基于宏基因組分析四川泡菜母水作引子的泡菜發酵過程中細菌多樣性變化

佟婷婷,田豐偉,王 剛,劉小鳴,張 灝,陳 衛

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

基于宏基因組分析四川泡菜母水作引子的泡菜發酵過程中細菌多樣性變化

佟婷婷,田豐偉,王 剛,劉小鳴,張 灝,陳 衛*

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

本文旨在研究以泡菜母水作引子的蔬菜發酵過程中細菌多樣性變化,并對泡菜質量控制和泡菜中功能性細菌資源開發提供理論支持。采集發酵過程中不同發酵時間的樣品,提取基因組,PCR擴增16S rRNA的V3+V4區并進行Illumina高通量測序,通過生物信息學分析比較發酵不同時間細菌多樣性。結果表明:以老壇水作引子的發酵過程中發酵啟動時魏斯氏菌屬可達到74.5%,而之后則在10%左右,取而代之成為優勢菌的是乳桿菌屬,含量達到80%～85%。說明泡菜發酵中啟動菌為魏斯氏菌屬,發酵的關鍵菌為乳桿菌屬,同時表明四川泡菜是優良的微生物資源,可用于魏斯氏菌屬,乳桿菌屬,乳球菌屬,片球菌屬和明串珠菌屬等益生菌的分離和篩選。

宏基因組,泡菜,母水引子,發酵過程,細菌多樣性

泡菜是中國的傳統發酵蔬菜的代表,其中又以四川泡菜最為著名,是以新鮮蔬菜為原料,添加泡菜鹽、水和調味料,利用蔬菜自身附著的微生物或添加乳酸菌發酵劑,自然發酵而成具有獨特風味的食品[1]。近年來,四川泡菜作為優秀的菌種資源受到越來越多人的關注,尤其是從中篩選出的優良乳酸菌,具有很多特殊功能,如董玲等從四川泡菜中篩選出了2株產γ-氨基丁酸的短乳桿菌[3],楊婧等則從四川泡菜中獲得了一株對細菌和產璞酵母均有良好抑制作用的植物乳桿菌[4],而汪紅等從四川泡菜中分離出了一株產酸能力強,生長速度快的乳酸乳球菌[5]。

長期以來,人們主要采取的是傳統的菌種篩選方法,隨著分子生物學技術的發展,使得從基因角度全面分析環境中的微生物多樣性成為可能,而對泡菜中微生物深入的研究有助于更好地利用泡菜資源。田偉[6]等人通過16S rRNA的方法分析了四川泡菜中的細菌多樣性,陳功等[7]采用DGGE的方法測定了泡菜中的細菌多樣性。宏基因組作為目前分析環境中微生物多樣性最有效的方法,在土壤[8]、人類腸道[9]、海水[10]的微生物多樣性研究中都有很好的應用,能夠對復雜環境中的微生物組成進行有效分析并對不同樣品的進化關系探究,而在泡菜中應用極少。本文為了探究四川泡菜發酵過程中細菌的多樣性及其變化,特采用宏基因組的方法,以求對四川泡菜發酵過程有更全面的認識,同時為篩選優良菌株提供參考。

表1 16S rRNA V3+V4區基因片段擴增的PCR反應體系

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜母水 四川省內江市一戶農家的老壇(該泡菜采用傳統方法泡制且品質符合當地農戶對優良泡菜的判定);泡菜鹽和花椒等調料 內江菜市場;白蘿卜、胡蘿卜 無錫雪浪菜市場;DNA提取試劑盒Fast DNA SPIN Kit for soil MP Biomedicals LLC公司;PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase TransGen公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 AXYGEN公司;建庫試劑盒 TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)和上機試劑盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003) Illumination公司。

