丁香精油對擴展青霉生長和毒素分泌的影響

羅 曼,姜 辣,陳成花,李 楊,孟祥紅

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

丁香精油對擴展青霉生長和毒素分泌的影響

羅 曼,姜 辣,陳成花,李 楊,孟祥紅*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

為了更全面、合理的評價丁香精油作為防腐保鮮劑對病原菌生長的控制效應及毒素合成間的相關性,以熏蒸的方式,通過離體和活體實驗,研究了不同濃度的丁香精油對擴展青霉生長和毒素分泌的影響。結果表明,固體培養中,26.0 μL/L的丁香精油熏蒸對擴展青霉的孢子萌發、菌體生長和毒素分泌均起到明顯的抑制作用;雖然在液體培養和活體實驗中,相同濃度的丁香精油熏蒸抑制菌體生長同時促進了毒素分泌,但是在這兩種實驗模式下,當丁香油濃度達到130 μL/L以上時,才達到同時抑制生長和產毒的效果。因此,將丁香精油作為防腐保鮮劑開發時,需同時考慮其對展青霉素分泌的影響,以期達到抑菌效果和食用安全性。

丁香精油,擴展青霉,生長,展青霉素

擴展青霉(Penicilliumexpansum)是引起蘋果、梨和桃等大宗水果發生青霉病害的主要病原菌[1],其在生長代謝過程中會分泌一種被稱作展青霉素的有毒次級代謝產物。展青霉素具有潛在的細胞和動物毒性,對人和動物存在致畸性、致癌性和免疫毒性[2]。該毒素是一種常見的水果污染物,在蘋果、桃、葡萄、梨、櫻桃等多種水果及其制品中均有發現[3]。食品中展青霉素的殘留問題已引起世界衛生組織的高度關注,許多國家對其最低限量做出了嚴格規定[4]。

長期以來,安全高效的果實貯藏保鮮技術的研發是農業領域的工作重心之一。目前,使用化學殺菌劑仍是控制果蔬產品采后病害的主要手段,但高劑量化學殺菌劑的使用所造成的環境污染、農藥殘留和抗藥性增加等問題,已引起全社會廣泛的關注。因此,尋找安全環保的新型抗菌劑成為國內外抗菌領域的研究熱點[5]。丁香精油是從丁香的花蕾、葉子等處提取的芳香精油,屬藥食同源物品。有研究表明,丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、枝孢樣枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)的生長[6]。丁香精油對黃曲霉(Aspergillusflavus)、橘青霉(Penicilliumcitrinum)、黑根霉(Rhizopusnigricans)的最小抑菌濃度分別為25、25、50 μL/mL。李鵬霞等[7]發現丁香精油對采后蘋果的主要致病菌擴展青霉(Penicilliumexpansum)、灰霉(Botrytiscinerea),炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果褐腐病菌(Moniliafructigena)的生長均有較好的抑制作用,并且丁香油處理蘋果果實還有利于保持蘋果的品質和風味。之前有關丁香精油抑菌作用的研究主要集中在其對菌體生長的抑制作用和對水果品質的影響方面,但丁香精油對擴展青霉的毒素分泌方面的研究鮮有報道。

本文研究了用熏蒸處理的方式,通過離體和活體實驗,揭示了丁香精油對擴展青霉生長和展青霉素分泌的影響作用,為丁香精油作為抑菌劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香精油 上海國藥集團化學試劑有限公司;乙腈,冰乙酸為色譜純,其他試劑均為分析純;展青霉素標準品 美國sigma公司 純度≥98%;實驗用水均為超純水。擴展青霉(Penicilliumexpansum) 實驗室從感染青霉病的蘋果果實中分離純化,回接驗證所得,于4 ℃ PDA斜面培養基中暫存;PDA培養基 配方為馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,自然pH;PDB培養基 配方為馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 L,自然pH。

霉菌培養箱BMJ-250C 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;液相色譜儀Agilent-1260 安捷倫科技有限公司;IS-RDS3恒溫振蕩器 美國精騏有限公司;旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;氮吹儀YGC-12 鄭州寶晶電子科技有限公司;光學顯微鏡BK5000-LEDR 重慶奧特光學儀器有限責任公司;高速分散機T18 basic IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化和菌懸液的制備 將擴展青霉接種到新鮮PDA斜面上,25 ℃下培養7 d后,加入無菌生理鹽水,將菌落表面的孢子刮下,用4層紗布過濾去除菌絲等雜質,用血球計數板在顯微鏡下觀測并將孢子懸浮液濃度調整至106cfu/mL。

