紫茄皮中花青素的純化及穩定性研究

李 健,王金秋,劉 寧,黎晨晨

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

紫茄皮中花青素的純化及穩定性研究

李 健,王金秋,劉 寧*,黎晨晨

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

對以紫茄皮為原料提取的花青素進行大孔樹脂純化法純化,探討紫茄皮花青素的穩定性。通過靜/動態吸附-解吸實驗篩選大孔樹脂、優化純化工藝條件,在此基礎上,探討溫度、pH、氧化/還原性物質、防腐劑、金屬離子、糖等條件對紫茄皮中花青素穩定性的影響。結果表明:在供試樹脂中,AB-8大孔樹脂為紫茄皮花青素純化的最適吸附劑,其吸附最優條件為為吸附時間1 h,上樣量260 mL,吸附流速1 mL/min;最佳解析條件為,解析時間1 h,洗脫液乙醇體積分數為40%,洗脫液體積為80 mL,吸附流速1 mL/min,純化后的花青素純度為95.54%;高溫、pH、H2O2、抗壞血酸、苯甲酸鈉、Fe3+等導致紫茄皮中花青素穩定性降低。大孔樹脂純化法適合于紫茄皮花青素的純化。紫茄皮花青素應在4 ℃、pH1.0且避光條件下保存,在儲藏過程中應避免接觸鐵容器,紫茄皮花青素對H2O2、苯甲酸鈉很敏感,使用過程中應該避免二者存在。此外,紫茄皮花青素對糖穩定,生產中可依情況適量添加。

紫茄皮花青素,大孔樹脂,純化,穩定性

目前我們市場上普遍使用的色素大多為合成色素,天然色素在市面上的價格普遍較高,尤其是日本等發達國家售價格外昂貴[1]。因此,尋找一種產量大、來源廣、價格低的天然色素資源十分迫切[2]。1947年法國科學院研究生院年輕的博士馬斯魁勒在花生仁的包衣中首先發現了花青素物質[3]?；ㄇ嗨?Anthocyanidin),是天然色素中應用極其廣泛的一類色素,屬于酚類化合物中的類黃酮類,其基本結構包含兩個苯環,并由一個3碳的單位連結(C6-C3-C6)[4-5]。近年來,天然花青素的研究逐漸獲得重視,尤其是在食品、化妝品和醫藥等行業的應用上[6]。天然花青素具有低毒,色澤鮮艷,保健功能等優勢[7-8]。研究表明,花青素主要存在于植物細胞當中,大多來源于新鮮果蔬。茄子(Solanaceae),學名為SolanummelongenaL,是茄屬以漿果為果實的一年生草本植物,高60～80 cm,夏秋開花結果,槳果呈球形、橢圓形,果皮多為紫紅色,栽培面積廣泛[9-12]。茄子皮富含花青素物質,具有抗氧化、保健等功效[13]。因此茄子皮中花青素的提取、純化及穩定性的研究具有重要意義。

本文旨在以紫茄皮為原料,采用大孔樹脂純化法純化茄子皮花青素,并且探討紫茄皮花青素的穩定性,為天然使用色素產品的開發及工業化生產奠定基礎。同時,也實現了茄子的綜合利用,可以進一步提高茄子深加工技術水平,延展茄子生產的產業鏈,提高產品附加值。對茄子開發利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫茄子(大小一致的長條茄子) 哈爾濱市家樂福超市;大孔樹脂 哈爾濱市道外區盛達化驗儀器有限公司;蒸餾水 哈爾濱商業大學食品工程學院提供。

矢車菊-3-O-葡萄糖苷(色譜純,純度98%) 北京方程生物科技有限公司;氯化鐵、氯化鉀、氯化鈉、氯化鋁、硫酸銅 均購于天津市天力化學試劑廠;無水乙醇、冰乙酸、檸檬酸、無水乙酸鈉、苯甲酸鈉、抗壞血酸 均購于天津市博迪化工股份有限公司;鹽酸 天津市科密歐化學試劑有限公司;氯化鈣 天津市科密歐化學試劑有限公司。

