漚麻廢水處理池微生物多樣性分析及其Fosmid文庫酶活初步篩選

董 亮,俞勤麗,董志揚,王 麗,*,王遠亮,*

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128;2.中國科學院微生物研究所,微生物資源前期開發國家重點實驗室,北京 100101)

漚麻廢水處理池微生物多樣性分析及其Fosmid文庫酶活初步篩選

董 亮1,俞勤麗2,董志揚2,王 麗2,*,王遠亮1,*

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128;2.中國科學院微生物研究所,微生物資源前期開發國家重點實驗室,北京 100101)

通過構建元基因組16S rRNA文庫和Fosmid文庫,對富含纖維素、半纖維素等大分子有機物的湖南沅江明星麻廠堿性漚麻廢水處理池(pH9.35)微生物多樣性進行了分析和新的工業用酶基因篩選,發現該堿性處理池原核微生物主要以細菌為主,包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠菌門等四個細菌類群,其中變形菌門彎曲桿菌科硫磺單胞菌屬細菌和腐敗希瓦氏菌為優勢菌群,其次為擬桿菌門和厚壁菌門。該環境古菌的生物量和豐度較少,以廣古菌門馬氏甲烷八疊球菌為優勢類群。并且從該堿性池元基因組Fosmid文庫中篩選出包括淀粉酶(36個)、脂肪酶(9個)、蛋白酶(4個)、纖維素酶(4個)在內的一系列食品和工業用酶活性克隆。為進一步開發和利用該堿性處理池微生物基因資源奠定了基礎。

漚麻廢水處理,原核微生物多樣性,16S rRNA文庫,堿性酶

極端微生物是最適合生活在極端環境中的微生物的總稱,包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜壓、嗜金、抗輻射和極端厭氧等多種類型。嗜堿微生物是指那些最適生長pH為8.0以上,通常在pH9～10之間生長的微生物[1]。嗜堿微生物在許多自然和人工環境中都存在,天然環境如天然堿湖、堿性沙漠等,人工環境如水泥制造、印染、造紙、食品加工等工業過程排出的堿性廢水和堿性廢渣等。嗜堿細菌可以產生堿性胞外酶,具有高pH下穩定的特點,如堿性纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶等,可用于洗滌劑添加劑、紡織、造紙、制革工業等。

亞麻是一種重要的韌皮纖維作物,其纖維具有耐用、衛生和附加值高等特點,是一種環保型的纖維原料,可加工成各種高檔服裝、裝飾用品和軍用、航空、消防、漁業、醫療等產業用布。亞麻纖維存在于亞麻原莖的韌皮部,為了制取亞麻中的可紡纖維,必須破壞纖維束與周圍組織的連接程度,使得韌皮部與木質部易于分離,同時又較少破壞連接單纖維之間的膠質,這個過程被稱為亞麻原莖脫膠。生物脫膠是目前采用的最廣泛的方法,原料經過溫水漚制[2-5],通過果膠分解微生物[6],把木質素和纖維素進行分離,同時麻莖中的各種有機物也擴散到水中,脫膠分離過程中產生高濃度有機廢水。廢水的處理往往采用厭氧生物處理法,污水中的有機物經多種微生物的共同作用,被最終轉化為甲烷、二氧化碳、硫化氫和氨。在漚麻廢水厭氧處理的過程中產酸是主導的反應,需要投加碳酸鹽來控制酸堿度。從而會導致漚麻廢水厭氧處理池進口的pH較高。

湖南沅江明星麻廠是具有幾十年漚麻歷史的企業,本研究自該企業漚麻廢水處理池中采樣,采集到pH9.35的堿性厭氧污泥,從中提取微生物總DNA,構建了16S rRNA基因組文庫和元基因組Fosmid文庫,分析了其中細菌和古菌多樣性,并從元基因組Fosmid文庫中篩選到纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等具有工業應用價值的產酶活性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2012年4月,樣品采自湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池。樣品pH為9.35。采集堿性厭氧漚麻廢水處理池下層泥水混合物樣品,置于無菌離心管,密封,運回實驗室后-80 ℃保存。