1.2.2 孢子萌發實驗 本實驗均在經UV照射滅菌的無菌操作臺內進行。將已滅菌的PDA培養基倒入培養皿中鋪成平板,每皿15 mL,均勻涂布50 μL濃度為1×106cfu/mL的擴展青霉的孢子懸浮液,將培養皿倒置,在培養皿蓋中央放置一片直徑20 mm的已滅菌的圓形濾紙片。用移液槍移取一定體積(0.5、1.0、1.5、2.0 μL)的丁香精油于濾紙片上,使最終濃度分別為6.5、13.0、19.5、26.0 μL/L,以濾紙片上未加丁香精油的平板作為對照。迅速扣好培養皿蓋,用封口膜封好培養皿邊緣。于25 ℃,相對濕度90%的霉菌培養箱中培養9 h后,在顯微鏡下觀察,測量并計算孢子萌發率。每個處理重復3次,每次重復至少統計200個孢子。

1.2.3 含擴展青霉孢子懸浮液菌餅的制作 取一定體積的孢子懸浮液與45 ℃的PDA培養基混勻,制成含孢子濃度為105cfu/mL的培養基,混勻后倒入90 mm的無菌培養皿中,每皿10 mL,制成厚薄均勻的平板。用無菌打孔器在含菌培養基上切取得到直徑9 mm的圓形菌餅。

1.2.4 固體培養實驗 將已滅菌的PDA培養基倒入培養皿中鋪成平板,每皿15 mL,培養皿內PDA培養基凝固后,取一片9 mm菌餅置于平板中央。將培養皿倒置,在培養皿蓋中央放置一片直徑20 mm的已滅菌的圓形濾紙片。用移液槍移取一定體積(0.5、1.0、1.5、2.0 μL)的丁香精油于濾紙片上,使最終濃度分別為6.5、13.0、19.5、26.0 μL/L,以濾紙片上未加丁香精油的平板作為對照。迅速扣好培養皿蓋,用封口膜封好培養皿邊緣。于25 ℃,濕度90%的霉菌培養箱中培養,從培養第5 d開始取樣,以后每隔2 d取樣。所取樣品用十字交叉法測量菌餅直徑并計算抑菌率,抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100。用無菌水將PDA培養基上的孢子洗去后全部取出,加入15 mL無菌水,用高速分散機打碎均質,提取測量PDA培養基中的展青霉素含量。共統計5個時間點的數據,每組實驗設3個平行。

1.2.5 液體培養實驗 于無菌250 mL錐形瓶中加入40 mL PDB培養基,接入0.4 mL 1×106cfu/mL的擴展青霉孢子懸浮液,在瓶口內側固定一片直徑20 mm的滅菌濾紙片,用移液槍移取一定體積(1.44、7.22、36.10 μL)的丁香精油于濾紙片上,使最終濃度分別為5.2、26.0、130.0 μL/L,以濾紙片上未加丁香精油的錐形瓶作為對照,用封口膜封住瓶口。將錐形瓶置于25 ℃,相對濕度90%的霉菌培養箱中靜置培養。從培養第5 d開始取樣,以后每隔2 d取樣。所取樣品抽濾后,收集菌體,于60 ℃下烘干至恒重,稱重。量取5 mL抽濾所得濾液,在濾液中加入15 mL無菌水,混勻,用于提取測量展青霉素含量。共統計5個時間點的數據,每組實驗設3個平行。