EF-500搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;LD4-2A低速離心機 北京醫用離心機廠;UV-5100B型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;ALC-110.4電子天平 德國SARTORIUS集團;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HC-TP11-5架盤藥物天平 上海精密科學儀器有限公司。KQ-500VDED雙頻數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的活化 將大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,然后以乙醇沖洗至無白色渾濁,并以蒸餾水洗至無醇味;再以5%的鹽酸溶液浸泡12 h,蒸餾水洗至中性;最后用2%氫氧化鈉溶液浸泡12 h,蒸餾水沖洗至中性,備用[14]。

1.2.2 紫茄皮中花青素的提取 在之前的試驗中確定提取參數:將紫茄子在40 ℃條件下干燥24 h,粉碎,過40目篩。在超聲功率為350 W、液料比為60∶1 mL/g(溶液體積/紫茄皮質量)、乙醇體積分數為60%的條件下提取42 min,將提取液在3000 r/min條件下離心10 min,取上清液,即為紫茄皮花青素粗提液。

1.2.3 大孔樹脂的篩選 本試驗選擇三種大孔樹脂作為實驗吸附樹脂,樹脂吸附性能的優劣由其物理和化學性質所決定,各種樹脂的結構功能如表1[15]。

表1 不同樹脂的結構功能

準確稱取處理過的不同型號的大孔樹脂3 g,置于150 mL的錐形瓶中,分別加入30 mL已知吸光度A0的花青素粗提液,密封、25 ℃、100 r/min避光水浴震蕩24 h。充分吸附后,過濾,在510 nm下測濾液吸光度A1;用pH1.0蒸餾水洗脫除去水溶性雜質,過濾,將大孔樹脂置于150 mL錐形瓶中,加入30 mL pH1.0的體積分數60%的乙醇,密封、25℃、100r/min避光水浴震蕩24 h。充分解吸后過濾,在510 nm下測濾液的吸光度A2,按公式(1)計算吸附率α和按公式(2)解吸率β[16]。

式(1)

式(2)

式中:A0-提取液初始吸光度;A1-吸附后濾液吸光度;A2-解吸后濾液吸光度;V0-提取液初始體積,mL;V1-吸附后濾液體積,mL;V2-解吸后體積,mL;α-大孔樹脂吸附率,%;β-大孔樹脂解吸率,%。

1.2.4 大孔樹脂靜態吸附、解吸研究 分別研究大孔樹脂靜態吸附時間(0、1、2、3、4、5h)解吸時間(0、0.5、1、1.5、2、2.5h)及乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對解吸率的影響。按式(1)計算吸附率α和按式(2)計算解吸率β。各組實驗重復三次。

1.2.5 大孔樹脂動態吸附、解吸研究 在靜態吸附、解吸的基礎上進行動態吸附解吸實驗,對泄露曲線、吸附流速(0.5、1、1.5、2、2.5mL/min)、洗脫曲線、洗脫流速(0.5、1、1.5、2、2.5mL/min)四個因素進行實驗,按公式(1)計算吸附率α和按公式(2)計算解吸率β。各組實驗重復三次。

1.2.6 花青素保存率的計算

式(3)

式中:A1-保存后花青素吸光度值;A0-保存前花青素吸光度值。

分別考察了溫度、pH、光照、氧化性物質、還原性物質、防腐劑、金屬離子、糖對花青素穩定性的影響,以未加以上物質的花青素提取液為對照組,采用直接測量法進行檢測,按式(3)進行計算,各組實驗重復三次。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選結果

選取3種不同的大孔樹脂分別對紫茄皮花青素進行吸附及解吸試驗,試驗結果見表2。

表2 三種樹脂靜態吸附及解吸結果

由表2可以得出AB-8大孔樹脂為最佳純化花青素的樹脂。AB-8大孔樹脂吸附量大緣于AB-8是弱極性的樹脂,在吸附過程中易和色素形成氫鍵,結合比較牢固的原因[18]。

2.2 大孔樹脂靜態吸附平衡時間的確定

固定其他因素不變,以吸附時間為橫坐標,吸附率為縱坐標,繪制靜態吸附曲線,試驗結果如圖1所示,在靜態吸附過程的前1 h內AB-8大孔吸附樹脂對紫茄皮花青素吸附率迅速增加。在吸附時間達到1 h后,AB-8大孔吸附樹脂對紫茄皮花青素吸附靜態吸附上升趨于緩慢,考慮時間及花青素降解等因素,選取1 h為吸附平衡時間。

