不同氮濃度下鹽脅迫對壇紫菜(Pyropia haitanensis)生長和光合作用的影響*

吳海一 丁 剛 徐智廣①

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104; 2. 青島市大型海藻工程技術研究中心 青島 266104)

壇紫菜(Pyropia haitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬(Pyropia), 是中國南方海域重要的大型經濟海藻, 由于在食品、紡織、醫藥等行業的廣泛應用, 其人工養殖面積和規模越來越大, 成為南方海藻栽培的主要品種之一(Fei, 2004)。壇紫菜生活于南方暖溫海域潮間帶, 在干出和沉水的交替過程中, 經歷著光照、鹽度、溫度以及碳、氮營養等環境因子的劇烈變化, 而這些環境條件的頻繁變動,往往對壇紫菜生理特性產生或正或負的影響, 成為該藻正常生長的促進或脅迫因子。已有的研究表明:壇紫菜的生長和光合作用被高溫脅迫(王淑剛等,2013)、紫外線輻射(姜紅霞等, 2009; 徐軍田等, 2013)以及高濃度氨氮(秦梅等, 2014)所抑制; 提高 CO2的濃度水平不僅提高該藻的生長速率和光合固碳, 還能夠緩解紫外線(徐軍田等, 2013)和氨氮(秦梅等,2014)的負面影響; 氮、磷營養鹽的濃度水平對壇紫菜的生長和光合色素合成也能夠產生直接影響(柳佩娟等, 2009)。

鹽度是影響藻類生理活動的一個重要環境因子。在不同的分布區域, 海水的鹽度存在著很大的差異,外海的鹽度一般在34—37, 在河口區, 由于河流淡水的注入, 鹽度隨著淡水注入的規律出現一定的日變動和季節變動, 通常在 20—22左右浮動。潮間帶是一個特殊的區域, 生長在潮間帶的海藻所處的鹽度環境變化十分頻繁, 蒸發會使海藻周圍的海水鹽度升高, 而降雨會導致鹽度的下降, 這些過程在退潮時更加明顯, 尤其是生長在高潮帶的海藻, 其生長環境鹽度變化在10—77 (Gessneret al, 1971)。一般來講,大型藻類的生長都有適宜的鹽度范圍, 過高或過低的鹽度都會對其生理過程造成脅迫。已有的研究表明,鹽度脅迫下, 綠藻門石莼(Xiaet al, 2004)、紅藻門長心卡帕藻(黃園等, 2010)和刺枝魚棲苔(丁蘭平等,2013)以及褐藻門鼠尾藻(梁洲瑞等, 2011)的生長和光合作用都受到了明顯的抑制。與此同時, 在長期適應中, 大型海藻可以通過調節抗氧化系統等生理過程來保護自身免于鹽度脅迫帶來的負面壓力(周亞維等,2010; 馬興宇等, 2014), 這些保護機制的運轉效率在一定條件下往往會受到氮、光照、pH值等環境因子的調節(Liuet al, 2007), 從而鹽度脅迫與這些因子一起協同影響大型海藻的生長與光合生理。

壇紫菜是一種廣鹽性海藻, 適宜栽培的海區較廣。為了向河口區擴大其栽培面積, 國內學者圍繞耐低鹽品種的篩選開展了部分工作(陳昌生等, 2009; 檀應華等, 2014), 但關于鹽度脅迫下該藻的光合響應目前仍未見報道。而除了在干出與沉水交替過程中面臨的鹽度劇烈變化, 作為修復中國南方近海富營養化的推薦品種(Fei, 2004), 人工栽培的壇紫菜將可能長期處于高氮營養的富營養化條件。本研究立足于此,通過探討不同氮濃度下鹽度脅迫對壇紫菜生長和光合作用的影響, 揭示氮在壇紫菜應對鹽度脅迫中的作用, 以期為壇紫菜的人工栽培和利用其對富營養化海區的修復功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