土壤DNA提取試劑盒 MO BIO公司的UltraCleanTMMega Soil DNA Isolation Kit;Taq 酶、DNA純化試劑盒 TIANGEN公司;T4連接酶 Promega公司;大腸桿菌EscherichiacoliDH5a 感受態細胞 北京全式金公司;酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid公司;其他生化試劑均為國產分析純。

元基因組文庫活性篩選培養基:基礎LB培養基中加入相應底物:0.2%可溶性淀粉(淀粉酶篩選培養基);1.6%脫脂奶粉(蛋白酶篩選培養基);1%三丁酸甘油酯(脂肪酶篩選培養基);0.2% CMC-Na(纖維素酶篩選培養基);0.5%木聚糖(木聚糖酶篩選培養基);0.2%果膠(果膠酶篩選培養基)。木聚糖酶篩選培養基、蛋白酶篩選培養基8磅壓力下20 min滅菌,其余培養基均15磅壓力下高壓蒸汽滅菌30 min。

元基因組文庫活性篩選試劑:盧格氏碘液:22 g KI,11 g I2,溶于500 mL水中,得到5倍的儲存液;DNS溶液:稱取酒石酸鉀鈉182.0 g,溶于500 mL蒸餾水中,加熱(不超過50 ℃),于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g,NaOH 21.0 g,苯酚5.0 g,無水亞硫酸鈉5.0 g,攪拌至溶解完全,冷卻后用蒸餾水定容至1000 mL,過濾后避光保存;剛果紅溶液:1 g剛果紅溶于1 L水中,得到0.1%的剛果紅染液。

1.2 樣品總DNA的提取以及16S rRNA基因片段的PCR擴增

1.2.1 樣品總DNA的提取 使用MO BIO公司的UltracleanTMMega Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取堿性池元基因組DNA。

1.2.2 微生物16S rRNA基因片段的特異性擴增 細菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′;古菌通用引物A571F:5′-GCYTAAAGSRICCGTAGC-3′和UA1204R:5′-TTMGGGGCATRCIKACCT-3′(M=C/A,R=A/g,Y=C/T,S=G/C)。PCR擴增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 30 s,30個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并經DNA純化試劑盒純化。

1.3 16S rRNA基因克隆文庫的構建

宋彬分析認為，目前新三板企業IPO持續升溫?！靶氯迨袌隽鲃有圆?、估值低的局面未改變之前，掛牌企業轉由IPO登陸A股的趨勢將不會發生改變?！彪S著IPO的提速，新三板企業申請IPO的數量已出現了較大的增長，由于IPO審核標準趨嚴，新三板企業IPO通過率有所下降。

純化后的PCR產物連接pGEM-T載體,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,涂布于含氨芐青霉素(50 mg/L)的IPTG/X-gal 平板上37 ℃培養過夜。挑取白斑菌落提取質粒,利用質粒酶切法進行篩選,對陽性克隆的插入片段進行測序。

1.4 基于16S rRNA基因片段的微生物多樣性分析

使用DECIPHER http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html分析并去除嵌合序列。將得到的有效序列用Sequence-Alingnment軟件進行排序并獲得相似性矩陣,相似性≥97%的序列被認為是相同的分類單元(OTU,operational taxonomic unit)并用其中一個序列作為代表[7],對每一個代表序列進行BLAST(http://blast. ncbi. nlm. nih.gov/Blast. cgi)相似性比對[8],根據比對結果選取參照序列,用Clustal X 2.1進行排序,Mega 4軟件構建系統發育樹(Jukes-Cantor參數模型計算進化距離,鄰接法Neighbor-Joining構建系統進化樹)。

1.5 堿性池元基因組Fosmid質粒文庫的構建

根據試劑盒說明書進行文庫的構建,采用DNA末端平滑化試劑盒對片段化的DNA片段進行凝膠電泳分析,切膠回收5～10 kb的片段,連接到pCC1FOS載體上,轉化入感受態細胞E.coliDH10B中,涂布于含氯霉素的LB培養基平板,挑取克隆置于96孔板中,-20 ℃保存,用于后續文庫的篩選。