圖1 大孔樹脂靜態吸附平衡時間的確定Fig.1 Determination of static adsorption equilibrium time of macroporous resin

2.3 大孔樹脂靜態解吸平衡時間的確定

固定其他因素不變,以吸附時間為橫坐標,解吸率為縱坐標,繪制靜態解吸曲線,試驗結果如圖2所示,在靜態解吸過程的前1 h內AB-8大孔吸附樹脂對紫茄皮花青素解吸率迅速增加。在解吸時間達到1 h后,AB-8大孔吸附樹脂對紫茄皮花青素靜態解吸基本達到飽和。在1 h之后隨著解吸時間的增加,解吸率基本恒定,因此確定1 h為解吸平衡時間。

圖2 大孔樹脂靜態解吸平衡時間的確定Fig.2 Determination of static equilibrium time of macroporous resin

2.4 乙醇體積分數對大孔樹脂解吸效果的影響

固定其他因素不變,以乙醇體積分數為橫坐標,解吸率為縱坐標,繪制靜態解吸曲線,試驗結果如圖3所示,在乙醇體積分數40%內AB-8大孔吸附樹脂對紫茄皮花青素解吸率迅速增加。在水中乙醇可以與水互溶,而溶液的介電常數隨著洗脫劑中乙醇濃度的增大而改變,這使花青素與樹脂間的吸附作用減弱,從而增強了對色素的解吸能力[19]。在乙醇體積分數40%之后隨著乙醇體積分數的增加,解吸率基本恒定,因此確定乙醇體積分數40%為最佳解吸溶劑。

圖3 乙醇體積分數對大孔樹脂解吸效果的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the analytical results of macroporous resin

2.5 泄露曲線的測定

每次加入花青素粗提液10 mL,五次一組。當流出液中花青素吸光度值達到上樣液花青素吸光度值的1/10時認為已經出現泄漏[20]。從圖4可以看出,隨上樣液體積的增加,流出液中紫茄皮花青素含量增加,即大孔樹脂對紫茄皮花青素的吸附效果隨上樣液體積的增加而下降。當流出液中紫茄皮花青素吸光度值達到上樣液紫茄皮花青素吸光度值(1.68)的1/10時認為已經出現泄漏,即上樣液體積達到260 mL出現泄漏。因此確定紫茄皮花青素最大上樣量為260 mL。

圖4 最大上樣量體積的確定Fig.4 Determination of maximum sample volume

2.6 吸附流速對大孔樹脂吸附效果的影響

從圖5可以看出,隨上樣流速的增加,樹脂對紫茄皮花青素的吸附性能下降,原因是流速過快,花青素溶液與樹脂還未充分接觸就已經流出,使吸附率降低[21]。雖然流速為0.5 mL/min比1 mL/min時吸附效果好,但流速為0.5 mL/min會導致實驗的循環周期延長,考慮時間問題,所以將吸附流速控制為1 mL/min。

圖5 吸附流速對大孔樹脂吸附率的影響Fig.5 Effect of adsorption rate on adsorption rate of macroporous resin

2.7 洗脫曲線的測定

從圖6可以看出,隨洗脫液體積的增加,流出液中紫茄皮花青素含量先逐漸減少后趨于平穩。當流出液中紫茄皮花青素吸光度不變時,即洗脫液液體積達到80 mL時。因此確定紫茄皮花青素洗脫上樣量為80 mL。

圖6 洗脫液體積的確定Fig.6 Determination of the volume of the elution liquid

2.8 解吸流速對大孔樹脂解吸效果的影響

從圖7可以看出,隨解吸流速的增加,樹脂對紫茄皮花青素的解吸性能下降,原因是流速不同,紫茄皮花青素與樹脂的接觸時間不同,解吸率也會發生變化。雖然流速為0.5 mL/min比1 mL/min時吸附效果好,但流速為0.5 mL/min會導致實驗的循環周期延長,考慮時間問題,所以將吸附流速控制為1 mL/min。

圖7 解吸流速對大孔樹脂解吸率的影響Fig.7 Analysis of the effect of flow velocity on the resolution of macroporous resin