1.2.6 活體培養實驗 挑選成熟期的紅富士蘋果(MaluspumilaMil),要求外觀整齊、大小均勻、無病蟲害和機械損傷。用2%的次氯酸鈉溶液消毒晾干后,在無菌條件下,用打孔器在蘋果的橫徑上對稱地打2個直徑4 mm,深4 mm的洞,接入0. 15 mL的1×106cfu/mL的孢子懸浮液。果實晾干后放在330 mm×240 mm×100 mm塑料筐中,用移液槍移取一定體積(178.9、1789.1 μL)的丁香精油于無菌濾紙片上,將該濾紙片迅速放入筐中(勿直接接觸蘋果),以濾紙片上未加丁香精油的筐作為對照。立即用保鮮膜密封塑料筐,使最終濃度為26.0、260.0 μL/L。置于25 ℃,相對濕度90%的霉菌培養箱中培養。每個處理重復3次,每次10個蘋果。從培養第3 d開始取樣,以后每隔2 d取樣。每次所取樣品測量蘋果病斑直徑,將蘋果腐爛病斑部位挖出,加入15 mL無菌水,用高速分散機打碎,用于提取測量展青霉素含量。共統計4個時間點的數據,每組實驗設3個平行。

表1 固體培養方式下不同濃度丁香精油對擴展青霉菌絲擴展的抑制率(%)

1.2.7 展青霉素測定方法 將各組取出的待測樣品置于錐形瓶中,加入20 mL乙酸乙酯震蕩提取1 h,靜置分層后,收集上層有機相。重復提取3次,合并3次提取收集的有機相,加入10 mL 1.5%的Na2CO3溶液,震蕩1 min,靜置分層后,再用10 mL的乙酸乙酯對碳酸鈉水層提取一次,合并乙酸乙酯提取液于150 mL梨形蒸發瓶中。于40 ℃水浴上旋轉蒸發至1～2 mL,將濃縮液移至離心管中,于40 ℃氮氣吹干,以1.0 mL pH4.0的乙酸鹽緩沖液溶解殘留物,經0.45 μm濾膜過濾后,供高效液相色譜測定。測定條件:色譜柱,Agilent SB-C18柱,250 mm×4.6 mm,粒徑5 μm;流動相,乙腈-水(10∶90 v/v);流速,1.0 mL/min;柱溫,30 ℃;檢測波長,276 nm;進樣量,20 μL。

1.3 統計分析

所有數據采用SPSS(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進行統計。實驗數據通過ANOVA進行鄧肯式多重差異分析。當p<0.05 時,即表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的丁香精油對擴展青霉孢子萌發的影響

如圖1所示,不同濃度丁香精油對擴展青霉孢子都有抑制效果,抑制作用具有濃度依賴性,高濃度組的抑制效果優于低濃度組。在培養9 h后,對照組(CK)的孢子萌發率已達到93.2%,此時丁香精油濃度最小的6.5 μL/L組的孢子萌發率已低至52.8%,而丁香精油濃度為26.0 μL/L組的孢子萌發率僅為9.9%。

圖1 不同濃度丁香精油熏蒸對擴展青霉孢子萌發的影響Fig.1 Effect of clove oil with different concentrations on spore germination of P. expansum

2.2 固體培養方式下丁香精油對擴展青霉生長和產毒的影響

如表1所示,不同濃度丁香精油對擴展青霉孢子都具有一定程度的抑制效果,其抑制作用具有濃度依賴性,抑制作用隨著濃度的升高而加強。并且隨著培養天數的增加,抑制率不斷降低。丁香精油供試濃度最低的6.5 μL/L組抑制效果最差,當培養至11～13 d時,抑制率出現負數,說明此時丁香精油幾乎沒有抑制效果,甚至表現出對擴展青霉生長的輕微促進作用。丁香精油濃度為26.0 μL/L的處理組抑制效果最佳,從培養第5 d直到第13 d,抑制率始終高于其他組別。

由圖2可以看出,隨著培養時間的延長,各組的PDA培養基中展青霉素含量均有不同程度的增加。CK、6.5 μL/L、19.5 μL/L這三組的毒素含量隨天數變化的趨勢相似,均為5～11 d毒素含量增加,培養至第11 d達到峰值,11～13 d毒素含量顯著下降。其中,6.5 μL/L組中毒素含量在5～11 d的培養過程中均高于對照組,19.5 μL/L組中毒素含量在5～9 d低于對照組,于第11 d超過對照組。13.0 μL/L組可以看到毒素含量有一個從升高到降低的變化趨勢,但具體的變化過程并不明確。僅丁香精油濃度最高的26.0 μL/L組在5～13 d的培養過程中,雖毒素含量隨著時間延長逐步升高,但始終低于對照組。