Miseq測序儀 Illumina公司;Geldoc 2000凝膠成像系統和PowerPac核酸電泳儀 Bio-Rad公司;PCR儀GeneAmp? 9700型 ABI公司;QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統 Promega公司;Nano Drop2000微量分光光度計 Thermo Scientific公司;MS3旋渦混合器 德國IKA公司;Minispin離心機 Eppendorf公司;SCIENTZ-09無菌均質機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 以四川泡菜母水作引子泡菜制備 本實驗的泡菜制作模擬傳統四川泡菜制作過程,將5 L的泡菜壇用100 ℃水沖洗后,紫外照射下晾干,用泡菜鹽和自來水配成濃度為4%的鹽水2.5 L,煮沸5 min后冷卻至室溫入壇,向壇中加入500 mL泡菜母水,50?；ń泛?0個鮮辣椒,攪勻;新鮮的白蘿卜、胡蘿卜去皮,切成2 cm×2 cm×10 cm的蔬菜條,入壇至液面高度距壇口5 cm;蓋上蓋子,在壇沿加上淡鹽水,將泡菜壇置于陰涼處自然發酵。

在第0、1、3、7、16、20 d分別從泡菜壇中取樣,共6個樣品,分別記作0、1、3、7、16、20 d。樣品的處理方式為:將泡制后蔬菜剪碎后與泡菜液一起放入無菌均質袋中,在6檔下均質1 min,之后8層無菌紗布過濾取出蔬菜殘渣,再將濾液4 ℃,10000 r/min下離心10 min獲得菌體,置于-80 ℃冰箱中保存待進一步實驗。

1.2.2 泡菜微生物的提取與檢測 由于泡菜菌體中會混有蔬菜殘渣和調料殘渣等,屬于復雜的環境體系,故采用QIAGEN糞便基因組提取試劑盒提取樣本總DNA,具體操作步驟參照說明書。提取的總DNA經Nanodrop2000微量分光光度計測定純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[11-12]。

1.2.3 16S rRNA V3+V4區基因片段的擴增及Illumina測序 對于6個樣品,由提取的基因組直接擴增V3+V4區基因片段,使用的引物為338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應體系見表1。

PCR條件為:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環;72 ℃最終延伸10 min,10 ℃ 保溫。每個樣品3個重復,將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物,Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測[13-14]。

參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量,之后按照每個樣品的測序量要求,進行相應比例的混合。之后用試劑盒TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(FC-122001)進行Miseq文庫構建:連接“Y”字形接頭;使用磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR擴增進行文庫模板的富集;氫氧化鈉變性,產生單鏈DNA片段。

針對已構建文庫,用試劑盒MiSeq Reagent Kit v2,500 Cycles(Catalog # MS-102003)進行Miseq測序:DNA片段的一段與引物堿基互補,固定在芯片上;另一端隨機與附近的另外一個引物互補,也被固定住,形成“橋(bridge)”;PCR擴增,產生DNA簇;DNA擴增子線性化成為單鏈;加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP,每次循環只合成一個堿基;用激光掃描反應板表面,讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類;將“熒光基團”和“終止基團”化學切割,恢復3′端粘性,繼續聚合第二個核苷酸;統計每輪收集到的熒光信號結果,獲知模板DNA片段的序列。

1.2.4 生物信息學分析 Miseq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,舍棄低質量序列,所得片段大小平均長度為447.31 bp,接近目標片段。區分樣品后在97%的相似水平下對OTU(Operational Taxonomic Unit,操作分類單元)進行聚類分析,檢測 PCR 擴增中產生的嵌合體序列并從OTU中去除,使用usearch_global方法將優化序列 map比對回OTU代表序列,得到OTU各樣品序列豐度統計表[15-16]。

采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,在門和屬水平統計每個樣品的群落組成。進一步對微生物測序進行深度分析,繪制稀釋性曲線(Rarefaction curve)、Shannon-Wiener曲線;對樣品的Chao,Ace,Shannon,Simpson指數進行計算,分析細菌群落豐度和多樣性;基于細菌群落的組成,在門和屬兩個分類水平上研究發酵過程中細菌組成和多樣性的變化[17]。

2 結果與分析

2.1 樣品基因組,OTUs,序列數目分布和測序深度分析

分別對6個樣品的總基因組進行提取,并針對16S rRNA V3+V4區基因片段進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。將PCR產物利用高通量Illumina Miseq平臺測序,統計得到的序列數目,并在97%的相似水平下進行歸類操作得到OTU數,見表2。對測得的序列進行分析,隨機對測序所得序列抽樣,以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線,見圖2。當曲線趨于平坦時,說明測序數據量合理,更多的數據量只會產生少量新的OTU;反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。