1.6 水解酶的篩選

使用Qfill3分裝含合適抗生素的新鮮LB培養基于96孔板,每孔150 μL。將保存冰箱的文庫于4 ℃環境中解凍,使用全自動菌落復制點膜系統Qpix2將保存在384孔板的文庫轉移到96孔板,37 ℃、700 r/min過夜培養進行活化。通過影印方法復制到篩選培養基中,37 ℃倒置過夜培養。然后按照下列方法進行篩選:蛋白酶、脂肪酶篩選平板可以直接觀察透明圈,淀粉酶篩選平板需經碘液染色后觀察透明圈;纖維素酶和果膠酶篩選平板需經剛果紅染色,1 mol/L NaCl脫色后觀察透明圈;木聚糖酶陽性克隆篩選方法:在含0.5%木聚糖的液體LB培養基過夜培養,加入等體積的DNS溶液顯色,陽性克隆中的木聚糖酶可水解培養基中木聚糖為還原糖,與DNS反應顯色。

2 結果與分析

2.1 堿性處理池微生物元基因組DNA的提取與原核微生物16S rRNA基因擴增

10000 r/min離心采集樣品,去除上清,剩泥土樣,可得到病毒,真細菌,古細菌等微生物。使用MO BIO公司的UltraClean? Mega Soil DNA Isolation Kit對堿性污泥樣品進行DNA的直接提取。從每克泥樣中可提取約0.2～0.3 μg的DNA,電泳結果表明提取的DNA片段純度較高、大于10kb。將DNA樣品分別采用細菌和古菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增,如圖所示:細菌的擴增產物為1500bp左右的單一目的條帶,古菌的擴增產物為650bp左右的單一條帶,說明DNA樣品純度較好且PCR擴增的特異性良好,滿足建庫要求。湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池已閑置多年,其中的污泥有機質含量較高且長期處于厭氧堿性環境下,已經滋生出許多微生物。從基因組提取的結果來看,其中的生物量尚可,并且該土壤DNA提取試劑盒有效去除了其中的腐殖質和其他污染物,得到的DNA可以不經過后續的純化直接用于微生物16S rRNA擴增。并且原位樣品較高的pH(pH9.35)并未影響該試劑盒對總DNA的提取效率。此外,以相同量的起始模板進行16S rRNA擴增后,得到的細菌PCR產物的濃度明顯比古菌PCR產物的濃度要高。表明該環境細菌的含量比古菌高。與許多堿性環境類似。

圖1 漚麻處理池污泥樣品總DNA電泳檢測Fig.1 Total DNA of yuanjiang Alkaline pool注:泳道1:DNA Marker;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA。

圖2 古菌16S rRNA基因PCR擴增產物Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA genes.注:泳道1:1kb DNA marker.;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA古菌16S rRNA PCR擴增產物;泳道5:陰性對照,以水為模板的古菌16S rRNA PCR擴增產物。

圖3 細菌16S rRNA基因PCR擴增產物Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA genes注:泳道1:1kb DNA marker;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠歐麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA細菌16S rRNA PCR擴增產物。

純化后的PCR擴增產物通過連接轉化分別構建細菌和古菌16S rRNA基因克隆文庫,從文庫中各隨機挑取96個陽性克隆測序并保存。得到細菌16S rRNA基因序列70條,古菌16S rRNA基因序列34條,將這104條序列運用DECIPHER http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html程序進行嵌合體檢驗,發現其中14條為嵌合序列剔除,其余的90條用于后續分析。

