大黃魚內臟肽的組成及理化性質的研究

李致瑜,張 翀,田玉庭,鄭寶東

(福建農林大學 食品科學學院,福建福州 350002)

大黃魚內臟肽的組成及理化性質的研究

李致瑜,張 翀,田玉庭,鄭寶東*

(福建農林大學 食品科學學院,福建福州 350002)

目的:本文旨在研究大黃魚內臟肽的基本化學組成和不同條件下的理化性質。方法:初步測定了大黃魚內臟肽粉末中蛋白質、脂質、水分、灰分的含量,對低、中、高劑量(2%、5%、10%)的大黃魚內臟肽溶液在不同pH條件下的相對溶解度、乳化性、乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性等理化特性進行研究,并分析了不同濃度下的大黃魚內臟肽的粘度和抑制脂質過氧化活性。結果:大黃魚內臟多肽中蛋白含量為88.42%,具有較好的溶解性和粘度,等電點約為pH6。在等電點附近時,乳化性和泡沫穩定性隨著pH的升高呈先下降后上升的趨勢,即在等電點附近時,乳化性和泡沫穩定性降至最低,而乳化穩定性和起泡性則隨著pH的升高呈先上升后下降的趨勢,當pH為等電點時達到最大。隨著多肽濃度的升高,乳化穩定性、泡沫穩定性有一定的提高,而乳化性有所下降,起泡性則沒有顯著變化。另外大黃魚內臟肽能有效抑制乳濁液的脂質過氧化。相對于傳統乳化劑Tween 20,在150 min后,10%的大黃魚內臟肽MDA值降低了84.5%,并能顯著抑制油滴的絮凝。結論:大黃魚內臟肽在不同的環境和濃度下表現出不同的理化性質,可作為一種潛在的多功能性食品添加劑。

大黃魚內臟肽,化學組成,理化特性

大黃魚(Pseudosciaenacrocea),又名石首魚、黃瓜魚、黃魚等,廣泛分布于我國東、南海及黃海北部,是我國重要的經濟水產品[1]。由于大黃魚味道鮮美、營養豐富,倍受各類消費者的喜愛。但隨著大黃魚產量快速增長,越來越多的副產品被認為是廢棄物而丟棄,如內臟、魚鱗等。這不僅造成資源的極大浪費,而且對自然環境也會產生一定程度的污染。研究表明:魚類內臟含有豐富的蛋白質,如膠原蛋白、纖維蛋白等,因此可被認為是制備蛋白質及其相關產品的優質蛋白源[2]。

隨著食品加工技術的進步,蛋白質在乳化劑、膠凝劑、起泡劑等材料上的應用逐漸受到越來越多學者的關注[3]。但在食品加工過程中,蛋白質容易受到熱、光、輻射、高壓等工藝的影響而變性,高級結構發生改變,導致功能性喪失。研究表明:通過酶解法制備活性肽能顯著改善蛋白質理化性質,包括降低蛋白質的黏度、提高了蛋白質的柔性、疏水性等表面性質,并賦予了蛋白質某些生物活性,如抑菌性、抗氧化性等[4]。提高了其在食品工業中的應用價值。Lassoued等通過酶解海刺魚皮提高膠原蛋白的起泡性[3],Kingsley等通過酶解面筋蛋白得到乳化性較強的蛋白肽[5]。

前期研究表明,通過Alcalase制備的大黃魚內臟肽具有適中的水解度,DH%在2 h后穩定在10%左右,并且含有大量的疏水性氨基酸(-Phe-Trp)。這暗示了大黃魚內臟肽可能具有較為豐富的功能性質。本文以大黃魚內臟蛋白為研究對象,研究了蛋白肽的溶解性、黏度、乳化性、起泡性和抑制乳濁液中脂質過氧化等功能性質,探討了大黃魚內臟蛋白在溶解性、黏度、乳化性、起泡性不同條件下的規律性變化,以期為促進大黃魚副產品的深加工提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚內臟:由福建福鼎海鷗水產食品有限公司提供,包裝于雙層聚乙烯袋中置于-20 ℃冷凍備用。Alcalase 酶制劑(2.4 AU/g),諾維信公司。植物油:山東魯花集團有限公司,鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、磷酸、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、異丙醇、石油醚、十二烷基硫酸鈉、氯化亞鐵等 均為國藥分析純。