圖1 6個樣品基因組PCR產物電泳檢測Fig.1 PCR products of Genom of 6 Samples注:1,2,3,4,5,6分別代表0,1,3,7,16,20 d;DL2000為DNA分子量標準。

由圖1可知,6個樣品對應的位置都有清晰的條帶,證明PCR 產物目的條帶大小正確,濃度合適,為后續實驗的準確性提供了保障。

表2 6個樣品高通量測序數據

由表2可知,6個樣品獲得的序列數在15400到26100的范圍內,在97%的相似水平下對序列進行歸類操作,獲得的OUT數在14300到25000的范圍內?？傮w上看,除去1 d,發酵后期的序列數和OUT數高于發酵前期。

由圖2可知,對于6個樣品而言,隨著抽取序列數量的增加,它們所代表的OTU數先增加后基本保持不變,即隨著測序深度增加,曲線斜率減小,最終趨于平緩,說明測序深度能夠較準確地反映泡菜樣品的豐富度和多樣性。

圖2 6個樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction Curve of 6 samples

2.2 泡菜發酵過程中不同時間點取樣品的細菌多樣性分析

針對獲得的OTU,利用一系列統計學分析指數可以估計環境群落的物種豐度和多樣性,單樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)包括菌群豐度指數chao1和ace,菌群多樣性指數simpson和shannon,統計結果見表3。其中,chao1用來估計物種總數,ace可估計群落中OTU數目,simpson和shannon用于估算為生物多樣性,simpson越大多樣性越低,而shannon越大多樣性越高[18]。

表3 菌群多樣性指數

由表3可得,simpson越大多樣性越低,則多樣性由低到高為3,20,1,7,16,0 d;而根據shannon越大多樣性越高,則多樣性由低到高為3,1,20,7,16,0 d。由此可看出泡菜發酵過程中微生物多樣性是變化著的,不是簡單的越來越豐富或越來越單一,發酵開始是細菌多樣性最高,發酵初期出現細菌多樣性下降,到發酵后期又有一定上升。

2.3 泡菜發酵過程中細菌組成在門水平上的變化

為了得到每個OTU對應的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并在門水平(phylum)統計每個樣品的群落組成。使用的比對數據庫Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)。根據各個樣品不同門微生物所占比例進行作圖,在一個樣品中某一門的微生物所占的比例即為其相對豐富度,作圖時將相對豐富度低于1%的部分合并為其他在圖中顯示,結果見圖3。

圖3 6個樣品在門的水平上細菌組成Fig.3 The composition of the samples of bacteria at phylum

由圖3中可以看出,在泡菜發酵過程中細菌主要來自厚壁菌門(Firmicutes),藍藻菌門(Cyanobacteria)和變形菌門(Proteobacteria),其中厚壁菌門所占比例具有絕對優勢。由圖3分析可知,總體上隨著發酵進行,厚壁菌門含量也有升高的趨勢,而藍藻菌門和變形菌門所占比例分別在一定程度上下降。

2.4 泡菜發酵過程中細菌組成在屬水平上的變化

為了得到每個OTU對應的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對 97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并在屬水平(genus)統計每個樣品的群落組成。采用數據庫Silva(Release115 http://www.arb-silva.de)進行比對。根據各個樣品不同屬微生物所占比例進行作圖,作圖時將相對豐富度低于1%的部分合并為其他在圖中顯示,結果見圖4。