2.3 基于16S rRNA基因序列的原核微生物多樣性分析

通過序列之間的相似性比對發現,得到的63條細菌的序列可歸屬為13個不同的OTU,27條古菌序列可歸屬為4個不同的OTU。將代表13個細菌和4個古菌OTU的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中的序列進行BLASTn相似性比對,結果見表1,表2。由表1可見,漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥的細菌優勢克隆為BacA1(24條原始序列)和BacB1(11條原始序列)所代表微生物。其中與BacA1最相似的是耐堿硫磺單胞菌CampylobacteraceaebacteriumHTRB-L1(GQ863490),它們的相似性為98%;與BacB1最相似細菌為腐敗希瓦式菌ShewanellaputrefaciensCN-32 strain(NR_074817),相似性也為98%。表明沅江堿性池的優勢細菌大多為已知微生物,只含有少量的未培養細菌。并且大多數細菌都是堿性或者厭氧環境來源的,如鹽堿湖、堿性污泥、地下水、油田等。古菌16S rRNA基因序列的相似性比對結果(表2)表明,該堿性處理池的優勢克隆為產甲烷古菌,其中甲烷八疊球菌Methanosarcinamazei占據絕大部分(21條),另外還含有未培養古菌Methanomicrobiaarchaeon(AB742129)(1條)、甲烷螺菌屬古菌Methanospirillumhungatei(AB517987.1)(1條)。

表1 漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥細菌16S rRNA基因序列BLASTn相似性分析

表2 漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥古菌16S rRNA基因序列BLASTn相似性分析

圖4 基于16S rRNA基因序列的漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥古菌系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of archaea in Yuanjiang alkaline pool based on the 16S rRNA gene sequences

運用Mega4軟件構建的湖南沅江明星麻廠堿性漚麻廢水處理池原核微生物16S rRNA基因系統發育樹見圖4和圖5。根據聚類樹分析該堿性池微生物的類群歸屬可見:該堿性池的細菌多樣性相對豐富,主要包括以下類群:變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)的細菌以及廣古菌門(Euryarchaeota)的古菌。其中細菌的優勢菌種BacA1和BacB1與Sulfuropirillumalkalitolerans和Shewanellaputrefaciens的相似性分別為98%和98%。

圖5 基于16S rRNA基因序列的漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥細菌系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of bacteria in Yuanjiang alkaline pool based on the 16S rRNA gene sequences.

2.4 堿性漚麻廢水處理池元基因組Fosmid文庫構建

本研究成功構建了該環境樣品的元基因組Fosmid文庫,平均插入片段20～30 ku,共包含19200個克隆。隨機挑取27個克隆進行酶切鑒定,如圖6所示。絕大部分都有插入片段。隨機挑取20個陽性轉化子,送測序,獲得15條序列,序列分析結果表明,其中兩株與人腸道微生物相似性較高,兩株與瘤胃微生物相似性較高,一株與雞腸道微生物相似性較高,一株與海洋細菌相似性較高,一株與人腸道來源的未培養微生物相似,其余8株為新的序列,初步鑒定多樣性豐富,有利于后續功能基因的篩選。

2.5 Fosmid文庫中水解酶的篩選

對湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥所構建的元基因組Fosmid文庫進行功能酶基因篩選?？傆嫼Y選了7680個轉化子,共篩選了6種酶基因,包括淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶和木聚糖酶。圖7中,1號為淀粉酶活性篩選平板,淀粉酶活性克隆子產生的淀粉酶降解了周圍的淀粉從而無法與碘液顯色而出現了明顯的透明圈;2號為纖維素酶活性篩選平板,纖維素酶活性克隆子產生的纖維素酶將周圍的羧甲基纖維素鈉分解產生單糖和低聚糖,0.1%剛果紅染色,經過1 mol/L NaCl脫色后產生略帶黃色的透明圈;3號為脂肪酶活性篩選平板,脂肪酶活性克隆子產生的脂肪酸與羅丹明B反應在紫外下發熒光;4號為木聚糖活性篩選培養基,在96孔板中每孔注入100 μL含0.5%的木聚糖,具有木聚糖酶活性的克隆子降解木聚糖產生還原糖,與等體積DNS在65 ℃條件下顯色1 h后顯色。初篩獲得99個淀粉酶陽性克隆,24個脂肪酶陽性克隆,7個蛋白酶陽性克隆,4個木聚糖酶陽性克隆,11個纖維素酶陽性克隆,3個果膠酶陽性克隆。經過復篩,確定具有酶活性的陽性克隆包括:淀粉酶陽性克隆36個,脂肪酶陽性克隆9個,蛋白酶陽性克隆4個,纖維素酶陽性克隆4個。