壇紫菜(Pyropia haitanensis)采自廣東省南澳縣深澳灣養殖筏架, 采集后放于低溫箱(5°C)于2 h內運到實驗室。采集回的紫菜葉狀體用自然海水洗凈, 選擇健康一致的個體用鋒利的剪刀剪成 2cm×5cm的片段, 在實驗室內用自然海水暫養 24 h用于后續實驗。自然海水的鹽度30; 無機氮濃度50 μmol/L; 無機磷濃度 0.8 μmol/L。暫養條件如下: 溫度 20°C; 光照強度80μmol photons/(m2s); 光周期L︰D=12︰12;連續充氣。

1.2 鹽度和氮濃度設計

暫養后的壇紫菜葉狀體片段分別在不同的鹽度和氮營養條件下適應培養。鹽度設置3個梯度: 15、30和45, 氮設置2個濃度梯度: 低氮(L-N, 50 μmol/L)和高氮(H-N, 500 μmol/L)。培養基使用PES加富的人工海水(Provasoli, 1968), 其中不同鹽度通過蒸餾水和 NaCl調節, 不同氮濃度通過向培養基添加硝酸鹽獲得, 不同處理的無機磷濃度都添加至 50 μmol/L,以保證藻體不受到磷營養的限制。光照和溫度同暫養條件, 不間斷充氣, 隔天換水。適應培養7 d后分別測定不同鹽度和氮條件下藻體的生長和光合作用等生理指標。

1.3 生長測定

分別稱量藻體的初始濕重(W0)和t天后濕重(Wt),通過公式: RGR = ln(Wt/W0) ×t–1×100 計算葉狀體的日相對生長速率(Relative growth rate, RGR), 其中t為培養時間(單位為d)。

1.4 干鮮比的獲得

在實驗結束時, 稱量各個處理組藻體濕重(Fresh weight, FW), 測量前用吸水紙吸干藻體表面的水分,用電子天平(TP-114, Denver Instrument, USA)稱量。稱量完濕重的藻體, 置于 70°C 烘箱(202, 上海樹立儀器儀表有限公司)烘干至恒重后稱量干重(Dry weight, DW)。計算得到干重占鮮重的百分比。

1.5 光合放氧速率測定

光合放氧速率采用氧電極法測定。測定時, 取待測藻體樣品, 剪成 1cm×1cm 的片段, 分別在原培養條件下恢復培養1h左右以避免機械損傷對光合作用的影響。稱取約 0.1g左右濕重的片段, 置于氧電極(Chlorolab3, Hansatech, UK)反應杯中, 加入8 mL反應介質溶液, 蓋上反應杯, 打開光照, 適應 5 min待放氧穩定, 記錄光合放氧速率。氧電極反應杯溫度以恒溫循環器(DTY-5A, 北京德天佑科技發展有限公司)控制在20°C, 光源用碘鎢燈提供, 光強設定為80 μmol photons/(m2s), 反應介質溶液分別使用不同鹽度和氮條件培養所配制的人工海水。

1.6 快速光反應曲線的獲得

取不同條件下培養7 d后的活體材料, 通過葉綠素熒光儀(WATER-PAM, Walz, Germany)直接測定不同光強(I)下活體光系統Ⅱ的相對電子傳遞速率(rETR),光強設置 148, 224, 335, 505, 750, 1070, 1482和2388μmol photons/(m2s) 8個梯度。相對電子傳遞速率-光強曲線(rETR-Icurve), 即快速光反應曲線通過以下公式擬合(Eilerset al, 1998): rETR =I/ (aI2+bI+c),式中a為光抑制項值, 代表著藻體電子傳遞在高光強下的受抑制程度。光飽和點(Ik)、電子傳遞效率(α, 即快速光反應曲線的初始斜率)和最大相對電子傳遞速率(rETRmax)分別通過以下公式計算得到:Ik= (c/a)0.5;α = 1/c; rETRmax= 1 / [b+ 2(ac)0.5]。

1.7 光合色素的含量測定

葉綠素a(Chla)和類胡蘿卜素(Car)含量測定參照Jensen(1978)的方法。稱取0.1 g濕重(FW)的藻體,用丙酮研磨, 定容至10 mL提取5h, 離心取上清液測定波長450nm、666nm和730nm處的吸光值。通過如下公式計算含量: Chla= (OD666－OD730)×V×10/(890×FW); Car = OD450×V×10/(2500×FW)。其中, OD為吸光值,V為定容后的溶液體積(單位為mL), FW為藻體濕重(單位為g)。