圖4 6個樣品在屬的水平上細菌組成Fig.4 The composition of the samples of bacteria at genus

由圖4中可以看出,在屬的水平上,泡菜發酵過程中細菌主要屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),魏斯氏菌屬(Weissella),乳球菌屬(Lactococcus),片球菌屬(Pediococcus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)。通過比較發現,除了1 d中魏斯氏菌屬含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均為乳桿菌屬。在整個發酵過程中,乳桿菌屬整體上的趨勢為含量先下降后上升,0 d時為75.6%,1 d時為18.0%,之后的含量在80%～85%之間;魏斯氏菌屬0 d幾乎沒有,1 d時含量達到74.5%,之后保持在10%左右;乳球菌屬在0 d時占5.3%,在之后的發酵過程中則幾乎沒有;片球菌屬含量在發酵過程中在1%～7%之間變動,且無明顯規律;明串珠菌屬在0 d時占4.2%,在之后的發酵過程中幾乎沒有。由以上規律可推測,泡菜發酵過程中起主導作用的是乳桿菌屬;在發酵初期作用顯著的是魏斯氏菌屬,該菌屬在韓國泡菜kimchi中有所報道并且是主要微生物[19];隨著發酵進行一些菌屬所占的比例從不到6%降到極低,如乳球菌屬和明串珠菌屬,它們對泡菜的發酵是否起到作用有待進一步探索。魏斯氏菌屬在此發酵過程中起到了啟動菌的作用,這與一些文獻中報道的啟動菌是明串珠菌屬[20]不符,分析原因可能是此類報道大多參考的是Pederson[21]在1930年時的研究,而魏斯氏菌屬與明串珠菌和乳桿菌很相似[22],在1993年時Collins[23]等人根據細菌的16S rRNA將副腸系膜樣明串珠菌屬(Leuconostoc paramesenteroides)和相關菌重新分類,形成了魏斯氏菌屬(Weissella),因此在這之前的研究可能鑒于當時分類水平的限制并沒有進行正確的鑒定;同時也有可能是研究對象和條件不同造成差異,如Eom等人的研究選用明串珠菌作為韓國泡菜kimchi的啟動菌[24-25]。魏斯氏菌屬作為啟動菌還有待進一步研究。

3 結論

本研究利用Illumina高通量測序獲得16S rRNA的V3+V4可變區序列,基于該分子標志鑒定泡菜的細菌種類,說明V3+V4序列在泡菜細菌的分類中解析度良好。通過測序及生物信息學分析,可得出如下結論:在泡菜發酵過程中,微生物多樣性是變化著的,而不是簡單的越來越豐富或越來越單一。在門的水平上看,泡菜發酵過程中細菌主要來自厚壁菌門,藍藻菌門和變形菌門,其中厚壁菌門所占比例具有絕對優勢。在屬的水平上,泡菜發酵過程中細菌主要屬于乳桿菌屬,魏斯氏菌屬,乳球菌屬,片球菌屬和明串珠菌屬。除了1 d中魏斯氏菌屬含量最高外,0、3、7、16、20 d中占比最高的均為乳桿菌屬。因此欲從發酵蔬菜中分離得魏斯氏菌屬,則可對發酵初期的發酵液進行微生物分離篩選,同時可推測魏斯氏菌屬是在蔬菜發酵的啟動中起重要作用。發酵后期的發酵液則是乳桿菌屬微生物的優良來源。隨著發酵進行含量降到極低的乳球菌屬和明串珠菌屬可能因為不適合發酵后期的環境而受到抑制。本文僅分析了發酵過程中不同階段的細菌多樣性組成,而不同菌屬具體如何作用需要代謝組學進一步探索。

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Metagenomic analysis of bacterial diversity changes during vegetables fermentation using Sichuan pickle water as starter

TONG Ting-ting,TIAN Feng-wei,WANG Gang,LIU Xiao-ming,ZHANG Hao,CHEN Wei*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The purpose of the present study was to investigate the bacterial diversity in Sichuan pickles during the fermentation started by mother water starter,in order to provide support for the quality control and functional bacterial screening in pickles. Samples during the fermentation were collected for genome extraction,and the V3+V4 parts of 16S rRNA of each sample’s genome were amplified by PCR. The samples were then sequenced by Illumina miseqsequencing system. Bioinformatics was finally analyzed to compare bacterial deversity of the samples. The results showed that,the abundance of Weissella was 74.5% at the beginning of the fermentation but then decreased and remained stable at about 10%. After the start of the fermentation,the Lactobacillus strains took place to be the dominationated bacteria,with a content of 80%～85%. These results indicated that during the fermentation,Weissella was the starter culture and Lactobacilli dominated the fermentation process afterwards. It can be concluded that Sichuan pickles were proved to be excellent microbial resources for the collection of probiotics including Weissella,Lactobacillus,Lactococcus,Pediococcus and Leuconostoc strains.

Metagenome;pickled vegetables;mother water starter;fermentation process;bacterial diversity

2015-01-23

佟婷婷(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術,E-mail:tongtt2015@163.com。

*通訊作者:陳衛(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術,E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國家科技支撐計劃(2013BAD18B01)；國家自然科學基金(31371721)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.027