絞肉機 永康市迪利工貿有限公司;PB-10 數顯pH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;H1850R 臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;TU-1810DPC紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;NDJ-7粘度計 上海精密科學儀器有限公司;EYEL 4冷凍干燥機 日本東京理化儀器株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚內臟肽的制備工藝 大黃魚內臟→解凍(25 ℃溫水浸泡)→洗滌3～4次→除去性腺、魚鰾、膽囊等→絞碎→異丙醇脫脂2～3次→滅酶(沸水浴10 min)→加水勻漿(10 g底物溶于100 mL蒸餾水中)→調節pH至9-加Alcalase堿性蛋白酶(2%)→酶解90 min→滅酶(沸水浴10 min)→離心(5000 r/min 20 min)→微濾(0.45 μm)→大孔樹脂D392脫色(pH8.5、溫度45 ℃、脫色時間:4 h)→超濾濃縮(3000 u)→濃縮液→冷凍干燥→大黃魚內臟多肽粉

1.2.2 大黃魚內臟肽的化學組成 將凍干后的大黃魚內臟肽粉末進行化學成分測定。

水分的測定:GB.5009.3-2003常壓直接干燥法

脂肪的測定:GB/T 5009.6-2003索氏抽提法

蛋白質的測定:GB.5009.5-2003微量凱氏定氮法

灰分的測定:GB.5009.4-2003高溫灼燒法

1.2.3 相對溶解度的測定 根據Morris[6]的方法并做適當調整,配制25 mL 2%、5%和10%的大黃魚內臟多肽,分別用0.5 mol/L的NaOH或HCl調節溶液pH分別為3～12,并在室溫下離心(8000 g)20 min,取上清液。通過凱氏定氮法測定離心前后酶解液中的氮含量。

相對溶解度(%)=(A/B)×100

A:離心后上清液的氮含量,B:離心前酶解液的氮含量。

1.2.4 表觀黏度的測定 表觀黏度的測定參考姜莉的方法[7]:分別配制200 mL 0.1%、0.2%、0.5%、1%、3%、5%、10%、20%、30%的大黃魚內臟多肽,用0.5 mol/L的HCl調節溶液pH至7,用NDJ-7型旋轉黏度計測定其表觀黏度。

1.2.5 乳化性和乳化穩定性的測定 在Pearce[8]的方法上略作修改,取30 mL 2%、5%和10%的大黃魚內臟多肽,分別用0.5 mol/L的NaOH或HCl調節溶液pH分別為3～12,與10 mL的大豆油混合后在10000 r/min 的剪切速率下均質1 min,分別用移液槍在0 min和30 min從燒杯底部吸取200 μL的乳濁液,并用10 mL 0.1%的SDS稀釋,測定稀釋后溶液在500 nm的吸收波長。

乳化性(EAI，m2/g)=(2×2.303×A×B0)/(c×Φ×10000)

A:稀釋倍數(50)；B0:放置0 min后乳濁液的吸光度；C:樣品濃度(g/mL);Φ:油相體積分數(0.25)。

乳化穩定性(ESI，min)=B0×Δt/ΔB

Δt=60 min；ΔB=B0-B30；B30:放置30 min后乳濁液的吸光度。

1.2.6 抑制乳濁液脂質過氧化能力的測定 根據Rosswan[9]的方法并做適當調整,配制30 mL 2%、5%和10%的大黃魚內臟多肽,分別用0.5 mol/L的NaOH或HCl調節溶液pH8,按上述方法配制乳濁液,并在30 ℃下避光保存,分別在5、10、20、30、60、90、150、180、210 min后取出,取0.5 mL樣品并加入15 μL的50 nmol/L的FeCl2和10 mL硫代巴比妥酸溶液(0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 mol/L HCl),沸水浴加熱15 min后冷卻,在8000 g下離心20 min,最后在532 nm出測定其吸收波長,標準曲線采用丙二醛(2～10 ppm)代替上述的乳濁液。

1.2.7 起泡性和泡沫穩定性的測定 根據Agyare[10]的方法并做部分修改,將50 mL(V0)2%、5%和10%的大黃魚內臟多肽,分別用0.5 mol/L的NaOH或HCl調節溶液pH分別為3～12,室溫下磁力攪拌30 min放入高速分散儀高速攪打(1500 r/min)1 min,放置0 min和10 min后,將攪打好的100 mL的量筒中并讀取泡沫的總體積。

