一株具有拮抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌生物學性質及其在發酵乳中應用

陳曉華,劉小鳴,王 剛,田豐偉,張 灝,陳 衛,*

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.衡陽師范學院生命科學系,湖南衡陽 421008)

一株具有拮抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌生物學性質及其在發酵乳中應用

陳曉華1,2,劉小鳴1,王 剛1,田豐偉1,張 灝1,陳 衛1,*

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.衡陽師范學院生命科學系,湖南衡陽 421008)

本研究探討具有抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌的生物特性,結果表明L.gasseriChen在MRS培養基生長比較慢,8 h進入生長對數期,26 h后進入穩定期;最適生長pH為5～7,最適生長溫度為30～37 ℃,最適接種量為0.5%～2%(v/v),可在0.1%的膽鹽中生長,并能在5%的NaCl中生長。在添加葡萄糖的復原乳中,L.gasseriChen能進行單菌株發酵乳,且在4 ℃條件下可穩定保存21 d;L.gasseriChen與普通酸奶發酵劑復合發酵制作的酸奶無不良風味,表明L.gasseriChen可應用于商業上生產功能性酸奶。

幽門螺桿菌,格氏乳桿菌,發酵乳,生物學性質

幽門螺桿菌是一種螺旋狀、有鞭毛的革蘭氏陰性菌,我國居民感染率高達60%,且會誘發產生胃炎、胃癌病癥。目前,抗生素治療有很多副作用,如耐藥性菌株產生、復發率高、產生腹瀉腹痛,擾亂胃腸道微生態平衡等。目前,不少研究利用益生菌進行防治幽門螺桿菌的感染[1-2]。益生菌是一種或多種微生物組成的活菌培養物,可促進動物或人體原生微生物菌群生長而對宿主產生有益的影響[3]。食品級的乳桿菌大部分可以作為益生菌,廣泛應用于食品、飼料、醫學及化妝品領域,給經濟帶來巨大效益。乳桿菌在食品領域上作為益生菌一般具有兩個特性,第一具有耐酸,耐膽鹽的特性,其活菌在胃腸道中可以粘附或是短暫停留以發揮益生功能;第二具有某些特定的益生功能,如調節胃腸道菌群平衡、提供機體免疫功能或是抑制病原菌功能等。因此,乳桿菌作為益生菌在功能型發酵乳中應用,需考察其這兩個方面的益生特性。

格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri,或稱加氏乳桿菌)是一種人類腸道和陰道中的內在菌,桿狀、圓端,有時呈鏈狀,大小為(0.6～0.8)×(3.0～5.0)μm,革蘭氏陽性菌,目前已被衛生部批準作為益生菌在食品中應用。格氏乳桿菌有多種益生功能,如格氏乳桿菌可以在女性陰道中分泌產生lactocillin,以此來殺滅陰道中的致病菌[4];格氏乳桿菌細胞壁可以調節因致病菌引起的不良炎癥反應[5];格氏乳桿菌可以拮抗幽門螺桿菌感染[6]等。本研究對格氏乳桿菌(L.gasseriChen)拮抗幽門螺桿菌感染進行相關的研究,結果表明在體外格氏乳桿菌能夠抑制幽門螺桿菌的生長、尿素酶活性、抑制幽門螺桿菌粘附胃上皮細胞,格氏乳桿菌拮抗幽門螺桿菌作用與其代謝的細菌素有關等研究[7-8]。為了探求L.gasseriChen能否作為益生菌應用于酸奶加工中,本研究探討其生物學特性和發酵特性,旨在為開發干預幽門螺桿菌感染的酸奶生產應用奠定理論基礎,為藥食同源法防治幽門螺桿菌感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

格氏乳桿菌(L.gasseriChen)由江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心;酸奶發酵劑(LB340和TA460) 丹尼斯克公司。MRS培養基 青島海博公司;牛膽汁粉 上海生工;奶粉 上海光明乳業。

