β-1,3-1,4葡聚糖酶在大腸桿菌中的高效分泌表達

陳珊珊,吳珊珊,吳 斌,何冰芳

(南京工業大學藥學院,江蘇南京 211816)

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大腸桿菌中的高效分泌表達

陳珊珊,吳珊珊,吳 斌,何冰芳*

(南京工業大學藥學院,江蘇南京 211816)

在大腸桿菌中實現β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表達。將實驗室自主開發的信號肽ff53與β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)進行融合連接到pET-28a(+)上;通過優化誘導表達條件,28 ℃、8 g/L乳糖誘導10 h,重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達到1093 U/mL,與IPTG誘導的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍。本研究為高密度發酵制備該酶奠定了基礎。

信號肽ff53,β-1,3-1,4葡聚糖酶,分泌表達,大腸桿菌

β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)(BGL)是一種重要的工業用酶,主要來源于植物和微生物,能夠高效、專一分解禾本植物胚乳細胞壁中的β-葡聚糖,因而廣泛應用于啤酒釀造業和飼料業[1-2]。在啤酒釀造過程中,β-1,3-1,4-葡聚糖酶能有效提高糖化得率[3],可降低麥汁粘度,改善啤酒風味,保持成品酒穩定性[4]。在飼料中添加這類酶可顯著降低谷物中所含β-葡聚糖的聚合度,改善谷物營養價值,增加飼料利用率[5-6]。除此之外,β-1,3-1,4-葡聚糖酶可以降解真菌的細胞壁,顯示抗真菌和植物病原菌的活性[7-8]。目前國內外己克隆和表達了多種不同來源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,包括枯草芽孢桿菌[9-10]、地衣芽孢桿菌[11]、熱纖維桿菌[12]和牛鏈球菌[13]等。目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中多為胞內表達,胞內表達較好的酶活為1286 U/mL[11]。僅有少量研究實現了分泌表達,Mao[14]等通過將β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆至pET-32a(+)中,在大腸桿菌中實現了分泌表達,胞外酶活為102.7 U/mL。作為釀造與飼料用酶,胞外表達可以極大簡化下游復性及分離純化,同時可減少表達蛋白對宿主菌的毒性和代謝負擔,顯著提高表達量。

本課題組前期從B.subtilisLC-9 中得到一種高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并實現了其在大腸桿菌BL21(DE3)中的胞內表達[15]。為了進一步擴寬β-1,3-1,4-葡聚糖酶的實際應用,簡化其后續分離制備工藝,本研究將實驗室自主開發的信號肽ff53[16]與β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因(bgl)融合,在大腸桿菌中實現了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表達,為高密度發酵制備β-1,3-1,4-葡聚糖酶奠定了基礎。

表1 實驗中所用的引物序列

注:下劃線為NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質粒 枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLC-9(CCTCCM208073)、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21/pET-bgl和表達載體pET-28a(+)實驗室保存。

1.1.2 培養基 LB培養基(g/L):氯化鈉10,蛋白胨10,酵母粉5。固體培養基中加入2%瓊脂?？剐耘囵B基加入卡那霉素(50 μg/mL)。

1.1.3 酶和試劑 DNA限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、蛋白質分子量標準和DNA分子量標準 寶生物工程(大連)有限公司;2×Taq PCR Master Mix和Pfu DNA Polymerase 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素 Sigma公司;乳糖 西隴化工股份有限公司;1-3,1-4-beta-D-Glucan和大麥β-葡聚糖 Megazyme公司;引物合成及測序 蘇州金唯智公司。

1.1.4 實驗儀器 酶標儀 美國BIO-TECH;PCR儀 德國Eppendorf;凝膠成像系統 英國UVItec Cambrige;垂直電泳儀 美國Biorad;超凈臺工作室 蘇州凈化設備廠;紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆表達 參照文獻[15]的方法。

1.2.2 信號肽ff53融合β-1,3-1,4-葡聚糖酶的克隆表達。

1.2.2.1 表達引物的設計 根據信號肽ff53和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因序列,設計over-lap擴增策略的部分重疊引物,引物序列如表1所示。

1.2.2.2 Over-lap PCR 第一輪PCR:以ff53-F和ff53-bgl-Rm為引物擴增上游信號肽ff53;以ff53-bgl-Fm和bgl-R擴增β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽bgl;第二輪PCR:以第一輪產物ff53和bgl為模板進行延伸,獲得融合基因片段;第三輪PCR:以ff53-F和bgl-R為引物,以融合基因片段為模板,進行擴增獲得融合基因ff53-bgl[17]。