起泡性(FC，mL)=V10-V0

泡沫穩定性(FS，%)=V10/V1×100%

表1 大黃魚內臟肽基本成分含量(%)

V0:0 min后讀取泡沫的總體積;V10:10 min后讀取泡沫的總體積。

1.3 數據分析

每個實驗重復三次,結果以“平均值±SD”表示。方差分析使用SPSS.17.0軟件,采用Origin8.0作圖。

2 結果與討論

2.1 大黃魚內臟肽化學組成分析

將試驗樣板放入容量1 L的氣味瓶中密閉，然后放入80℃烘箱中恒溫2 h。取出氣味瓶冷卻至室溫，然后由5個評價人員進行氣味等級評價，取出現次數最多的等級作為最終結果(可以取兩個等級的中間值，如2.5級、3.5級)。

經過異丙醇脫脂、大孔樹脂脫鹽和膜濃縮后,大黃魚內臟肽蛋白含量高達88.42%,說明前處理取得較好的效果,另外少量的脂肪和灰分可能會對大黃魚內臟肽的理化性質造成一定的影響。

2.2 pH、多肽濃度對大黃魚內臟肽相對溶解度的影響

圖1 pH對大黃魚內臟肽相對溶解性的影響Fig.1 Effect of different pH on solubility of Pseudosciaena crocea viscera peptide

2.3 多肽濃度對大黃魚內臟肽粘度的影響

由圖2可知,當多肽濃度為1%～5%時,多肽溶液粘度增長較慢,流動性較好。這是因為酶解使大黃魚內臟蛋白分子量下降、極性基團增加,從而導致多肽溶解度上升,表觀體積減小,表觀黏度的下降。而多肽濃度大于5%時,酶解液隨著濃度的增加而顯著提升。當濃度為30%時,酶解液粘度為86 Pa·s,相比5%時提高了6倍?？赡苁钱敹嚯臐舛壬叩揭欢ǚ秶鷷r,其的分子鏈開始形成締合,并伴隨著極性基團水合作用的增強,從而增強溶液的黏度。

圖2 多肽濃度對大黃魚內臟肽粘度的影響Fig.2 Effect of different concentration on viscosity of Pseudosciaena crocea viscera peptide

2.4 多肽濃度對大黃魚內臟肽抑制乳濁液脂質過氧化的測定

圖3 多肽濃度對抑制油滴脂質過氧化的影響Fig.3 Effect of different peptide concentration on suppression of lipid peroxidation in oil

當乳濁液中引入一定量的Fe2+,可通過Fenton反應產生羥自由基對乳濁液表面的脂質造成一定的氧化損傷,而大多數乳化劑在維持乳濁液穩定的同時,也能不同程度的抑制乳濁液的脂質過氧化。大黃魚內臟肽的抑制乳濁液的脂質過氧化能力見圖3,2%、5%和10%的大黃魚多肽都能有效抑制油滴的脂質過氧化,并且其活性顯著高于Tween 20。當放置90 min時,2%、5%和10%大黃魚多肽的抑制脂質過氧化活性是5%的Tween 20的2.22、2.96和3.69倍,并且隨著時間的進一步增加,這種趨勢愈加明顯。這不僅由于大黃魚內臟肽能夠在油滴表面形成一層連續且致密的膜,從而降低分子氧或自由基的透過率[9],而且大黃魚內臟肽本身具有一定的抗氧化活性,可通過抑制超氧陰離子自由基、螯合金屬離子或是還原受損的脂質來降低油滴的脂質過氧化程度。然而,在90 min后,2%酶解液的MDA含量快速上升,并伴隨著一定程度的絮凝,可能是由于界面上的多肽被過量氧化,導致構象的發生轉變,從而降低了其在油-水界面的穩定性。而5%和10%的MDA含量仍處于較低水平,相比低濃度并未有顯著上升趨勢(p>0.05),然而隨著時間的增加,也逐漸出現了不同程度的絮凝。因此大黃魚內臟肽在抑制乳濁液脂質過氧化的能力存在一定的劑效關系。