UV-2100紫外可見分光光度計 尤尼科上海有限公司;DMB5顯微鏡(Motic China Group Co.,Ltd);SW-CJ-1CV超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;滅菌鍋(SANYO Electric Co.,Ltd);320-S pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;NDJ-79型粘度儀 同濟大學機電廠;TA-XT2質構測試儀(STab. Micro System,Godalming UK);5415R離心機(Eppendorf);小型冷凍離心機(Germany Hettich Co.,Ltd)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的制備 將L.gasseriChen接入MRS液體培養基中,37 ℃培養至對數期,連續培養2代,獲得新鮮培養物4 ℃保存備用。

1.2.2 乳酸菌生物學特性研究 不同溫度對乳酸菌生長的影響[9-10]:取對數期的菌株按1%(v/v)接種量接入到MRS液體培養基,分別于不同溫度(15～42 ℃)下厭氧培養18 h,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

最初pH對乳酸菌生長的影響[9-10]:活化后的菌株培養液離心(6000 r/min,10 min),收集菌體,用滅菌PBS(pH7.4)離心洗滌2次,按1%(v/v)接種量接入不同pH(2.0～7.0)的MRS液體培養基中,在37 ℃厭氧培養18 h,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

不同接種量對菌株生長的影響[9-10]:將活化的菌株按不同的接種量(0.5%～10%)接入MRS培養基,37 ℃厭氧培養18 h,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

菌株生長曲線的測定[9-10]:取對數期的菌株按1%(v/v)接種量接入MRS培養基中,37 ℃厭氧培養,每隔2 h取樣,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

菌株對膽汁耐受性的測定[9-10]:取對數期的菌按1%(v/v)接種量接入含有不同質量分數(0～0.45%)牛膽汁粉的MRS培養基中,37 ℃厭氧培養18 h,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

菌株對NaCl耐受性的測定[9-10]:取對數期的菌按1%(v/v)接種量接入到含有不同質量分數(0～9%)NaCl的MRS培養基中,37 ℃厭氧培養18 h,測定培養物在600 nm波長處的OD值。

1.2.3 發酵乳樣品的制備 單菌株發酵:活化的L.gasseriChen菌株培養液6000 r/min,10 min離心,收集菌體,用滅菌PBS離心洗滌2次,以2%(v/v)的接種量接種到已滅菌的12%(w/v)的脫脂乳(含1%葡萄糖)中,在42 ℃培養24 h,測定各項指標[11]。

復合菌株發酵:全脂復原乳(1%葡萄糖,蔗糖6.5%,全脂粉11.5%)預熱到60 ℃,高壓均質(20 MPa)兩次后,攪拌煮沸滅菌,自然冷卻到42 ℃并接入發酵劑(保加利亞乳桿菌LB340和嗜熱鏈球菌TA460)和L.gasseriChen(菌株接種量均為2×107CFU/g),放入42 ℃培養箱發酵10 h,冷卻至4 ℃保藏24 h[11]。

1.2.4 發酵乳理化指標測定 發酵乳滴定酸度的測定:10 g的酸奶樣品,置于100 mL的三角瓶中,加入20 mL水和0.5 mL 0.5%的酚酞溶液,搖勻,用0.1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色,并在1 min內不消失為止。消耗的0.1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液的毫升數乘以10,即得滴定酸度(°T),取三次測定的算術平均值[11]。

發酵乳粘度的測定:采用NDJ-5S型粘度計、10x的轉子在25 ℃進行測定,取三次測定的算術平均值[12]。

發酵乳脫水收縮的測定:稱取15.0 g發酵乳樣品,置于帶有濾紙的漏斗中,21 ℃放置90 min,收集濾液并稱重[12]。

脫水收縮率(%)=(濾液重g/樣品重量g)×100

發酵乳質構的測定:將發酵乳樣品調溫至20～22 ℃,采用TA-XT2質構測試儀SMS P/25平底柱形探頭進行測定。測定條件:測前速率5.0 mm/s、測試速率2.0 mm/s、測后速率2.0 mm/s,探頭進入距離為20 mm,兩次壓縮之間的停留時間為5 s。利用質構數據分析軟件計算得到硬度、凝聚性和黏著性[12]。

發酵乳活菌數的測定:取0.5 g發酵乳樣品,用滅菌生理鹽水梯度稀釋后,采用選擇培養基平板傾注法,測定活菌數量。采用M17固體培養基計算球菌數,采用MRS固體培養基計算桿菌數[12]。

