pH與微乳輔料對白藜蘆醇穩定性影響的研究

姚 倩,顏 軍,何 鋼,梁 立,代田洋,曾 聰,茍小軍

(成都大學藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室,四川成都 610106)

pH與微乳輔料對白藜蘆醇穩定性影響的研究

姚 倩,顏 軍,何 鋼,梁 立,代田洋,曾 聰,茍小軍*

(成都大學藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室,四川成都 610106)

本研究考察pH和微乳處方中的輔料對白藜蘆醇穩定性的影響。首先制備含等量白藜蘆醇、pH不同的溶液,再分別將油相、乳化劑及助溶劑與白藜蘆醇單獨配伍或輔料混合后配伍,制成混合溶液,在40 ℃下放置不同時間,定時取樣測定。分別對濃度-時間曲線按各級動力學方程進行回歸,由降解速率常數推斷pH及各輔料對白藜蘆醇穩定性的影響。結果表明,白藜蘆醇溶液穩定的pH范圍為3.6～5.0;微乳各輔料單獨與白藜蘆醇配伍均加速了白藜蘆醇的降解,但輔料混合后再與成分配伍其降解減慢,甚至可改善白藜蘆醇的穩定性。制備白藜蘆醇微乳適合選擇聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑,聚乙二醇400為助溶劑。

白藜蘆醇微乳,pH,輔料,穩定性

白藜蘆醇廣泛存在于自然界中,在日用食物如葡萄、花生及常見的植物如虎杖、藜蘆及決明中均含有白藜蘆醇[1]。大量的研究發現白藜蘆醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、調節血脂等作用[2-3],使得白藜蘆醇相關保健食品的開發成為研究的一大熱點。然而因白藜蘆醇水溶性較差,溶解成為制約其吸收,繼而影響其功效發揮的一重要因素[4-5]。微乳是由油、水、表面活性劑與助溶劑形成的熱力學穩定的一分散體系,由于表面活性劑與助溶劑的存在,微乳能增加難溶成分的溶解度,并具有靶向釋放、提高療效與降低毒副作用等功效[6-8]。如鹽酸黃連素制成納米微乳后對大腸桿菌、沙門氏菌等多種細菌的抗菌活性明顯高于傳統片劑、膠囊劑和水溶液[8];紫杉醇-五味子乙素微乳顯著降低了紫杉醇的毒性,同時提高了紫杉醇的抗腫瘤作用[9]?；谖⑷樵谠鲂c改善口服吸收方面的獨特優勢,本課題組分別以棕櫚酸異丙酯為油相,吐溫-80(Tween-80)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL,EL)為乳化劑,聚乙二醇300(polyethylene glycol 300,PEG300)、聚乙二醇400(polyethylene glycol 400,PEG400)為助溶劑,制備了白藜蘆醇微乳,以期提高白藜蘆醇口服生物利用度與療效。此項研究主要采用動力學原理探討溶液pH及微乳處方輔料對白藜蘆醇穩定性的影響,為微乳處方工藝的優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇 西安天一生物制品有限公司,純度大于99.0%;EL Sigma公司;PEG300、PEG400 國藥集團化學試劑廠;棕櫚酸異丙酯 Labcaster公司;吐溫-80 成都市科龍化工試劑廠;HPLC儀用水為超純水,其余試劑均為分析純。

表1 白藜蘆醇與不同輔料配伍方案

P680型高效液相色譜儀、TCC-100型柱溫箱、PDA-100型二極管陣列檢測器 美國戴安公司;DNP-9025型電熱恒溫培養箱 揚州洪都電子有限公司;KQ-3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇微乳處方 處方中油、表面活性劑、助溶劑及水的比例為2∶1∶1∶6(v/v/v/v),其中1 mL微乳中含白藜蘆醇0.1 mg。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:迪馬C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1 mol·L-1乙酸(40∶60);流速:1 mL·min-1;檢測波長:306 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。

1.2.3 空白干擾實驗 取棕櫚酸異丙酯(oil)、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,置25 mL量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻;精密量取20 μL,注入液相色譜儀,考察各輔料對測定有無干擾。

1.2.4 線性關系 取白藜蘆醇對照品10.5 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得白藜蘆醇對照品貯備液。精密量取上述貯備液0.5,1,2,3,4,5 mL,分別置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。照“色譜條件”項下的方法分別取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以主峰面積A對白藜蘆醇濃度C(μg·mL-1)回歸。

1.2.5 回收率 取3個25 mL量瓶,分別加入濃度為1 mg/mL的白藜蘆醇貯備液0.2、0.25、0.3 mL,另分別加入棕櫚酸異丙酯、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,用去離子水稀釋至刻度,搖勻;精密量取20 μL,注入HPLC儀,測定白藜蘆醇含量,以加入量作比較,計算回收率;每個濃度重復操作3次。