由于蛋白在酶解后通常能改善分子內親水與疏水之間的平衡,從而增強其在不同界面上的吸附能力[13]。不同濃度大黃魚內臟肽的乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)見圖4、圖5,當溶液處于等電點(pH6)時,大黃魚內臟肽的乳化性最弱,這是由于多肽在等電點時的溶解性較差,分子向油水界面的擴散速率處于較低水平。另外,當溶液pH>9時,不同濃度的大黃魚內臟肽乳化性逐漸呈一定的下降趨勢。這可能因為過量的負離子殘基降低了多肽與油相的相互作用,從而導致其在界面上的吸附量下降,引起乳化性的下降。多肽溶液的乳化性隨多肽濃度升高而降低,在低濃度下,多肽向界面遷移的速率是受擴散控制的。然而在高濃度情況下,受活化能壘的影響,擴散速率降低,因此酶解液的乳化性隨著多肽濃度的提高呈較大幅度的下降[5]。

圖4 pH對不同多肽濃度的大黃魚內臟肽乳化性的影響Fig.4 Emulsifying activity of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

圖5 pH對不同多肽濃度的大黃魚內臟肽乳化穩定性的影響Fig.5 Emulsion stability of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

多肽溶液的乳化穩定性是指吸附在油水界面的肽通過重排、相互作用等形成一層膜狀結構來降低界面力,并抑制油滴絮凝、聚集的能力[14]。大黃魚多肽的乳化穩定性隨著pH增加呈先升高后降低的趨勢,當溶液的pH為6時,乳化穩定性最強,這可能由于在pH6環境中,大黃魚內臟肽在油-水界面上的空間結構發生有利的轉變,形成穩定且堅固的保護膜,從而有效的抑制油滴聚集。當pH3和pH12時,乳化穩定性降至最低水平,其值僅為pH6時的40%。這可能是由于靜電排斥的增加影響多肽分子間與分子內的相互作用,不利于其在界面上形成穩定的排列機制,降低了多肽在油水界面層的密度,導致其乳化穩定性的下降[15]。另外與乳化性相反,乳化穩定性溶液中多肽濃度的升高而有一定程度上升(p>0.05),相比2%的大黃魚內臟肽,5%和10%的乳化穩定性平均提高了23.18%和31.56%。由于多肽濃度的上升,使多肽在界面的吸附量也有一定程度的增加,可能通過形成致密的網狀結構,增強了油滴表面的黏彈性[8],從而增強了多肽乳化穩定性。另外,過量的多肽也可能增加了界面膜外的層數[5],對其乳化穩定性也有一定的積極作用性。

2.6 pH、多肽濃度對大黃魚內臟肽起泡性與泡沫穩定性的影響

起泡性取決于多肽的溶解性、表面疏水性、分子量、凈電荷量及分子的柔性等。良好的起泡性需要多肽能迅速擴散、吸附至氣-液界面并形成一層堅固的膜結構[16]。大黃魚內臟肽的起泡性和起泡穩定性如圖6、圖7所示,隨著pH的上升起泡性呈先上升后下降趨勢,當pH達到6時,起泡性達到最高,此時大黃魚內臟多肽處于等電點,分子的靜電排斥作用減弱,提高了肽與界面的親和力,導致吸附至界面的多肽數量增加,并且有利于其在相界面上的相互作用,從而提高了膜的表面粘度,因此多肽的起泡性較好[5]。當pH<4或pH>11時,大黃魚內臟肽分子的凈電荷量較高、排斥效果較為明顯,不利于其致密、穩定地排列在界面上。多肽濃度對起泡性的影響不顯著,2%、5%和10%的大黃魚內臟肽之間的起泡性并沒有顯著差異(p>0.05)，這可能由于其在氣-液界面的吸附量已接近飽和[16]。

圖6 pH對不同多肽濃度的大黃魚內臟肽起泡性的影響Fig.6 Foaming capacity of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

圖7 pH對不同多肽濃度的大黃魚內臟肽泡沫穩定性的影響Fig.7 Foaming stability of Pseudosciaena crocea viscera peptide with different peptide concentration as influenced by pH