2 結果與討論

2.1 菌株生理特性研究

2.1.1 溫度對菌株生長的影響 乳桿菌一般在溫度30～37 ℃生長良好,有些菌株甚至可以在10 ℃生長。但應用于制作食品的乳桿菌不宜具有低溫下生長的能力,因為乳桿菌在低溫下生長的性能會致使產品的貯藏時間縮短,影響產品的品質。因此,需探求不同培養溫度下對L.gasseriChen菌株生長的影響。L.gasseriChen菌株在溫度為20～42 ℃范圍內均可生長,最適生長溫度為30～37 ℃,在此溫度下,培養液的pH在4.2左右(見表1)。

表1 不同溫度對L. gasseri Chen菌株生長的影響

注:abcd不同字母表示同一列方向在p=0.05水平上顯著性差異,表2同。

2.1.2 不同接種量對菌株生長的影響 不同接種量對L.gasseriChen菌株生長的影響見表2,L.gasseriChen菌株的生長隨著接種量的增大呈下降趨勢,最適接種量在0.5%～2%之間,此接種量下,培養液的pH在4.0左右。

表2 不同接種量對L. gasseri Chen菌株菌株生長的影響

2.1.3 菌株最適生長pH 人的胃的pH一般在1～4,作為益生菌的前提條件應該具備一定的耐酸性。因此,考察不同pH對L.gasseriChen菌株生長的影響。如圖1,L.gasseriChen生長的pH比較廣,在高于pH3范圍內都能很好的生長,最適生長pH為6～7。L.gasseriChen在pH2～3之間,生長很不好,但是在pH2的人工胃液中存活率達到2%左右[2],可見還是具有潛在益生菌性質。

圖1 不同pH對菌株L. gasseri Chen生長的影響Fig.1 The growth effect of L. gasseri Chen in different pH

2.1.4 菌株生長曲線L.gasseriChen菌株在MRS培養基中的生長曲線見圖2,L.gasseriChen則生長比較慢,該接種量下8 h才進入對數生長期,26 h后進入穩定期。相較于其他乳酸菌,如植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌而言[13],L.gasseriChen菌株延滯期比較長,但最終L.gasseriChen在MRS生長的細胞數也能達到109CFU/mL。

圖2 L. gasseri Chen在MRS培養基中的生長曲線Fig. 2 The growth curve of L. gasseri Chen in the media of MRS

2.1.5 菌株耐受膽汁的能力 微生物能夠在腸道中存活、生長并發揮功效,必須具有耐受膽鹽特性。人體消化道中因部位不同,膽鹽的含量也不同,一般而言,人體小腸中膽鹽的含量在0.03%～0.3%之間,能夠在正常生理膽鹽濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道中存活[13]。L.gasseriChen膽鹽耐受力不高,但還是能夠在膽鹽濃度為0.1%的培養基中生長(見表3)。

表3 L. gasseri Chen菌株膽鹽耐受力

注:++表示培養基在24 h內變色,+表示培養基在48 h內變色,-表示培養基不變色。

2.1.6 菌株耐受NaCl的能力 乳酸菌耐受NaCl的能力見表4,L.gasseriChen能在質量分數為5%的NaCl溶液中正常生長,pH為4.2左右。

表4 L. gasseri Chen菌株的NaCl耐受力

注:+表示可生長,++表示生長很好,-表示不能生長。

2.2 格氏乳桿菌在乳制品中的應用

2.2.1 單菌株發酵分析L.gasseriChen在含有葡萄糖的脫脂乳中單獨發酵,發酵過程中pH、滴定酸度和活菌數變化見圖3、圖4。如圖所示,乳酸菌在42 ℃、24 h發酵過程中,隨著發酵時間的延長,活菌數和滴定酸度升高,pH降低。但在脫脂乳中生長并不是很好,大約僅增加0.6個對數值?？梢?L.gasseriChen并不適合單獨作為發酵劑生產發酵乳,應與商業發酵劑聯用制作功能型發酵乳。

圖3 L. gasseri Chen的單菌落發酵乳pH和滴定酸度的變化Fig. 3 The pH and titratable acidity curves of L. gasseri Chen fermented milk

圖4 L. gasseri Chen的單菌落發酵乳菌落數變化Fig.4 The count curve of L. gasseri Chen fermented milk