1.2.6 精密度 分別配制濃度為40 μg/mL的白藜蘆醇溶液,以及含各輔料、白藜蘆醇濃度為10 μg/mL的溶液各6份,用HPLC儀測定含量,以峰面積值計算RSD,考察方法的精密度。

1.2.7 pH對白藜蘆醇穩定性的影響 根據《中國藥典》一部2010版附錄XVD[10],使用醋酸-醋酸鈉,氨-氯化銨緩沖系統,配制pH分別為1.0,2.3,3.6,5.0,6.0,7.4,8.0和9.2等8個緩沖溶液,配制過程確保在各緩沖溶液中加入相同摩爾數的鹽,使得各緩沖系統有近似的離子強度。取8個25 mL量瓶,精密加入濃度為1 mg/mL的白藜蘆醇溶液1 mL,用不同pH的緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。將各量瓶的瓶口用封口膠密封后,置40 ℃下分別放置不同時間后,精密量取20 μL,注入液相色譜儀,測定白藜蘆醇含量;采樣時間120 h,前8 h取5個時間點檢測,之后每日測定一次,當90%以上樣品中所含白藜蘆醇已降解一半時,停止采樣。分別按零級動力學方程C=C0-kt,一級動力學方程lgC=lgC0-kt/2.303,及二級動力學方程1/C=1/C0+kt,對C-t數據進行線性回歸。

1.2.8 微乳處方對白藜蘆醇穩定性的影響 稱取白藜蘆醇原料25.3 mg,置25 mL量瓶中,用無水乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。另取9個25 mL量瓶,編號,分別按表1依次加入各成分后,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,瓶口用封口膠密封。將9份樣品置40 ℃恒溫箱中,分別于不同時間點,精密量取20 μL,用HPLC儀測定白藜蘆醇含量;采樣時間100 h,前24 h設定5個時間點檢測,之后每日測定一次,當觀察到90%以上樣品中所含白藜蘆醇已降解50%時,結束測定。以時間為自變量,藥物濃度為函數,分別按零級、一級及二級動力學方程,對C-t數據進行線性回歸,考察白藜蘆醇與不同處方配伍的降解動力學。

1.2.9 數據處理 所有數據為3次以上實驗的平均值;采用Excel 2010版軟件對數據進行擬合。

2 結果與分析

2.1 空白干擾與線性關系

色譜圖(圖1)顯示,白藜蘆醇保留時間為4.26 min,在白藜蘆醇出峰處各輔料對測定無干擾。峰面積 A 對白藜蘆醇濃度 C(μg·mL-1)回歸方程為A=3.289×103+5.743×104C,r=0.9999,表明白藜蘆醇在5～50 μg·mL-1濃度范圍內,線性關系良好。

圖1 空白輔料與白藜蘆醇的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatographs of excipients and resveratrol

2.2 回收率與精密度

白藜蘆醇與混合輔料制成的高、中、低濃度溶液回收率分別為98.32%±0.45%,97.58%±0.61%,97.23%±1.17%,表明方法有較好的準確度;40、10 μg/mL白藜蘆醇溶液HPLC測得值的RSD分別為0.81%及1.32%,方法精密度良好。

2.3 pH對白藜蘆醇穩定性的影響

白藜蘆醇在不同pH溶液中的降解過程符合二級動力學方程(表2)。將回歸所得速率常數k取對數后,以pH為橫坐標,lgk為縱坐標繪制曲線(圖2),擬合得到的方程為lgk=0.5961-0.6772pH+0.08566pH2(r=0.9943)。由方程和圖2可知,白藜蘆醇溶液最穩定的pH范圍為3.6～5.0。

表2 白藜蘆醇在不同pH溶液中的二級降解動力學過程

圖2 lgk-pH曲線Fig.2 Curve of lgk versus pH

制備的微乳pH環境多在6左右,基于白藜蘆醇的pH穩定性,曾考慮加入乙酸降低微乳pH,然而在酸性下微乳成型性不佳,易發生團聚,因此微乳制備中取消了pH調節這一步,白藜蘆醇最后分散在pH6.0～6.5的近中性微乳溶液中。