表3 漚麻廢水處理池元基因組Fosmid 文庫大分子有機物降解陽性轉化子

圖6 元基因組Fosmid文庫克隆酶切鑒定Fig.6 Restriction endonulease digestion of Fosmid library clones注:泳道1:λDNA HindⅢ酶切片段(23,9.6,6.6,2.3,2.0 kb);泳道2～27:元基因組Fosmid文庫轉化子Fosmid質粒HindⅢ酶切片段(pCC1Fos大小為8139 bp)脈沖場凝膠電泳檢測。

圖7 漚麻廢水處理池元基因組Fosmid文庫大分子有機物水解陽性轉化子篩選Fig.7 Positive transformants with macromolecular organics hydrolysis activity screening in the Fosmid library of flax retting waste water microbes注:1.淀粉水解陽性轉化子復篩(0.2%可溶性淀粉);2.纖維素水解陽性轉化子復篩(0.2% CMC-Na);3.蛋白質水解陽性轉化子復篩(1.6%脫脂奶粉);4.木聚糖水解陽性轉化子初篩(0.5%木聚糖)。

3 結論

該漚麻廢水處理池泥水混合物的pH達到了9.35,通過16S rRNA序列分析表明,其中包含變形菌門、厚壁菌門以及擬桿菌門的細菌以及廣古菌門的古菌。

其中細菌的優勢菌種BacA1和BacB1與Sulfuropirillumalkalitolerans和Shewanellaputrefaciens的相似性均為98%。另一個優勢細菌BacB1與Shewanellaputrefaciens以及Shewanellahafniensis相似性均為98%。Sulfurospirillumalkalitolerans屬于ε-變形菌門彎曲桿菌科的細菌,為嚴格厭氧細菌,可以利用甲酸鹽、氫氣、乳酸鹽、丙酮酸鹽和延胡索酸鹽作為電子供體,硫代硫酸鹽、硫、硝酸鹽、亞硝酸鹽、砷酸鹽、延胡索酸鹽為電子受體。它本身是個耐堿菌,可以在pH7.1～9.7下生長,最適pH為8.5,鹽度范圍為0.6～1.5 mol/L Na+,最適為0.6 mol/L。在pH9下的最高生長溫度為41 ℃。在胞內以硝酸鹽為電子受體的情況下可以氧化硫化物為硫元素[9]。另一個優勢細菌BacB1與Shewanellaputrefaciens[10]以及Shewanellahafniensis[11]相似性均為98%。這兩種細菌為兼性厭氧菌,耐冷產硫化氫細菌,在無氧的情況下能夠利用十種以上的電子受體包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、丙酮酸鹽、硫代硫酸鹽、硫元素、氧化三甲胺、四價錳以及三價鐵。希瓦氏菌屬的細菌在淡水、海水以及魚類都能分離得到。優勢古菌甲烷八疊球菌Methanosarcinamazei[12]為厭氧產甲烷古菌?？梢岳肏2/CO2、醋酸鹽、甲醇、甲胺、三甲胺為碳源產生甲烷。在有機污染物厭氧發酵環境廣泛存在,是厭氧沼氣池中的重要功能菌群。而在pH9的環境中,該古菌的存在鮮有報道,是否在原位發揮功能需要進一步的驗證。

對堿性池Fosmid文庫進行活性酶基因的篩選,總計篩選了7680個克隆子,共篩選了6種酶:淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶。并對其做了復篩,最后的復篩結果為:有淀粉酶活性的36個(強陽性4個)、脂肪酶9個(強陽性2個)、蛋白酶4個(強陽性1個)、纖維素4個(強陽性1個)。表明該環境大分子有機質降解基因含量相對豐富,并且由于其獨特的堿性環境,篩選到的新酶可能同時具有嗜堿或耐堿的特性,為后續的工業應用提供了良好的基因資源。目前正在對強陽性的克隆進行測序、拼接和注釋,以期獲得這些新酶基因。對于具有優良性質的酶基因可以進行后續的克隆表達以及酶學性質的研究,以期作為食品添加劑、飼料和工業用酶制劑等。

[1]Sarethy IP,Saxena Y,Kapoor A,et al. Alkaliphilic bacteria:applications in industrial biotechnology[J]. Journal of industrial microbiology & biotechnology,2011,38:769-90.