泡沫穩定性是指適當地調節多肽在水相與氣-液界面的比例,抑制泡沫排液、破裂和不同程度的相分離現象[15]。酶解法降低了蛋白的分子量,提高了多肽分子的柔性,有利于其在相界面通過適當的構象轉變形成穩定的吸附,提高泡沫的穩定性。隨著pH的上升,泡沫穩定性呈先下降后上升的趨勢,當pH為12時,泡沫穩定性最高,在10 min后仍然有75%的泡沫處于穩定狀態。當pH遠離等電點時,吸附界面的多肽提高了液膜表面的電荷,有利于液膜間保持一定的間距,抑制了泡沫之間的聚集,穩定了分散相中泡沫的結構[17]。另外,泡沫穩定性隨多肽濃度提高呈一定增長趨勢。相對2%的大黃魚多肽,5%的多肽溶液泡沫穩定性明顯提高,這是由于隨著多肽濃度的上升通過增強溶液的表觀粘度和泡沫的Gibbs-Marangoni效應,從而提高了液膜的強度和穩定性[18]。而5%和10%的大黃魚內臟肽的泡沫穩定性并沒有顯著差異,可能是過量的多肽導致氣-液界面極性增強,一定程度促進了泡沫之間的相互作用,不利于分散相保持穩定[19]。

3 結論

本實驗制備的大黃魚內臟多肽蛋白含量約為88.42%,等電點在pH6附近。隨著pH的升高,乳化性和泡沫穩定性先下降后上升,而乳化穩定性和起泡性則呈先下降后上升的趨勢。溶解性、乳化性和泡沫穩定性在pH6時最小,而乳化穩定性和起泡性在等電點附近時達到最大,這與分散相的特點和多肽的性質有關。此外,樣品中少量的鹽離子、脂肪可能會對結果產生一定影響。

隨著溶液中多肽濃度的上升,溶液黏度、乳化穩定性、泡沫穩定性有不同程度的提高,而溶解性、乳化性則有所下降。另外,大黃魚內臟多肽能顯著抑制乳濁液的脂質過氧化,并呈一定的量效關系。

以上結論表明:大黃魚內臟肽在不同的環境和濃度表現出不同的理化性質(乳化性、起泡性,抑制乳濁液脂質過氧化)。根據食品質地、風味、營養性質的差異,選擇合適的多肽濃度可提高食品在加工、貯藏過程中的穩定性。因此,大黃魚內臟肽可作為一種潛在的多功能性食品添加劑。另外,酶解制備功能性肽為大黃魚產業中副產品的綜合利用開辟了一條新途徑。

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Composition and physicochemical properties ofPseudosciaenaCroceaviscera peptide

LI Zhi-yu,ZHANG Chong,TIAN Yu-ting,ZHENG Bao-dong*

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forest University,Fuzhou 350002,China)

Objective:To study and discuss the essential chemical composition and physicochemical properties ofPseudosciaenacroceaviscera peptide. Methods:The content of protein,fat,moisture and ash inPseudosciaenacroceaviscera peptide powder were measured. The physicochemical properties of different peptides concentration(2%,5%,10%),were evaluated under different pH conditions. Besides,viscosity and inhibition of lipid peroxidation in emulsion were also discussed with different peptides concentration. Results:The results indicated thatPseudosciaenacroceaviscera peptide contained 88.42% of protein and the pI was about pH6,at which emulsibility and foam stability reached the lowest and then had a rapid improvement. However,emulsion stability,foamability were increased firstly with the increasing of pH and then decreased,which met the bottom at pH6. The increase of peptide concentration possessed higher viscosity,emulsion stability and foam stability. On the contrary,the solubility,emulsibility got significant reduction while peptide concentration increased. In addition,foam stability did not have a significant changed as peptide concentration increased. Moreover,Compared with traditional emulsifier Tween 20,10%Pseudosciaenacroceaviscera peptide were not only decreased MDA in emulsifier about 84.5% after 150 min,but also showed inhibition of flocculation. Conclusion:Pseudosciaenacroceaviscera peptide exhibited diverse physicochemical properties under different pH or concentration conditions,and could be used as potential additives for food applications

Pseudosciaenacroceaviscera peptide;chemical composition;physicochemical properties

2014-12-15

李致瑜(1991-)，男，碩士研究生，主要從事食品加工與貯藏研究，E-mail:ck1272389116@163.com。

*通訊作者:鄭寶東(1967-)，男，博士，教授，主要從事食品加工與貯藏研究,E-mail:zbdfst@163.com。

福建省海洋高新產業發展專項項目(2013007)。

TS254.1

A

1002-0306(2015)21-0093-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.010