx 工具進行比對，以確定其同源性。對部分低同源性的病毒樣序列利用DNAStar 軟件包的MegAlign 軟件結合GenBank中參考序列的氨基酸序列進行多序列比對，從而進行人工輔助鑒定。

1.6 序列分析結果的驗證 根據所測定的序列結果設計合成特異性的引物，對該分離培養病毒基因進行PCR 擴增，以驗證序列的真實性。同時利用DNAStar 及MEGA5.0 等軟件對本研究分離株與國內外報道的參考病毒株相應基因序列進行核苷酸及氨基酸序列比對，分析其遺傳進化關系。

2 結果

2.1 發病情況及流行特點 本研究從廣東地區發生疑似“肝壞死”發病鴨群展開調查并收集病料樣品，該鴨群發病日齡在20 日齡～30 日齡，累計發病死亡率達6.75 %，發病鴨臨床表現精神沉郁，死亡鴨只剖檢見肝臟蒼白腫大、彌漫性出血嚴重，呈斑駁狀病伴有白色壞死點，脾臟腫大充血壞死，腎臟充血腫大黃色條索狀。

2.2 病毒分離及常規病原檢測 病料樣品研磨上清液接種9 日齡～11 日齡番鴨胚后出現不規律死亡，收獲的尿囊液對鴨紅血細胞懸液不具凝集活性；利用常規PCR 方法對病毒樣品進行DHV、DHBV、DPV、MDRV、NDRV、MPV 及GPV 等病毒檢測，結果均為陰性。

2.3 病毒對MDEF細胞致病性及TCID50測定 F6代病毒分離株在MDEF 中培養48 h 后細胞開始出現核固縮，細胞間界限模糊，72 h 后，細胞變圓聚堆細胞，形成明顯的類葡萄串樣CPE(圖1)。經測定F6 代病毒株在MDEF 細胞中的TCID50為log105.0TCID50/mL。

圖1 病毒分離株感染MDEF 細胞病變圖Fig.1 Virus isolation in MDEF cells

2.4 未知病原的宏基因組學檢測 從疑似發病番鴨病料樣品中分離獲得一株能夠引起鴨胚死亡，并能夠引起MDEF 細胞產生CPE 的未知病原，暫命名為ZLY 株。利用實驗室常用的血清學和分子生物學診斷方法均未能對其明確分類。

應用宏基因組學方法對未知病原細胞培養物進行檢測，選取50 個片段大小不同的克隆進行測序，將測序的50 條基因序列在NCBI 數據庫進行BLAST 比對分析，結果顯示有28 個鴨2 型腺病毒(DAdV-2)同源序列，同源性為92 %～99 %。利用SeqManⅡ?軟件將這28 個序列排列成8 個毗連序列群(Contig)，散在分布于DAdV-2 基因組的8 個區域(圖2A)。這28 個與DAdV-2 同源序列去掉重復序列后共有15 107 bp，覆蓋了整個DAdV-2 病毒基因組全長的34.54 %(圖2B)。另有鴨染色體DNA 同源序列、線粒體同源序列、細菌相關同源序列及克隆載體相關序列。

圖2 8 個毗連序列群在DAdV-2 基因組中的位置Fig.2 The position of the eight contig in DAdV-2 genome

2.5 測定序列特異性驗證 根據序列測定結果，設計合成一對引物跨越毗連序列群之間長1 233 bp 未測定序列，利用該對引物對病毒培養物和細胞對照進行擴增。結果顯示，從病毒培養物擴增出大小相符的目的片段，而細胞對照無擴增(圖3)。對擴增產物進行測序、拼接后，通過NCBI BLAST 比對分析，進一步證明測定的序列為病毒本身序列，屬于DAdV-2。該片段覆蓋DAdV-2 全基因組中的部分hexon 基因，核苷酸長1 233 bp，編碼411 個氨基酸。

圖3 病毒分離株PCR 鑒定Fig.3 Identification of the virus isolate by RT-PCR

2.6 分離株部分hexon基因遺傳進化分析 將測序結果與GenBank 中登錄的禽腺病毒相應序列通過DNAStar 及MEGA5.0 軟件進行序列比較分析表明：本研究分離株與目前GenBank 數據庫僅有的DAdV-2 GR 株部分hexon 基因核苷酸、氨基酸同源性分別為74.1 %和83.3 %，與GoAdV-4 及PiAdV-1 病毒部分hexon 基因氨基酸同源性為78.2 %和68.5 %，與Ⅲ亞群禽腺病毒及哺乳動物類腺病毒氨基酸同源性則同源性較低。進化樹結果顯示，本研究分離株與GenBank 中唯一的DAdV-2 GR 分離株親緣關系最近，與GoAdV-4 及PiAdV-1 形成一個進化分支，與I 亞群禽腺病毒屬其他型腺病毒類聚于一大分支，與Ⅲ亞群禽腺病毒屬中產蛋綜合征病毒及相關病毒則不在一個分支，遺傳進化距離較遠(圖4)。

3 討論

本研究從發生疑似“肝壞死”病死鴨中分離得到的一株具有致CPE 作用的病毒株，采用本實驗室建立的不同病原常規PCR 檢測方法未能對其明確分類。因此，有必要采取一種能夠擴增未知序列的方法對該病毒株的基因進行擴增及測序分析以明確其分類地位。本實驗以病毒宏基因組學為基礎構建未知病毒檢測技術平臺，序列測定結果表明，ZLY 病毒株為DAdV-2，是I 亞群禽腺病毒成員之一，為我國首例報道DAdV-2 感染病例及國內首個分離株。

圖4 DAdV-2 ZLY 分離株部分hexon 基因遺傳進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of adenovirus partial hexongenes based on amino acids sequences

腺病毒科不同腺病毒屬各成員之間的序列差異較大，I 亞群禽腺病毒作為原發病原的作用研究尚不清楚，不同的血清型，甚至相同血清型的不同病毒株在引起發病和死亡的能力也有所不同[6-7]。目前報道較多為FAdV-1～8,10 型引起雞包涵體肝炎，FAdV-4 引起心包積水綜合征，此外在珍珠雞中也報道過與腺病毒感染相關的壞死性胰腺炎[8-9]。因此，開展該分離株的血清學及動物致病性鑒定，同時完成該病毒全基因組測序分析將是下一步研究的重點。ZLY 分離株感染番鴨胚能夠引起不規律死亡，造成鴨胚肝臟的損傷，同時能夠引起MDEF 細胞產生明顯CPE，與文獻[10,12]報道的I 亞群腺病毒屬中的DAdV-2 及GoAdV-4 感染特性有相似之處。從臨床病料樣品及細胞培養病毒中擴增出部分hexon 基因，序列測定結果與參考病毒株序列比對分析顯示，ZLY 分離株與GenBank 數據庫中唯一的DAdV-2 GR 株氨基酸同源性最高，與GoAdV-4 及PiAdV-1次之，而與其他包括產蛋綜合征病毒在內的其他禽腺病毒氨基酸同源性則在30 %不等。推測該疾病的發生和流行可能與地域性混合飼養雞、鴨、鵝及鴿子有一定的相關性，而不同分支病毒株在親本動物及不同動物間其動物致病性差異程度則有待進一步研究。

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