圖2 固體培養方式下不同濃度丁香精油熏蒸對展青霉素含量的影響Fig.2 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin in solid medium

由固體培養實驗可以得出,丁香精油濃度為 26.0 μL/L的處理組對擴展青霉菌絲生長和毒素分泌的抑制程度均明顯高于其他組別。低于該濃度的丁香精油處理組對擴展青霉的菌絲生長也起到一定的抑制作用,但對展青霉素分泌的抑制作用較差,甚至在培養到一定時間后,促進了毒素分泌。

2.3 液體培養方式下丁香精油對擴展青霉生長和產毒的影響

由圖3可以看出,較低濃度(5.2 μL/L)丁香精油熏蒸對擴展青霉菌體生長沒有明顯作用。而較高濃度的另外兩組對擴展青霉菌體生長有明顯的抑制作用,且抑制作用隨丁香精油濃度升高而增強。濃度最高的130.0 μL/L組菌體生長量極少,并且不隨培養時間延長而表現明顯差異。

圖3 液體培養方式下不同濃度丁香精油熏蒸對擴展青霉菌體生長的影響Fig.3 Effect of clove oil with different concentrations on the mycelial growth of P. expansum in liquid medium

液體培養方式下的展青霉素產量與固體培養方式下有很大區別。其中丁香精油濃度為26.0 μL/L的處理組顯著促進了展青霉素的分泌,而另外兩個處理組(濃度分別高于和低于26.0 μL/L)均抑制了毒素的分泌。其中,低濃度的5.2 μL/L組對展青霉素的分泌有一定的抑制作用;高濃度的130.0 μL/L組抑制毒素分泌量的效果十分明顯(圖4)。Garcia等[8]的研究表明,通過強烈抑制菌體生長來阻止菌體分泌次級代謝產物是一種阻止毒素積累的方法。所以本實驗中高濃度組可能是因為強烈抑制了菌體生長而導致的產毒量降低。

圖4 液體培養方式下不同濃度丁香精油熏蒸對展青霉素含量的影響Fig.4 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin in liquid medium

2.4 活體培養中丁香精油對擴展青霉生長和產毒的影響

如圖5所示,隨著培養時間延長,各組蘋果的病斑直徑逐漸擴大,5 d以內丁香精油處理組對病斑擴展有一定的抑制作用。而7～9 d的培養結果顯示,處理組的病斑直徑與對照組無顯著差異?？赡艿脑蚴请S著培養時間延長,丁香精油揮發損失,導致筐內丁香精油濃度降低,從而抑菌效果減弱。

圖5 不同濃度丁香精油熏蒸對蘋果病斑直徑的影響Fig.5 Effect of clove oil with different concentrations on lesion diameter of apple注:不同小寫字母代表同天不同處理間差異顯著(p<0.05)，圖6同。

如圖6所示,較低濃度的處理組對展青霉素的分泌量沒有明顯的作用。高濃度組在3～5 d培養過程中可以顯著地抑制毒素的分泌,毒素幾乎無法檢出,5 d后對擴展青霉的抑制作用減弱,毒素含量迅速增多?；铙w實驗中起丁香精油發揮抑菌作用的濃度高于離體實驗,可能是由于活體實驗中培養環境復雜,干擾因素增多,丁香精油中的主要抑菌成分與蘋果中的其他成分相互作用,減弱了抑制產毒的效果。

圖6 不同濃度丁香精油熏蒸對蘋果上展青霉素分泌量的影響Fig.6 Effect of clove oil with different concentrations on the content of patulin from apple

3 討論與結論

離體實驗結果表明,丁香精油的熏蒸處理對抑制擴展青霉的孢子萌發和菌體生長具有良好的效果,并且隨著丁香精油濃度升高而抑制效果增強。之前的研究表明大蒜精油、百里香精油、薰衣草精油也可抑制擴展青霉的孢子萌發[9],這一點上丁香精油的作用效果與其他精油類物質一致。而丁香精油的熏蒸處理對展青霉素的分泌表現出了不同的影響作用。同一丁香精油濃度下,固體培養中擴展青霉的產毒量顯著降低,展青霉素的分泌受到強烈抑制;液體培養中,該濃度的丁香精油熏蒸促進了展青霉素的分泌,并隨著培養時間的延長毒素產量增多。但當丁香精油濃度提高5倍后,其對展青霉素的分泌也起到了很好的抑制作用。在其他抑菌劑的研究中也存在這種抑菌劑對菌體生長和產毒作用效果不一致的情況。Mossini等[10]研究發現槲皮素可抑制擴展青霉的產毒,但不一致菌體的生長。另有研究表明小豆蔻可減緩黃曲霉的生長但不影響黃曲霉素G1的分泌量[11]。