1.2.2.3 重組質粒pET-ff53-bgl的構建 pET-28a(+)是受強噬菌體T7轉錄及翻譯信號控制的高效表達載體。PCR產物經純化后用限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切,同時以相同的限制性內切酶酶切pET-28a(+)。將酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,回收雙酶切的融合基因和載體,T4 DNA Ligase連接,16 ℃連接過夜,連接產物轉化E.coliBL21(DE3)細胞中,涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板,37 ℃過夜培養后。菌落PCR鑒定陽性重組子,挑選陽性重組子提取質粒用NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切驗證同時進行測序驗證。

1.2.3 重組菌的誘導表達

1.2.3.1 IPTG誘導 將重組菌接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基,37 ℃,180 r/min培養過夜后,按2%接種量接種至新鮮LB培養基中(50 μg/mL卡那霉素),37 ℃,180 r/min培養OD600為0.6～0.9時,參照文獻[11]的方法,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導,28 ℃誘導表達10 h。

取1 mL誘導表達的菌液于1.5 mL離心管,12000 r/min離心1 min。收集上清,另外用1 mL ddH2O重懸菌體,12000 r/min離心1 min,徹底除去上清,再用1 mL ddH2O重懸菌體。菌體于冰浴中超聲破碎至澄清,12000 r/min離心1 min,收集上清。

1.2.3.2 乳糖誘導 按方法1.2.3.1所述,分別加入終濃度為0.5、2、4、6、8、10 g/L的乳糖進行誘導,28 ℃誘導表達10 h。

1.2.4 表達產物SDS-PAGE電泳 取方法1.2.3中的發酵液上清和細胞破碎上清進行分析。采用12.5%的分離膠和4%的濃縮膠的SDS-PAGE,發酵液上清和細胞破碎上清加入4×上樣緩沖液,沸水浴5 min后上樣15 μL,電泳后使用考馬斯亮藍R-250進行染色[18]。

1.2.5 糖苷酶活力測定 采用二硝基水楊酸(DNS)法測定糖苷酶活力[19]:以1%(W/V)1-3,1-4-beta-D-Glucan 1 mL作為底物,加入0.5 mL適當稀釋的酶液,45 ℃反應10 min后,立即加入3.0 mL DNS溶液終止反應,沸水浴5 min顯色,冷卻后測540 nm下反應液的吸光值,以滅活的酶液作為空白對照。酶活力單位(U)定義:每分鐘由底物產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。

1.2.6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學性質 參照文獻[4]的方法,考察pH和溫度對胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的影響,研究該酶的溫度和pH穩定性。

2 結果與分析

2.1 信號肽ff53與bgl基因的融合

為了實現信號肽ff53與bgl基因的融合,按方法1.2.2所述進行擴增。擴增的產物經凝膠電泳(圖1a),上游序列ff53在150 bp左右有一條帶,下游序列bgl在650 bp左右有一條帶,與預計大小(上游159 bp,下游642 bp)一致。重疊后的PCR產物在800 bp左右出現一條條帶,與預計融合基因ff53-bgl條帶大小(801bp)基本符合(圖1b),這表明成功實現了信號肽ff53與bgl基因的融合。

圖1 PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product注:a:M:DL2000 DNA分子量標準;1:ff53;2:bgl;b:M:DL2000 DNA分子量標準;1:融合基因ff53-bgl

2.2 重組質粒pET-ff53-bgl的構建

PCR產物ff53-bgl和pET-28a(+)分別經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切,經T4 DNA Ligase連接獲得重組質粒pET-ff53-bgl,其構建過程如圖2。

圖2 重組質粒pET-ff53-bgl構建圖Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-ff53-bgl

對重組質粒pET-ff53-bgl進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證,瓊脂糖凝膠電泳在約800 bp和5000 bp處出現條帶(圖3),與目的基因和pET-28a(+)的片段大小一致。測序結果表明克隆的序列與理論序列一致,表明成功構建了重組質粒pET-ff53-bgl。同時構建了不帶信號肽的重組質粒pET-bgl作為對照。

圖3 重組質粒pET-ff53-bgl經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證圖Fig.3 Idenfication of recombinant plasmid pET-ff53-bgl double digested by NcoⅠand XhoⅠ注:1:DL15000 DNA分子量標準;2:DL2000 DNA分子量標準;3:ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;4:pET-ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;5:pET-28a(+)/NcoⅠ-XhoⅠ。