2.9 溫度對紫茄皮花青素穩定性的影響

由圖8可以看出,在4 ℃和室溫條件下保藏5 h后,紫茄皮中花青素的保存率下降為94.00%、89.91%,但在40℃和80℃條件下保藏5 h后,紫茄皮中花青素的保存率下降至70.75%、61.61%。這說明了紫茄皮花青素對熱敏感,因此花青素應在4 ℃條件下保存。

圖8 溫度對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.8 Effect of temperature on purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.10 pH對紫茄皮花青素穩定性的影響

在不同的pH下,溶液中的花青素所存在的4種結構的主體成分是不一樣的[22],反應4 h后進行全波長掃描結果如圖9所示:pH在1.0、2.0、3.0時紫茄皮中花青素的最大吸收峰出現在510 nm處且隨著pH的升高,吸光度值降低,pH4.0、pH5.0吸收曲線重合,pH6.0時紫茄皮中花青素無明顯吸收峰值。由圖可知花青素在pH1.0時有比較好的穩定性,由于花青素自結構的不穩定性,在pH較高時花青素不穩定,因此pH對于花青素的影響很顯著。

圖9 pH對紫茄皮花青素穩定性的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of anthocyanin purple eggplant skin

2.11 光照對紫茄皮花青素穩定性的影響

由圖10可知,避光對紫茄皮的保存率的影響最小,而室內自然光和室外自然光對紫茄皮花青的影響很大。7 d之后室內自然光和室外自然光保存率為68.64%、67.10%。說明紫茄皮花青素應在避光條件下保存較為穩定。

圖10 光照對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.10 Effect of light purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.12 氧化性物質對紫茄皮花青素穩定性的影響

由圖11可知H2O2對紫茄皮花青素的穩定性影響很大?；ㄇ嗨厝芤悍胖? d后不含H2O2溶液的花青素相對保存率為92.01%,含H2O2濃度為0.1、0.2、0.3 mL/25 mL的花青素溶液花青素的保存率僅為36.63%、29.55%和20.38%。因此H2O2對紫茄皮花青素的穩定性存在著很大的破壞作用能促進紫茄皮花青素的降解。根據研究報道,這可能是因為H2O2可直接親核進攻花青素的C位,花青素開環會生成查耳酮,而查耳酮可進一步降解生成各種無色的酯類物質[23]。

圖11 氧化性物質對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.11 Effect of oxidizing substances on purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.13 還原性物質對紫茄皮花青素穩定性的影響

分別加入1、3、5 mg/mL抗壞血酸對紫茄皮花青素溶液花青素保留率的影響,由圖12可知,紫茄皮花青素在抗壞血酸溶液中的保留率下降,且抗壞血酸質量濃度越高,其保留率就越低,紫茄皮中花青素的穩定性下降原因可能是抗壞血酸被氧化后產生過氧化氫引起的。

圖12 還原性物質對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.12 Effect of reducing substances of purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.14 防腐劑對紫茄皮花青素穩定性的影響

以苯甲酸鈉為例,由圖13可知,苯甲酸鈉對紫茄皮花青素的穩定性影響較大。放置7 d后不含苯甲酸鈉溶液的花青素保存率為95.42%,含苯甲酸鈉濃度為1、3、5 mL/mg的花青素溶液花青素的保存率僅為10.32%、5.62%和3.34%。由此可見苯甲酸鈉對紫茄皮花青素的穩定性存在著很大的破壞作用。因此生產中應盡量避免使用苯甲酸鈉做為防腐劑。

圖13 防腐劑對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.13 Effect of preservatives on purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.15 金屬離子對紫茄皮花青素穩定性的影響

各種金屬離子對紫茄皮花青素穩定性的影響如圖14～圖18,其中空白組為未添加金屬離子色素液。添加Fe3+保存率明顯下降。因為花青素類與Fe3+金屬離子發生化學反應并形成復雜的絡合物,而其他金屬離子如Cu2+、A13+、Na+、Ca2+對色素溶液的穩定性影響不明顯,這和文獻[24-25]的結果一致。綜上可知,紫茄皮中花青素在生產和使用過程中應避免與鐵質設備或容器接觸。

圖14 Fe3+對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.14 Effect of Fe3+ purple eggplant skin ant hocyanin preservation rate

圖15 Cu2+紫茄皮花青素保存率的影響Fig.15 Effect of Cu2+ purple eggplant skin ant hocyanin preservation rate