在活體實驗中,丁香精油熏蒸的作用結果與離體培養存在一定差異。在3～5 d的培養過程中,丁香精油對蘋果病斑擴展和毒素分泌均有較好的抑制效果,但在培養時間5 d后,效果顯著降低?；铙w實驗中抑菌劑效力降低的情況也在抑菌實驗中出現。Feng等[12]研究了肉桂精油對櫻桃番茄中鏈格孢病害的抑制作用,在固體培養基中肉桂精油可強烈抑制菌體生長,但在櫻桃番茄上用同一濃度的肉桂精油處理時抑制強度有一定程度的降低。Davidson等[13]認為在玉米上有多種因素可影響抑菌劑效力,如脂質可降低起主要抑菌作用的疏水化合物活性,蛋白質可與抑菌劑中某些成分結合。

通過比較菌體生長和毒素分泌這兩個測定指標發現,當丁香精油熏蒸抑制菌體生長時,對擴展青霉分泌量的影響是不一樣的,根據培養方式和丁香精油濃度的不同,存在促進分泌和抑制分泌兩種結果。有研究表明[14],逆境可能促使微生物傾向于合成更多的次級代謝產物。本實驗中造成促進毒素分泌結果的可能原因是:特定濃度的丁香精油熏蒸造成了一個逆境環境,從而促使擴展青霉分泌更多的次級代謝產物,即展青霉素。以往的研究中往往只注重丁香精油處理對菌的生長和果實品質的影響,但忽略了對毒素分泌的影響,而擴展青霉在果實中的存在會比腐爛本身對人類造成更為嚴重的危害。研究結果說明,不僅需要開展抑菌劑對擴展青霉的抑菌效果的評價,還應重視抑菌劑對毒素分泌的影響。目前已有人將丁香精油與大蒜精油、肉桂精油、殼聚糖等配合使用[15-17],并取得了較好的抑菌效果。所以在實際應用中應注意調整丁香精油的添加量,并可以采用與其他物質復配的方法,在抑制擴展青霉菌體生長的同時,有效抑制展青霉素的分泌。

本研究表明,在一定濃度下,丁香精油對擴展青霉的生長和產毒均具有一定的抑制作用,在不同培養方式下,同一濃度丁香精油處理均表現出抑制擴展青霉生長的作用,但對展青霉素分泌量上的影響作用不同,在固體培養中抑制產毒,在液體培養和活體實驗中促進產毒。因此,對丁香精油的抑菌性進行評價時,應在考慮其對擴展青霉生長影響的同時,重視其對毒素分泌的影響。該研究可為丁香油作為抑菌劑開發提供重要的理論依據。

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Effect of clove oil on the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin

LUO Man,JIANG La,CHEN Cheng-hua,LI Yang,MENG Xiang-hong*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to evaluate the antibacterial effect of clove oil in a comprehensive and reasonable way,effects of clove oil with different concentrations on the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin were investigatedinvitroandinvivo. The results showed that 26.0 μL/L clove oil had obvious inhibitory effects on spore germination,the growth ofPenicilliumexpansumand the production of patulin in solid medium. However,treatment of clove oil at the same concentration promoted the production of patulin in liquid medium andinvivounless improving the content of clove oil to 130 μL/L. This study indicated that the effect of clove oil on the production of patulin needed to be considered in order to obtain the antibacterial effect and food safety.

clove oil;Penicilliumexpansum;growth;patulin

2015-01-13

羅曼(1989-)，女，碩士，主要從事天然防腐保鮮劑的研究，E-mail：102384577@qq.com。

*通訊作者:孟祥紅(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物化學，E-mail：mengxh@ouc.edu.cn。

國家科技計劃課題(2012AA101607);國家自然科學基金(31171762)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)21-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.025