2.2.2 單菌株發酵乳存儲期變化分析L.gasseriChen單菌株發酵乳在4 ℃保存21 d(見圖5),pH、菌落數和脫水收縮性都無顯著變化,但是滴定酸度有所增加,這可能跟菌株的后酸化以及風味的形成有關,但影響并不大。因此,L.gasseriChen菌株可應用于酸奶發酵中。

圖5 L. gasseri Chen單菌落發酵乳儲藏期理化指標Fig.5 The physical characterizations of L. gasseri Chen fermented milk in the storage

2.2.3 復合菌株發酵乳品質分析 乳酸菌L.gasseriChen與商業菌株保加利亞乳桿菌(LB340)和嗜熱鏈球菌(TA460)復合發酵如表5所示。L.gasseriChen分別與商業菌株復合發酵時,凝乳時間比單菌株發酵有所提前。冷藏24 h后的酸乳,滴定酸度大約在100 °T左右;pH大約是在4.2左右;菌落數在109CFU/g左右;粘度在3700 Pa·s左右。對復合菌株發酵乳的質構進行分析,發現商業發酵劑發酵乳的黏著性比較好,L.gasseriChen的復合發酵乳的硬度和凝聚性比較好,硬度則相差不大。但整體而言,復合發酵乳與普通酸奶品質上差異并不大?？梢?添加L.gasseriChen菌株進行酸奶制作,對產品的理化指標影響不大,但卻有特殊的生理功能,具有開發功能型發酵乳的潛質。

表5 復合發酵乳在4 ℃冷藏24 h后理化指標

3 結論

本研究探討具有抗幽門螺桿菌作用的格氏乳桿菌(L.gasseriChen)的生物特性,并初步研究L.gasseriChen在乳制品中應用。L.gasseriChen生長比較慢,8 h進入生長對數期,26 h后進入穩定期;最適生長pH為5～7,最適生長溫度為30～37 ℃,最適接種量為0.5%～2%(v/v),可在0.1%的膽鹽中生長,并能在5%的NaCl中生長。L.gasseriChen可在添加葡萄糖的牛乳中生長,但生長增殖量不大,單菌株發酵乳在4 ℃條件下可保存21 d,理化性質相對比較穩定。L.gasseriChen與商業菌株復合發酵制作的發酵乳,在滴定酸度、pH、粘度和總菌數等理化指標方面無差別,同時質構分析也無顯著差別?？梢奓.gasseriChen與商業菌株復合發酵制作酸奶無不良影響,可應用于商業上生產功能性酸奶。

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Study on the biological characteristics ofLactobacillusgasseriwith antagonistic activity againstHelicobacterpyloriand application in the yoghurt produce

CHEN Xiao-hua1,2,LIU Xiao-ming1,WANG Gang1,TIAN Feng-wei1,ZHANG Hao1,CHEN Wei1,*

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Life Science,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

The aim of present study was to discuss the application and biological characteristics ofL.gasseriChen with antagonistic activity againstH.pylori. Biological characteristics research ofL.gasseriChen showed that the logarithmic time was from 8th hour to 26th hour. The optimum growth pH 5～7. The optimum growth temperature was 30～37 ℃.The optimum inoculated concentration was 0.5%～2%(V/V),and the tolerance level of bile salt was 0.1%(V/V).L.gasseriChen could grow and ferment in the milk with glucose and the fermented milk could store stably in the 4 ℃ for 21 days.L.gasseriChen also could ferment in milk with commercial starters without bad affects,which indicated thatL.gasseriChen could be used to produce functional yoghurt.

Helicobacterpylori;Lactobacillusgasseri;yoghurt;biological characteristic

2015-04-07

陳曉華(1981-)，女，博士研究生，研究方向：食品生物技術,E-mail:chxh0217@163.com。

*通訊作者:陳衛(1966-)，男，博士生導師，研究方向：食品生物技術，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國家科技支撐計劃課題(2012BAD28B07)；湖南省自然科學基金項目(2015JJ6012)；糧油深加工與品質控制湖南省2011協同創新項目資助；衡陽市科技發展計劃項目(2014KN54)；湖南省教育廳資助科研項目(15B034)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.022