藻藍蛋白(PC)和藻紅蛋白(PE)含量測定參照Siegelman等(1978)的方法。稱取0.1 g濕重(FW)的藻體, 用0.1mol/L的磷酸緩沖液研磨, 定容至10 mL提取 5h, 離心取上清液測定波長 455、564、592、618和645nm處的吸光值。通過如下公式計算含量: PE =[(OD564－OD592)－(OD455－OD592) × 0.2] × 0.12 ×V/FW;PC = [(OD618－OD645)－(OD592－OD645) × 0.2] × 0.15 ×V/FW。其中, OD為吸光值,V為定容后的溶液體積(單位為mL), FW為藻體濕重(單位為g)。

以PC和PE含量之和除以Chla的含量, 得到藻膽蛋白與Chla的含量比值。

1.8 統計分析

所有的測定結果表示為平均值±標準差(n≥3),用單因素方差分析(One way ANOVA, Tukey)進行統計差異性分析, 以P=0.05作為差異的顯著性水平。

2 結果

2.1 生長與干鮮比

壇紫菜在不同的氮和鹽度條件下適應培養7d后,測定不同處理下葉狀體的日相對生長速率, 結果見圖1所示。在低氮條件下, 隨著鹽度的增加, 藻體的生長速度顯著加快(P<0.05); 但在高氮條件下, 藻體在 30的鹽度時(接近養殖海區自然海水鹽度)生長速率最大, 過高和過低的鹽度都顯著降低生長速率(P<0.05)。另一方面, 在不同的鹽度下, 氮濃度對藻體的生長產生了不同的影響。在 30的鹽度下, 高氮培養顯著促進了葉狀體的生長(P<0.05), 而在過高(45)或過低(15)的鹽度脅迫下, 高氮與低氮處理之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

不同條件適應培養后的壇紫菜, 干鮮比除了在高氮下鹽度 15和 30之間未發現顯著差異(P>0.05),其總的趨勢表現為隨著鹽度的增加而升高(圖 2)。氮的濃度在鹽度 15和 30條件下對干鮮比無顯著影響(P>0.05), 但在鹽度45時, 高氮培養的藻體干鮮比低于低氮條件(P<0.05)。

圖1 不同培養條件下壇紫菜的生長速率Fig.1 Growth rate of P. haitanensis cultured under different conditions不同的小寫字母代表處理間具有顯著性差異(P<0.05)

圖2 不同培養條件下壇紫菜的干鮮比Fig.2 Ratio of DW/FW in P. haitanensis cultured under different conditions不同的小寫字母代表處理間具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 光合色素

不同氮和鹽度培養對壇紫菜色素含量的影響如圖3所示。在低氮條件下, 高鹽脅迫(45)對藻體的Chla、Car、PE和 PC都沒有顯著影響(P>0.05), 而低鹽培養(15)則提高了這四種光合色素的含量(P<0.05)。在高氮條件下, 鹽度脅迫沒有改變壇紫菜 Chla和Car的含量(P>0.05), 但高鹽和低鹽脅迫都使得藻體PE和PC含量降低, 雖然這種降低在15鹽度的PC含量中并不顯著(P>0.05)?？傮w來說, 無論壇紫菜培養于何種鹽度條件, 高氮處理都促進了四種光合色素的合成, 但在低鹽(15)脅迫時, 高氮對Car和PC的含量沒有產生顯著的影響(P>0.05)。

圖3 不同培養條件下壇紫菜的色素含量Fig.3 Contents of pigments in P. haitanensis cultured under different conditionsA. 葉綠素a; B. 類胡蘿卜素; C. 藻紅蛋白; D. 藻藍蛋白。不同小寫字母代表處理間具有顯著性差異(P<0.05)

藻膽蛋白與Chla的含量比值幾乎沒有受到鹽度條件的影響, 除了在高氮條件下相比于 30的鹽度,低鹽處理降低了這一比值(圖 4)。在接近自然海水的30鹽度下, 高氮培養顯著提高了藻膽蛋白與Chla的含量比值(P<0.05), 但這種提高在低鹽和高鹽脅迫時都沒有出現(圖4)。