2.4 微乳處方對白藜蘆醇穩定性的影響

對白藜蘆醇與微乳不同輔料混合后的降解動力學過程進行了擬合,結果顯示,一級與二級動力學方程的擬合優度較佳(r>0.90),而一級動力學的擬合效果為最好(r>0.95)(表3,表4)。由表可知,微乳處方中的輔料均對白藜蘆醇穩定性產生了較大的影響,油、吐溫-80、EL及PEG300引起白藜蘆醇降解速率分別增大11、12.5、8.5及15倍;僅PEG400影響相對較小,配伍后白藜蘆醇降解速率增加了約60%。白藜蘆醇在PEG400中的穩定性顯著優于PEG300,可能的原因為PEG300的引入增加了組分的溶解度[11],同時也增強了其與水之間的相互作用,導致降解加快;PEG400不僅可改善組分的水溶性,還能降低活性成分所處環境的極性,有助于提高成分的穩定性[12]。乳化劑EL對白藜蘆醇穩定性的不良影響小于吐溫-80(表3)。

雖然微乳處方各輔料單獨與白藜蘆醇配伍極大地促進了組分的降解,但若預先將各輔料混合后再配伍,白藜蘆醇的降解則開始減慢,如PEG300與油、乳化劑的混合物使組分降解速率增大7倍,較單獨配伍時的降解速率有了大幅度的減小;PEG400與油、EL合用甚至提高了組分的穩定性,白藜蘆醇降解速率僅為原組分的86%?？赡艿脑驗楦鶕⑷榫忈尩奶匦钥膳袛郲13],白藜蘆醇被包裹在乳滴內,減少了組分與水之間的接觸;另一種可能是某些輔料本身可引起白藜蘆醇降解,當它與其他輔料混合時,輔料之間也將產生相互作用,如PEG400的羥基與EL結構中的氧原子能形成氫鍵結合;油、表面活性劑與助溶劑的疏水基團間可發生疏水鍵的融合,這些相互作用均可以削弱它們與組分之間的連接,因而對組分的不良影響減弱。

在油相選擇方面,除棕櫚酸異丙酯外,另考察了菜籽油和花生油,后二者因很難制備出質量穩定的微乳而未選用。在不同pH下的降解實驗中,設置的白藜蘆醇初始濃度約為40 μg·mL-1,初濃度設置較高,目的是保證能在較長的時間內觀察活性成分的含量變化;而在研究輔料對組分穩定性的影響時,選擇的白藜蘆醇濃度為10 μg·mL-1,這主要考慮到口服微乳在體內將被體液稀釋,而注射用微乳在使用前通常會用生理鹽水或葡萄糖溶液稀釋,白藜蘆醇的實際使用濃度約為10 μg·mL-1。

表3 一級動力學方程擬合結果

注:C單位μg/mL;RES為白藜蘆醇，表4同。

表4 二級動力學擬合結果

3 結論

白藜蘆醇在不同pH環境及微乳輔料溶液中的降解過程分別符合二級及一級降解動力學方程,其穩定的pH范圍為3.6～5.0。從穩定性方面考察,白藜蘆醇微乳助溶劑及乳化劑應分別選擇PEG400與EL。雖然微乳處方各輔料單獨與白藜蘆醇配伍均可加快白藜蘆醇的降解,但若預先將各輔料混合后再配伍則組分降解減慢,PEG400、棕櫚酸異丙酯與EL的混合物甚至提高了白藜蘆醇的穩定性。

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Effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol

YAO Qian,YAN Jun,HE Gang,LIANG Li,DAI Tian-yang,ZENG Cong,GOU Xiao-jun*

(Key Laboratory of Medicinal and Edible Plant Resources Development of Sichuan Education Department,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

In this study,the effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol were examined. First,solutions containing equivalent resveratrol with various pH were prepared. Then resveratrol-excipient solutions were formulated,in which resveratrol was either mixed with oil phase,emulsifier,and co-solvent,separately,or blended with them together. The test solutions were placed under 40 ℃ and assayed at specific intervals. Curves of concentration versus time were fitted by sorts of dynamic equations,respectively,from which constants of degradation rate were calculated. The results showed that stable pH range of resveratrol was 3.6 to 5.0. Though microemulsion excipients accelerated degradation of resveratrol when they were mingled with the ingredient separately,the mixture could make resveratrol decomposition slower. Some excipient mixture even improved resveratrol stability. The appropriate emulsifier and co-solvent for resveratrol microemusion were cremophor EL and polyethylene glycol 400,respectively.

resveratrol microemulsion;pH;excipients;stability

2015-01-28

姚倩(1971-),女,博士,教授,研究方向:藥食同源植物有效部位的篩選與產品開發,E-mail:yaoqiancd@hotmail.com。

*通訊作者:茍小軍(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學，E-mail:cddxzyhx@hotmail.com。

教育部留學回國人員科研啟動基金(20131792)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)21-0098-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.011