2.3 重組菌的誘導表達

2.3.1 重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl的分泌表達 按方法1.2.3.1所述進行誘導,以酶活力及SDS-PAGE電泳考察胞外分泌表達情況,結果如圖4,重組菌E.coliBL21/pET-bgl誘導表達10 h后的發酵液上清幾乎無酶活,重組細胞的破碎上清酶活力達到583 U/mL(見第3泳道),經SDS-PAGE電泳在28 ku左右有一條明顯的蛋白條帶,這與β-1,3-1,4-葡聚糖酶理論分子量28 ku一致。重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發酵液上清酶活達到562 U/mL(見第4泳道),在28 ku左右出現明顯的蛋白條帶,與不帶信號肽的β-1,3-1,4-葡聚糖酶大小一致,表明信號肽ff53已被切除。重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl總酶活(菌體OD 1.9)達到860 U/mL,總酶活是未加信號肽ff53的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(菌體OD 2.1)的1.48倍。酶活力測定和SDS-PAGE結果顯示融合信號肽ff53的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中不僅實現了高效的分泌表達,還增加了總酶活力。

圖4 IPTG誘導重組菌的SDS-PAGE(a)及酶活力圖(b)Fig.4 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by IPTG注:M:蛋白分子量標準;泳道1:對照E.coli BL21/pET-28a(+);泳道2:E.coli BL21/pET-bgl發酵液上清;泳道3:E.coli BL21/pET-bgl細胞破碎上清;泳道4:E.coli BL21/pET-ff53-bgl發酵液上清;泳道5:E.coli BL21/pET-ff53-bgl細胞破碎上清。

2.3.2 重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl分泌表達的優化 乳糖除了能作為lac操縱子的誘導劑外,本身也是一種碳源可以被菌體代謝利用,通過提高菌體量從而產生更多的目標蛋白。按方法1.2.3.2所述用乳糖進行誘導,結果如圖5,在一定范圍內,乳糖終濃度愈高,目的蛋白的表達量也愈高。當乳糖終濃度為8 g/L時,重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發酵液上清酶活達到最高,為1093 U/mL,與用IPTG誘導的重組菌相比,發酵液上清酶活力提高了0.87倍。此后隨著乳糖濃度的增加,目的蛋白的表達量不再增加并且略有下降。用乳糖代替IPTG作為誘導劑,不僅可以節約生產成本,而且還提高了重組菌發酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力。

圖5 乳糖誘導重組菌SDS-PAGE(a)及酶活圖(b)Fig.5 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by lactose注:M:蛋白分子量標準;泳道1-6:E.coli BL21/pET-ff53-bgl分別在乳糖終濃度為0.5、2、4、6、8、10 g/L條件下誘導時的發酵液上清。

2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學性質研究

胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適反應pH和溫度分別為6.5和45 ℃,且在pH6.5 和45 ℃下穩定;該性質與野生菌BacillussubtilisLC-9產生的原始酶一致[4]。

3 結論

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作為一種重要的工業用酶,其應用已經擴展到飼料工業、釀酒工業、醫藥紡織等各個領域中,具有廣闊的應用前景[20]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中多為胞內表達,僅有少量研究實現了分泌表達。本研究采用over-lap PCR將本實驗室自主開發的信號肽ff53與β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)進行融合,成功實現了β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌表達系統的高效分泌表達。通過優化誘導表達條件,28 ℃、8 g/L乳糖條件下誘導10 h,重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達到1093 U/mL,與IPTG誘導的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍;并且發酵液上清中目的蛋白占總蛋白的80%以上,有利于目的蛋白的分離純化。胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適反應pH和溫度分別為6.5和45 ℃,且在pH6.5和45 ℃下穩定。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大腸桿菌胞外高效分泌為進一步高密度發酵制備該酶奠定了基礎。

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Efficient secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase inE.coli

CHEN Shan-shan,WU Shan-shan,WU Bin,HE Bing-fang*

(College of Pharmaceutical Sciences,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In this study,the highly secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase was achieved inE.coli. Signal peptide ff53 developed by our team was fused with mature peptide gene(bgl)of β-1,3-1,4-glucanase,then cloned into the pET-28a(+)plasmid. Efficient extracellular expression was obtained under following optimized conditions:8g/L lactose at 28 ℃ for 10 h,resulting in the enzyme activity ofE.coliBL21/pET-ff53-bglin culture medium reached 1093 U/mL,which increased 0.87 folds compared with enzyme activity ofE.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)induced with IPTG. The study laid the foundation of high density fermentation of β-1,3-1,4-glucanase production.

signal peptide ff53;β-1,3-1,4-glucanase;secretory expression;E.coli

2015-03-10

陳珊珊(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學,E-mail:starrygirl@126.com。

*通訊作者:何冰芳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：微生物學、分子生物學,E-mail:bingfanghe@njtech.edu.cn。

國家973計劃(2011CBA00807)；國家973計劃(2011CB707400)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.020