[2]Akin DE,Foulk JA,Dodd RB,et al. Enzyme-retting of flax and characterization of processed fibers[J]. Journal of biotechnology,2001,89:193-203.

[3]Valladares Juarez AG,Rost G,Heitmann U,et al. Development of a biotechnological process for the production of high quality linen fibers[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2011,34:913-21.

[4]Di Candilo M,Bonatti PM,Guidetti C,et al. Effects of selected pectinolytic bacterial strains on water-retting of hemp and fibre properties[J]. Journal of Applied Microbiology,2010,108:194-203.

[5]Yadav S,Yadav PK,Yadav D,et al. Purification and characterization of pectin lyase produced by Aspergillus terricola and its application in retting of natural fibers[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2009,159:270-83.

[6]Kashyap DR,Vohra PK,Chopra S,et al. Applications of pectinases in the commercial sector:a review[J]. Bioresource Technology,2001,77:215-27.

[7]McCaig AE,Glover LA,Prosser JI. Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in unimproved and improved upland grass pastures[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65:1721-30.

[8]Marteinsson VT,Hauksdottir S,Hobel CF,et al. Phylogenetic diversity analysis of subterranean hot springs in Iceland[J]. Applied and Environmental Microbiology,2001,67:4242-8.

[9]Sorokin DY,Tourova TP,Muyzer G. Isolation and characterization of two novel alkalitolerant sulfidogens from a Thiopaq bioreactor,Desulfonatronum alkalitolerans sp. nov.,and Sulfurospirillum alkalitolerans sp. nov[J]. Extremophiles:life under extreme conditions,2013,17:535-43.

[10]Venkateswaran K,Moser DP,Dollhopf ME,et al. Polyphasic taxonomy of the genus Shewanella and description of Shewanella oneidensis sp. nov[J]. International Journal of Systematic Bacteriology,1999,49 Pt 2:705-24.

[11]Satomi M,Vogel BF,Gram L,et al. Shewanella hafniensis sp. nov. and Shewanella morhuae sp. nov.,isolated from marine fish of the Baltic Sea[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2006,56:243-9.

[12]Simankova MV,Kotsyurbenko OR,Lueders T,et al. Isolation and characterization of new strains of methanogens from cold terrestrial habitats[J]. Systematic and Applied Microbiology,2003,26:312-8.

Microbial diversity analysis of alkaline flax retting wastewater and enzyme activity screen of Fosmid library clones

DONG Liang1,YU Qin-li2,DONG Zhi-yang2,WANG Li2,*,WANG Yuan-liang1,*

(1.Institute of Food Science and Technology,Hun an Agricultural University,Changsha 410128,China;2.State Kay Laboratory of Microbial Resources,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

The microbial samples from alkaline sludge of retting waste water(pH9.35)which were riched in cellulose and hemicelluloses were collected. DNA was isolated and 16S rRNA genes were amplified. The bacterias in the alkaline anaerobic sludge contained 13 OTUs belong to Proteobacteria,Firmicute and Bacteriodetes. The most abundant bacterias wereSulfuropirillumalkalitoleransandShewanellahafniensis. The archaeas in the alkaline anaerobic sludge contained 3 OTUs belong to Euryarchaeota. The most abundant one wasMethanosarcinamazei. Fosmid library was constructed and macromolecular organics hydrolysis activities include cellulose,hemicelluloses,starch,protein and lipid hydrolyze activities were screened. After two runs of screening,36 clones contain amylase,4 clones with cellulose hydrolysis activity,4 clones contain proteinase and 9 clones contain lipase were obtained. It is very helpful to further exploit and use these gene resources and enzymes in food industry from this alkaline envioronment.

flax retting wastewater;prokaryotic microbial diversity;16S rRNA library;alkaline enzymes

2015-03-20

董亮(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化學與食品微生物學，E-mail：kunkunmumu2@163.com。

*通訊作者:王麗(1982-)，女，博士，助理研究員，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：wangli07@im.ac.cn。 王遠亮(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：yuanliangw@gmail.com。

國家自然科學基金項目(青年基金31300007)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0167-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.026