圖4 不同培養條件下壇紫菜藻膽蛋白與葉綠素a的含量比Fig.4 Ratio of phycobiliproteins to Chl a in P. haitanensis cultured under different conditions不同的小寫字母代表處理間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 光合作用

不同氮和鹽度條件下培養的壇紫菜快速光反應曲線如圖5所示。不管在低氮還是高氮條件下, 鹽度脅迫對藻體的電子傳遞效率(α)、最大相對電子傳遞速率(rETRmax)和光飽和點(Ik)都沒有顯著影響(P>0.05,表1), 但光抑制項值卻受到鹽度不同程度的影響: 高鹽脅迫顯著提高了光抑制項值(P<0.05), 而低鹽脅迫對其沒有顯著影響(P>0.05)。在相同鹽度下, 高氮培養能夠顯著降低光抑制項值(P<0.05), 并提高 rETRmax和Ik的值(P<0.05), 而對α沒有顯著影響(P>0.05)。

圖6顯示了不同處理的單位濕重和單位葉綠素a的光合放氧速率。單位濕重的放氧速率在高氮、鹽度30的處理中出現最低值, 而在其它5組處理中未發現顯著差異(P>0.05)。低鹽和高鹽脅迫對單位葉綠素a的放氧速率都沒有顯著影響(P>0.05)。氮的影響在不同鹽度中表現不同: 低鹽 15中, 高氮和低氮之間沒有顯著差異(P>0.05); 鹽度30和45的處理中, 高氮培養顯著提高了藻體的光合放氧速率(P<0.05)。

3 討論

大型海藻的生長是一個復雜的生理過程, 與碳、氮代謝密切相關, 因而能夠改變光合固碳和氮吸收的環境因子變化常常對大型海藻生長產生或正或負的影響。已有的研究表明: 高光強或紫外輻射能夠通過對光合固碳的光抑制來降低海藻的生長速率(Xuet al, 2009), 而氮的加富則通過減輕光抑制來緩解紫外線對生長的負面影響(Zhenget al, 2009); 高濃度的CO2培養雖促進海藻光合固碳, 但由于不同的磷營養供應水平影響了氮的吸收, 從而使高 CO2濃度對生長的影響表現出多樣化效應(Xuet al, 2010)?？梢?在海藻處在環境壓力時, 氮、磷營養鹽的供應可以通過調節其它生理過程而改變脅迫因子對生長的效應。本研究中, 低氮條件下, 雖然鹽度對壇紫菜的光合固碳沒有產生影響, 但生長速率卻隨著鹽度增加而降低, 這與丁蘭平等(2013)對紅藻刺枝魚棲苔(Acanthophora spicifera)的研究結果相似, 其原因可能是鹽度通過影響氮的吸收(錢魯閩等, 2006)來間接影響藻體的生長。本研究中重要氮同化產物藻膽蛋白的含量隨著鹽度增加而降低, 這與壇紫菜生長受鹽度影響的趨勢基本一致, 也恰恰驗證了這一點。本研究中, 在高氮條件下, 不僅較高鹽度下藻體的光合速率較高, 同時藻膽蛋白的含量和藻膽蛋白/Chla比值在鹽度30時達到最大, 而壇紫菜的最大生長速率也出現在鹽度 30的培養條件。藻膽蛋白是紅藻門海藻體內的重要氮庫,當海藻在氮源充足條件下生長時會把所吸收的多余氮以藻膽蛋白的形式儲存(Kursaret al, 1983)。徐智廣等(2008)在對龍須菜的研究中發現, 在不同氮和 CO2濃度培養下的龍須菜, 其生長速率與藻膽蛋白的含量呈現了較好的正相關關系, 本研究中對壇紫菜的研究結果也驗證了這一現象, 這可能是海藻氮同化與光合固碳過程互相平衡后在生長上的綜合體現。

圖5 不同培養條件下壇紫菜的快速光反應曲線Fig.5 Rapid light response curve of P. haitanensis cultured under different conditions A. 低氮條件; B. 高氮條件