圖16 Al3+對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.16 Effect of Al3+ purple eggplant skin ant hocyanin preservation rate

圖17 Na+對紫茄皮花青素保存率的影響Fig. 17 Effect of Na+ purple eggplant skin ant hocyanin preservation rate

圖18 Ca2+對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.18 Effect of Ca2+ purple eggplant skin ant hocyanin preservation rate

2.16 糖對紫茄皮花青素穩定性的影響

由圖19、圖20可知,不含葡萄糖和蔗糖的花青素溶液在室溫下放置7 d后,其花青素相對保存率為94.52%,花青素在不同質量濃度的蔗糖和葡萄糖溶液中貯存隨時間變化情況,在放置7 d后花青素的保留率仍在85%。說明葡萄糖和蔗糖的存在下較穩定。

圖19 蔗糖對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.19 Effect of Sucrose on purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

圖20 葡萄糖對紫茄皮花青素保存率的影響Fig.20 Effect of glucose on purple eggplant skin anthocyanin preservation rate

2.17 大孔樹脂純化紫茄皮中花青素條件的驗證

按照實際優化的工藝條件(選取AB-8型號大孔樹脂、吸附時間1 h、上樣量260 mL,吸附流速1 mL/min解吸時間1 h,洗脫液乙醇體積分數為40%,洗脫液體積為80 mL)進行3次平行試驗,得到花青素的純度平均值為95.67%,該實驗得到的工藝參數準確、可靠,具有一定的實用價值。

3 結論

確定了花青素的最佳純化條件為最佳大孔樹脂AB-8；最佳吸附條件為：吸附時間1 h,上樣量260 mL,吸附流速控制為1 mL/min;最佳解吸條件為:解吸時間1 h,洗脫液乙醇體積分數為40%,洗脫液體積為80 mL,吸附流速控制為1 mL/min。紫茄皮中花青素對熱、pH、光敏感,應在4 ℃、pH1.0、避光條件下保存;對H2O2、苯甲酸鈉很敏感,使用過程中應該避免?；ㄇ嗨仡惻cFe3+金屬離子發生化學反應并形成復雜的絡合物,影響花青素的穩定性,而其他金屬離子對花青素沒有多大影響,因此在儲藏過程中應避免接觸鐵容器。另外對糖穩定,生產中可依情況適量添加。

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Study on the purification and stability of anthocyanins from purple eggplant skin

LI Jian,WANG Jin-qiu,LIU Ning*,LI Chen-chen

(Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province,College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

The anthocyanins extracted from purple eggplant skin as raw material of macroporous resin purification,and the anthocyanin from purple eggplant skins stability was studied. Through the static / dynamic adsorption and desorption experiments,the optimized conditions of macroporous resin and purification process were optimized,the effects of temperature,pH,oxidation/reduction substances,preservatives,metal ions,sugars on purple eggplant skin anthocyanin stability were investigated. The experimental results showed that selecting AB-8 macroporous resin as adsorbent,the optimal adsorption conditions were the adsorption time of 1 h,260 mL of volumn,adsorption the flow rate of 1 mL/min,the desorption rate of 40%,the elution volume of 80 mL,the adsorption flow rate of 1 mL/min,and the purity of the purified anthocyanin was 95.54%.The anthocyanin in purple eggplant skin was sensitive to heat,acid,alkali,H2O2,ascorbic acid,sodium benzoate,Fe3+.,and it was stable to sugar. The purification method of macroporous resin was suitable for purification of purple eggplant anthocyanin. Anthocyanins of purple eggplant green elements should be in the 4 ℃,pH1.0 and avoid light preservation. In the process of storage,anthocyanin of purple eggplant should avoid contacting with iron container,and eggplant purple anthocyanins are very sensitive to H2O2and sodium benzoate,which should be avoided at the same time during the process. In addition,purple eggplant anthocyanin was stable to the sugar,so the sugar can be added apprpriately.

anthocyanin of purple eggplant;macroporous resin;purification;stability

2015-09-08

李健(1956-)，男，本科，教授，研究方向：食品科學，E-mail：lijian4852147@163.com。

*通訊作者:劉寧(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：農產品化學與綜合利用，E-mail:wendingzi666@163.com。

黑龍江省教育廳科學技術面上項目(12541199)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)21-0133-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.019