表1 快速光反應曲線相關參數Tab.1 Parameters of rapid light response curve of P. haitanensis cultured under different conditions

本研究中, 在低氮條件下, 高鹽條件下壇紫菜的Chla、Car和藻膽蛋白的含量較低。鹽度脅迫能夠破壞植物葉綠體膜結構, 從而降低葉綠素在植物體內的含量(張娟等, 2008), 這種對葉綠素含量的降低作用在其它海藻種類中也得到了驗證(Dhiabet al, 2007;丁蘭平等, 2013)。藻膽蛋白PE和PC的含量隨鹽度升高而降低, 可能由于高鹽脅迫能夠抑制其合成或促進其分解(Chenet al, 2012)。Car是海藻中一類重要的光保護色素, 能夠作為抗氧化劑清除活性氧, 在環境脅迫時起到保護其它光合器官的作用(韓博平等,2003)。鹽度脅迫時 Car可能在抗氧化作用中伴隨自身的降解而導致其含量下降。與低氮條件下不同, 本研究高氮條件下, 鹽度對Chla和Car含量的影響被氮加富的效果所掩蓋, 而藻膽蛋白PE和PC的含量在30鹽度最大。這可能是由于在低鹽和高鹽脅迫中, 藻體的抗氧化及損傷修復等過程耗費了多余的氮, 而30鹽度為壇紫菜生長的較適宜鹽度, 多余的氮可以在體內儲存或用于生長。

圖6 不同培養條件下壇紫菜的光合放氧速率Fig.6 Photosynthetic O2 evolution rate in P. haitanensis cultured under different conditions不同的小寫字母代表處理間具有顯著性差異(P<0.05)。A. 單位濕重的光合放氧速率; B. 單位葉綠素a的光合放氧速率

快速光反應曲線是藻類光系統Ⅱ(PSII)電子傳遞速率對光強變化的快速響應曲線, 而電子傳遞速率與海藻細胞的固碳、放氧過程密切相關(Figueroaet al,2003), 因而, 快速光反應曲線是用來反映藻類光合作用變化的快速、有效的指標。在本研究中, 兩種氮條件下高鹽脅迫都使得壇紫菜快速光反應曲線的光抑制項值顯著升高, 說明高鹽脅迫導致了海藻對光照的敏感性增強, 其光合作用光反應過程更容易受到光抑制。Xia等(2004)在對石莼(Ulva lactuca)的研究中也發現高鹽脅迫導致 PSII反應中心的失活和電子傳遞是受阻。事實上, 很多研究已經證實PSII是高鹽脅迫的主要作用位點, 高濃度的 Na+通過降解反應中心的 D1蛋白或改變水氧復合體的結構來實現對PSII的損傷(Sudhiret al, 2004)。值得一提的是, 本研究中鹽度脅迫對壇紫菜電子傳遞的影響與對光合放氧的影響并不一致, 這可能由于藻類光合作用的光反應過程對脅迫因子的響應更加敏感, 而暗反應則是電子傳遞后固碳、放氧的綜合過程, 在受到環境脅迫時由于自身的調節作用而顯得相對穩定(Figueroaet al, 2003)。

4 結論

壇紫菜是中國特有的人工栽培海藻品種, 在南方沿海廣泛栽培, 也因此成為了緩解近海富營養化的重要養殖品種之一(Fei, 2004)。我國南方的河口資源非常豐富, 但由于淡水注入常使得河口區處于氮富營養化狀態, 同時河口區的鹽度通常維持在 20—22左右(陳昌生等, 2009), 因此, 氮營養鹽水平和鹽度成為河口區與其它壇紫菜養殖區主要的兩個差別因子。本研究立足于此, 通過對兩個環境因子的耦合效應研究, 發現高鹽度對壇紫菜的生長和光合作用具有明顯的抑制作用, 而氮的加富對這種抑制沒有顯著的減輕; 低鹽度對該藻的生長和光合作用沒有抑制, 甚至在低氮條件下表現出對生長的促進作用。這些研究結果不僅為壇紫菜栽培及其富營養化修復功能提供了一定參考, 而且從理論上支持了壇紫菜在河口區栽培的可行性。

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